胰腺癌組織Shh、Gli1、Sufu、TAK1、p-TAK1蛋白的表達及其臨床意義

馬丹 滿曉華 高軍 李兆申

·論著·

胰腺癌組織Shh、Gli1、Sufu、TAK1、p-TAK1蛋白的表達及其臨床意義

馬丹 滿曉華 高軍 李兆申

目的探討Hedgehog信號通路重要成員Shh、Gli1、Sufu以及TAK1和磷酸化TAK1(p-TAK1)在胰腺癌組織中的表達及其與臨床病理參數的相關性。方法應用免疫組化法檢測38例手術切除的胰腺癌組織及其配對的癌旁胰腺組織中Shh、Gli1、Sufu、TAK1、p-TAK1蛋白的表達，分析它們與臨床病理參數間的關系及它們相互間的關系。結果胰腺癌組織Shh、Gli1、Sufu、TAK1、p-TAK1蛋白的表達率分別為86.8%(33/38)、52.6%(20/38)、68.4%(26/38)、55.3%(21/38)、52.6%(20/38),而癌旁胰腺組織中的表達均為陰性。Gli1表達與腫瘤遠處轉移及臨床分期呈正相關(r值分別為0.524、0.361，P值均<0.05)；Sufu表達與患者性別相關(r=-0.378，P<0.05)；TAK1表達與胰腺癌臨床分期呈正相關(r=0.468，P<0.05)；p-TAK1表達與臨床分期、腫瘤遠處轉移呈正相關(r值分別為0.418、0.361，P值均<0.05)。胰腺癌組織中Gli1的表達水平與TAK1及p-TAK1呈正相關(P<0.05)。結論Hedgehog信號通路及TAK1途徑在胰腺癌的發生、發展中具有一定作用，且兩條途徑可能存在一定的相互作用。

胰腺腫瘤； 免疫組織化學； Hedgehog信號通路； 絲裂原激活蛋白激酶激酶類

Hedgehog信號通路與胰腺癌的發生、發展密切相關[1]。絲裂原活化蛋白質激酶激酶激酶(MAPKKK)家族成員之一TGF-β激活激酶-1(TAK1)是炎癥免疫、應激反應及腫瘤發生等過程中許多信號轉導連鎖反應的關鍵調控因子。近年文獻報道，TAK1誘導的NF-κB激活與胰腺癌中Hedgehog通路的活化有關[2-3]。因此，本研究檢測Hedgehog通路重要成員Shh、Gli1、Sufu以及TAK1和其活化形式磷酸化TAK1(p-TAK1)在胰腺導管腺癌及相應癌旁胰腺組織中的表達，分析Hedgehog信號通路與TAK1途徑之間的關系及其與臨床病理參數的相關性，探討它們在胰腺癌發生中的作用。

材料與方法

一、標本來源

收集2010年9月1日至2012年9月11日第二軍醫大學附屬長海醫院胰腺外科手術切除的38例胰腺癌組織和配對的癌旁組織，同時收集相應病例的臨床資料。所有患者術前均未行化療和放療。術后均經病理學檢查診斷為胰腺導管腺癌。38例患者中男性23例，女性15例，年齡35～82歲，平均(60±11)歲。

二、Shh、Gli1、Sufu、TAK1、p-TAK1蛋白檢測

手術切除標本常規固定、脫水、石蠟包埋、連續切片(厚度為4 μm)，采用免疫組化EnVision染色法(二步法)檢測Shh、Gli1、Sufu、TAK1、p-TAK1蛋白的表達。兔抗人Shh單抗、Gli1多抗、Sufu單抗、TAK1多抗、p-TAK1多抗均購自Abcam公司。Shh定位于細胞膜和細胞質，Gli1、Sufu、TAK1及p-TAK1定位于細胞核和細胞質。出現棕黃色或棕褐色顆粒為陽性染色。結果判斷根據陽性細胞占總細胞數百分比以及陽性細胞染色強度。陽性細胞數≤5%為0分，>5%～≤25%為1分，>25%～≤50%為2分，>50%為3分；無著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將兩分值相乘得到最終分值，0分為-，1～2分為+，3～4分為++，6～9分為+++。++或+++定義為表達陽性， -或+定義為表達陰性。

