Olomoucine在匹羅卡品所致顳葉癲中的作用及機制的研究

殷亞萍 劉希金 楊志勇 鄧學軍

細胞周期依賴激酶（CDK）是一組在細胞周期調控中起著關鍵作用的蛋白激酶［1，2］，這些激酶的抑制劑在許多病理過程起著重要的作用，比如腫瘤、腎小球腎炎、增生、神經變性等［3］。Olomoucine是一種嘌呤衍生物，也是一種細胞周期依賴激酶抑制劑，它能夠通過抑制ATP與CDK的結合降低CDK1、CDK2、CDK5 的 活 性［4，5］。King and Cidlowski提出olomoucine使細胞周期停止于G1期與S期之間及G2期與M期之間，抑制了細胞的分裂和增生，同時不影響靜止期的細胞。這使細胞周期依賴激酶抑制劑產生了一定臨床應用價值。癲是一種常見的中樞神經系統（CNS）疾病并長期困擾著人類的健康，在癇間性發作之后膠質細胞增生，膠質纖維酸性蛋白（GFAP）大量表達，這成為癲的一個重要的病理過程［6，7］。星形膠質細胞增生導致腺苷激酶（ADK）大量表達，在癲持續狀態后星形膠質細胞大量表達，星形膠質細胞中ADK表達顯著性增加并持續至少3～4個月［8］，ADK又進一步調節突觸間隙腦內源性止癇間劑及神經元保護劑腺苷［9，10］，使得腺 苷 分 解 增 加，癇間 性 發 作 惡 化［11］。除了在動物實驗中得到此項結果外，在顳葉癲患者顳葉皮質中同樣發現了腺苷激酶的大量表達。以往的實驗已證實了對細胞周期依賴激酶的抑制能減少大鼠缺血區及海馬CA1區星形膠質細胞的增生及神經元的死亡［12］；能抑制膠質瘢痕的形成，減少神經元損傷及死亡；能夠促進動物創傷模型認知功能的改善和運動功能的恢復［13，14］。因此，本研究假設是否能夠通過調節星形膠質細胞的增生及后續ADK的過度表達來改善癲患者的癇間性發作，減輕癲患者的腦損傷。以往對癲的研究主要集中于離子通道，近年來越來越多關于星形膠質細胞的功能異常的研究給我們帶來了新的提示。然而對于細胞周期的干預與癲的關系我們尚不清楚，本實驗采用大鼠氯化鋰－匹羅卡品（Licl-Pilocarpine）所致顳葉癲模型，并用olomoucine抑制星形膠質細胞的增生，以探討細胞周期依賴激酶（CDK）抑制劑在氯化鋰－匹羅卡品（Licl-Pilocarpine）所致顳葉癲大鼠癇間性發作中的作用及其相關機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性Sprague-Dawley大鼠（由華中科技大學同濟經醫院實驗動物中心提供），體重200～250 g（n＝140只），在標準的實驗環境中飼養（光照12 h、氣溫21～22℃、濕度50%）。

1.2 實驗試劑 氯化鋰 （Sigma-Aldrich，USA），匹羅卡品 （Sigma-Aldrich，USA）；地西泮（津藥、中國天津）、olomoucine（Axxora USA），10% 水合氯醛（中國武漢協和醫院），氯化鋰和匹羅卡品溶解于生理鹽水中。Olomoucine首先溶解于無水酒精中，之后用雙蒸水稀釋，用于實驗的最終濃度為1 mg／ml。兔抗-ADK （1∶50in PBS中國北京博奧森生物技術有限公司），GFAP多克隆抗體 （1∶50 in PBS ProteinTech Group，Inc，USA）.

1.3 模型制備 健康雄性SD大鼠140只，隨機選出10只作為正常組，另外130只接受氯化鋰－匹羅卡品腹腔注射進行造模。分別腹腔注射氯化鋰125 mg／kg，18 h后腹腔注射硫酸阿托品1 mg／kg，30 min后腹腔注射鹽酸匹羅卡品15 mg／kg，每30 min注射1次，直至大鼠出現癲持續狀態，最多注射4次。癲持續狀態持續1 h后給予安定10 mg／kg終止發作。發作程度按照Racine標準進行分級，達到四級以上并出現癲持續狀態者納入實驗。出現癲持續狀態的大鼠在經歷24 h急性期后進入潛伏期，單籠飼養。

1.5 行為學觀察 所觀察的行為學數據包括潛伏期、發作頻率、病死率。在藥物干預后對各組大鼠進行視頻監測，24 h／d，至實驗終止。

1.6 腦電監測 迄今為止，皮層腦電圖是應用更多的一種腦電監測方式，而本實驗采用的是頭皮電極腦電圖，雖然皮層電極有著更高的準確度，但是對實驗動物的創傷較大。另外，已有實驗證實頭皮腦電圖與皮層腦電圖所記錄的波形相似［15］，并且大鼠麻醉所使用的水合氯醛對腦電波形影響較小。實驗大鼠用10%水合氯醛麻醉（3 mg／kg），麻醉后固定于實驗臺，用兩根銀針作為電極置于大鼠頭皮下（兩外耳連線前0.9 cm，中線兩側1.1 cm），參考電極置于前額極（外眥連線中點）。在進入慢性自發性發作階段后對大鼠進行腦電監測（2小時／次，3次／周），記錄腦電波形及棘波發放（SWDs）頻率。