三、統計學處理

應用SPSS18.0軟件進行統計分析。采用χ2檢驗及Fisher精確概率法分析胰腺癌組織中Shh、Gli1、Sufu、TAK1及p-TAK1表達水平之間的相關性及它們與臨床病理參數的相關性，均采用雙側檢驗，P<0.05認為差異有統計學意義。

結 果

一、胰腺癌組織Shh、Gli1、Sufu的表達

Shh陽性表達于胰腺導管腺癌癌細胞的胞膜和胞質(圖1)，陽性表達率為86.8%(33/38)，其中++ 26例，+++ 7例。Gli1、Sufu陽性表達于胰腺導管腺癌癌細胞的胞核和胞質(圖1)。Gli1陽性表達率為52.6%(20/38)，其中++ 15例，+++ 5例。Sufu陽性表達率為68.4%(26/38)，其中++ 12例，+++ 14例。癌旁胰腺組織的導管、腺泡和胰島中Shh、Gli1、Sufu的表達水平均陰性，胰腺癌組織此3種蛋白的表達均顯著高于癌旁胰腺組織(P值均<0.05)。

圖1胰腺癌組織(左)和癌旁組織(右)Shh(上)、Gli1(中)、Sufu(下)蛋白的表達(免疫組化 ×200)

二、胰腺癌組織TAK1及p-TAK1的表達

TAK1及p-TAK1陽性表達于胰腺導管腺癌癌細胞的胞核和胞質，腫瘤細胞周圍炎性細胞亦有不同程度的表達(圖2)。TAK1陽性表達率為55.3%(21/38)，其中++ 15例，+++ 6例。p-TAK1陽性表達率為52.6%(20/38)，其中++ 18例，+++ 2例。癌旁胰腺組織導管、腺泡和胰島中TAK1和p-TAK1表達陰性，胰腺癌組織TAK1及p-TAK1的表達均顯著高于癌旁胰腺組織(P值均<0.05)。

三、胰腺癌組織Shh、Gli1、Sufu、TAK1、p-TAK1表達與腫瘤臨床病理參數的關系

腫瘤臨床病理參數包括患者年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤最大徑、淋巴結轉移、遠處轉移、臨床分期等。Shh表達與所有的臨床病理參數均無關；Gli1表達僅與腫瘤遠處轉移及臨床分期呈正相關(r值分別為0.524，0.361，P值均<0.05)；Sufu表達只與患者性別相關(r=-0.378，P<0.05)；TAK1表達只與胰腺癌臨床分期呈正相關(r=0.468，P<0.05)；p-TAK1表達與臨床分期、腫瘤遠處轉移呈正相關(r值分別為0.418、0.361，P<0.05，表1)。

圖2胰腺癌組織(左)和癌旁組織(右)TAK1(上)、p-TAK1(下)的表達(免疫組化 ×200)

表1 胰腺癌組織中Shh、Gli1、Sufu、TAK1及p-TAK1表達與臨床病理參數的關系

胰腺癌組織中Gli1的表達水平與TAK1及p-TAK1呈正相關(P<0.05)，而Shh、Sufu的表達水平與TAK1、p-TAK1無相關性。此外，Shh、Gli1、Sufu三者間的表達水平均無相關性。

討 論

Hedgehog(Hh)信號通路是胚胎發育的主要調控子,其產物控制細胞分化、增殖和組織成形。Hh信號通路由配體Hh、膜受體Ptch及Smo、Sufu、COS2、核轉錄因子Gli和下游靶基因組成。成人正常組織中Hh信號通路無活化或低活化，但在胰腺癌中Hh信號通路異常激活[1]。在小鼠的發育過程中，Shh的異常表達可引起類似于人胰腺癌的早期病變[4]。在胰腺癌早期及癌前病變階段即可檢測到Hh信號通路的激活。對不同時期的胰腺上皮內瘤變及胰腺癌進行分析，發現隨著上皮內瘤變向胰腺癌的逐步發展，病變組織中Hh信號通路成員的表達水平也急劇上升。Shh、Ptch和Glil蛋白在胰腺癌組織中呈低到中度表達[5]。Sufu蛋白在胰腺癌組織中陽性表達，而在癌旁胰腺組織及正常胰腺組織中均未見表達[6]。本研究結果顯示,胰腺癌組織中Shh、Gli1、Sufu呈高表達，與文獻研究結果一致。通過與腫瘤臨床病理參數關系的分析，胰腺癌組織中Gli1的表達與腫瘤遠處轉移及臨床分期呈正相關，更進一步突出了Gli1在胰腺癌發生、發展中的作用。

TAK1是炎癥免疫、應激反應及腫瘤發生等過程中重要的信號轉導連鎖反應的關鍵調控因子。有文獻報道，TAK1通過活化NF-κB和激活蛋白-1(AP-1)參與胰腺癌對化療藥物的耐受性，沉默或抑制TAK1基因表達是逆轉胰腺癌內在耐藥性的有效方法[7]。本研究結果顯示，胰腺癌組織中TAK1及其活化形式p-TAK1均高表達，而且TAK1的表達與胰腺癌臨床分期呈正相關，p-TAK1的表達與臨床分期及胰腺癌遠處轉移均呈正相關，證實TAK1途徑亦在胰腺癌發生中起作用。TAK1通過多種形式廣泛參與NF-κB的活化。而NF-κB的直接轉錄靶點之一便是Hh通路的配體Shh[8]。某些炎性因子(如IL-1β、TNF-α等)可通過激活NF-κB導致Shh的過度表達，進而激活Hh信號通路，促進胰腺癌細胞的增殖。本研究結果顯示，胰腺癌組織中TAK1及p-TAK1的表達水平與Gli1存在相關性，亦提示在胰腺癌發展過程中兩條途徑可能存在協同作用，但其機制有待于進一步研究。

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ExpressionandclinicalsignificanceofShh,Gli1,Sufu,TAK1,p-TAK1proteininpancreaticcarcinoma

MADan,MANXiao-hua,GAOJun,LIZhao-shen.

DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

Correspondingauthor:LIZhao-shen.Email:Iizhaoshen111@yahoo.com.cn

ObjectiveTo investigate the expression of Hedgehog signaling pathway members, Shh, Gli1, Sufu and TAK1 as well as phosphorylation-TAK1(p-TAK1) protein in human pancreatic carcinoma tissues and to explore its relationship between the expression of proteins and the clinicopathologic parameters.MethodsThe expressions of Shh, Gli1, Sufu, TAK1, p-TAK1 proteins in 38 samples of pancreatic cancer tissues and pairing adjacent normal pancreatic tissues were detected by immunohistochemical method．The relationship among the proteins and the relationship between the expression of the proteins and the clinicopathologic parameters were examined．ResultsThe positive expression rates of Shh, Gli1, Sufu, TAK1, p-TAK1 protein in human pancreatic carcinoma were 86.8%(33/38), 52.6%(22/38), 68.4%(26/38), 55.3%(21/38), 52.6%(20/38), but they were not expressed in adjacent normal pancreatic tissues. Gli1 expression was positively related to distant metastasis and clinical staging (r=0.524, 0.361,P<0.05), Sufu expression was positively related to patient′s gender (r=-0.378,P<0.05), TAK1 expression was positively related to clinical staging (r=0.468,P<0.05), p-TAK1 expression was positively related to clinical staging and distant metastasis (r=0.418, 0.361,P<0.05). Gli1 expression was positively related to TAK1 and p-TAK1 expression in pancreatic cancer tissues (P<0.05).ConclusionsHedgehog signaling pathway and p-TAK1 may play a role in the pathogenesis of pancreatic cancer, and the two pathways may interact with each other.

Pancreatic neoplasm; Immunohistochemistry; Hedgehog signal pathway; Mitogen-activated protein kinase kinases

2013-03-18)

(本文編輯：呂芳萍)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.04.008

重大國際合作項目(30910103911)

200433 上海，第二軍醫大學長海醫院消化內科

李兆申：Email:Iizhaoshen111@yahoo.com.cn