1.7 患者篩選 在協和醫院和新華醫院（武漢）篩選出18位患者的腦組織標本，其中12位（6男6女，18～46歲）為耐藥癲患者，作為實驗組，篩選標準如下：對丙戊酸鈉、卡馬西平、托吡酯、苯妥英鈉、拉莫三嗪、奧卡西平等抗癲藥物長期耐藥；術前已完善腦電圖、CT、MRI等檢查。6位（4男2女，20～45歲）為正常腦外傷患者，作為對照組，篩選標準如下：無抗癲藥物接觸史，無腫瘤、皮質發育不良及血管畸形。

1.8 免疫組化 免疫組化染色采用SABC法，DAB顯色，蘇木精復染。石蠟切片常規脫蠟至水并修復抗原（PH6.0的枸櫞酸緩沖液熱修復）后用0.01M PBS漂洗5 min×3，次入0.3%過氧化氫水溶液15 min封閉內源性過氧化物酶活性，山羊血清室溫封閉20 min，滴加稀釋的一抗，4℃溫盒內過夜，其后步驟按試劑說明書進行。用PBS代替一抗作陰性對照。每張切片在同一放大倍數（×400倍）、同一光強度下拍攝，經灰度調節后用Image－Pro Plus6.0測量切片上陽性反應物的平均光密度值。用平均光密度值表示陽性顆粒表達強度。

1.9 統計學處理 本實驗所有數據（除行為學數據之外）用±s表示，采用SPSS17.0統計軟件。腦電圖表現及大鼠ADK、GFAP免疫組化分析采用單因素方差分析和 LSD-t檢驗（方差齊），Dunnett’s-t檢驗（方差不齊）；人ADK免疫組化分析采用獨立樣本t檢驗；行為學數據采用非參數檢驗；P＜0.05為有顯著性差異。

2 結 果

2.1 行為學表現 匹羅卡品應用后約30 min，大鼠開始出現癲持續狀態（SE），即前爪陣攣、身體僵直后肢站立、跌倒。130只接受氯化鋰－匹羅卡品腹腔注射的大鼠，95只（73.08%）出現SE，其中22只（23.16%）在出現SE后死亡，73只存活。在存活的75只大鼠中模型組的25只在視頻監測過程中有2只死亡，18只出現了慢性自發性發作（SRS），潛伏期中位數為25 d，發作頻率中位數為2.0／5 d；干預組的25只大鼠有3只在視頻監測過程中死亡，13只出現了SRS，潛伏期中位數為30 d，發作頻率中位數為1.02／5 d；對照組23只大鼠有3只在視頻監測過程中死亡，17只出現了慢性自發性發作，潛伏期中位數為25 d，發作頻率中位數為1.99／5 d。干預組潛伏期較模型組明顯延長（P＜0.05），發作頻率明顯降低（P＜0.05）；對照組與模型組無顯著性差異（P＞0.05）（表1）。

表1 Olomoucine干預對潛伏期及發作頻率的影響

2.2 腦電圖改變 正常大鼠頭皮腦電圖波形基本節律為8～13 Hz、20～120μV的α波，間低幅β波及少量孤立的δ波。癲大鼠出現棘波發放（SWDs 20～27 Hz，150～210μV）。在出現SRS的大鼠中模型組、干預組及對照組各有13只（72.22%），8只（61.54%），和11只 （64.71%）監測到SWDs。本實驗采用定量腦電圖對SWDs進行分析，模型組（321±59.593）waves／30 min，干預組（141.5±25.208）waves／30 min，對照組（338.64±62.5）waves／30 min。干預組較模型組棘波發放次數明顯減少（F＝35.856，P＝0.0001），對照組和模型組之間無顯著性差異（P＞0.05）（圖1）。

圖1 正常組（A）與模型組（B）腦電圖波形；Olomoucine干預后各組在慢性期的棘波發放情況（C） 干預組的棘波發放數量較模型組明顯減少（＊P＜0.05）；對照組與模型組比較無顯著性差異（P＞0.05）

2.3 Olomoucine減少了星形膠質細胞的增生及降低了ADK的表達 為了明確Olomoucine干預后是否對星形膠質細胞的增生及ADK的表達產生了影響，本實驗采用免疫組化半定量的方式進行分析，分析指標為平均光密度值。對于代表星形膠質細胞的GFAP的表達，正常組、模型組、干預組及對照組的平均光密度值分別為0.084490±0.0116697，0.130831±0.0108002，0.084100±0.011154，0.130564±0.0094126，干預組較模型組表達明顯減少（OD meanF＝63.987，P＜0.05）。對于ADK的表達，正常組、模型組、干預組及對照組的平均光密度值分別為0.12644±0.0131760，0.173315±0.0160088，0.127338±0.0173762，0.170936±0.0235768，干預組較模型組表達明顯減少（OD meanF＝21.840，P＜0.05）（圖2、3）。

圖2 各組大鼠海馬CA3區GFAP表達情況（A代表正常組；B代表模型組；C代表干預組；D代表對照組；E為統計分析圖） 干預組GFAP表達較模型組明顯減少（＊P＜0.05），對照組較模型組無顯著性差異（P＞0.05）

圖3 各組大鼠海馬CA3區ADK表達情況（A代表正常組；B代表模型組；C代表干預組；D代表對照組；E為統計分析圖） 干預組ADK表達較模型組明顯減少（＊P＜0.05）；對照組較模型組無顯著性差異（P＞0.05）

圖4 人顳葉內側ADK表達情況（A代表腦外傷患者；B代表癲患者；C為統計分析圖） 癲患者ADK的表達較腦外傷患者明顯增加（＊P＜0.05）

3 討 論

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