胰腺癌細胞株Hedgehog信號通路活化與K-ras基因突變的相關性研究

胡佳佳 吳紅玉 金晶 朱春平 李兆申 高軍 李淑德

·論著·

胰腺癌細胞株Hedgehog信號通路活化與K-ras基因突變的相關性研究

胡佳佳 吳紅玉 金晶 朱春平 李兆申 高軍 李淑德

目的探討胰腺癌細胞株中Hedgehog信號通路活化與K-ras基因突變的相關性。方法采用實時定量PCR法檢測人胰腺癌細胞株SW1990、PaTu8988、CFPAC-1、PANC1、AsPC-1、Capanc-2、BxPC-3的K-ras基因突變狀況及Hedgehog信號通路主要成員Gli1、Smo mRNA的相對表達量。結果PANC1、CFPAC-1、AsPC-1、PaTu8988細胞為12密碼子突變型，SW1990細胞為13密碼子突變型，BxPC-3、Capanc-2細胞為純野生型。AsPC-1、CFPAC-1、PANC1、PaTu8988、SW1990、BxPC-3、Capanc-2的Gli1 mRNA相對表達量分別為7.84±8.92、1.82±3.45、1.00±0.00、0.07±0.10、0.88±1.48、0.52±0.98、0.15±0.19；Smo mRNA的相對表達量分別為144.00±58.33、3.48±3.77、1.00±0.00、81.68±28.26、0.72±0.87、0.34±0.60、0.02±0.03。K-ras基因野生型胰腺癌細胞Gli1、Smo mRNA的表達水平均較突變型胰腺癌細胞株顯著降低，其中野生型BxPC-3細胞Gli1、Smo mRNA表達量顯著低于突變型AxPC-1細胞(P值均<0.05)。結論胰腺癌細胞株中Hedgehog信號通路活化與K-ras基因突變具有相關性。

胰腺腫瘤； K-ras； 點突變； Hedgehog信號通路； 轉錄因子

胰腺癌的發生、發展是個多種基因共同參與的多步驟、多階段過程。該過程中參與調控細胞增殖、分化、凋亡的多種基因發生異常改變，如原癌基因K-ras的點突變等，均與胰腺癌的發生、發展密切相關。此外，胰腺癌的發生亦與多種信號轉導通路的異常相關，如EGFR信號通路、Hedgehog信號通路、Smad4/TGF-β信號通路、Notch信號通路等。近年來的研究證實，Hedgehog信號通路活化是胰腺癌干細胞生存的前提，被認為是胰腺癌的核心致病機制之一[1-2]。本研究觀察人胰腺癌細胞株的K-ras基因突變情況及Hedgehog信號通路活化狀況，探討兩者在胰腺癌發生、發展中的相關性及相互作用。

材料和方法

一、K-ras基因突變檢測

人胰腺癌細胞株PANC1、CFPAC-1、BxPC-3、 AsPC-1、 Capanc-2、 PaTu8988、SW1990均購自中國科學院細胞所，常規培養、傳代。收集對數生長期細胞，應用酚-氯仿法抽提胰腺癌細胞DNA，使用NanoDrop核酸微量測量儀(ND1000型)測定DNA濃度，以焦碳酸二乙酯(DEPC)水調整濃度至50 ng/μl。K-ras基因上、下游引物，K-ras-FAM Tagman MGB探針，K-ras-VIC Tagman MGB探針均由美國AppliedBiosystems公司合成；肽核酸(PNA)由韓國Panagene公司合成。采用實時PCR法檢測K-ras基因突變。總K-ras基因檢測反應體系：Master Mix 7.5 μl，引物1.5 μl，MGB探針1 μl，DEPC水2.5 μl，模板2.5 μl。K-ras基因第12、13密碼子檢測反應體系：Master Mix 7.5 μl，引物1.5 μl，PNA2.5 μl，MGB探針1 μl，模板2.5 μl。每個樣品設置3個復孔，分別檢測K-ras基因第12、13密碼子突變及總K-ras基因。PCR反應條件：95℃ 10 min，95℃ 10 s、70℃ 10 s、55℃ 5 s、72℃ 32 s，50個循環。

二、Gli1、Smo mRNA表達檢測

應用Trizol抽提胰腺癌細胞總RNA，使用NanoDrop核酸微量測量儀(ND1000型)測定mRNA濃度。Gli1、Smo及內參GAPDH Taqman探針、引物均由美國Invitrogen公司設計合成。應用Takara公司的反轉錄試劑盒逆轉錄合成Gli1、Smo 的cDNA。PCR反應條件：50℃ 2 min，95℃ 10 min，95℃ 15 s、60℃ 1 min，50個循環。通過PCR儀自帶軟件獲取ΔCt值，mRNA表達量用公式2-ΔΔCt計算。實驗重復3次，取均值。

三、統計學處理

結 果

一、胰腺癌細胞株K-ras基因的突變狀態

PANC1、CFPAC-1、AsPC-1、PaTu8988細胞為12密碼子突變型，SW1990細胞為13密碼子突變型，BxPC-3、Capanc-2細胞為純野生型(圖1)。

圖1 7株胰腺癌細胞株K-ras基因的PCR擴增曲線

二、 胰腺癌細胞株Gli1、Smo mRNA的表達

AsPC-1、CFPAC-1、PANC1、PaTu8988、SW1990、BxPC-3、Capanc-2的Gli1 mRNA相對表達量分別為7.84±8.92、1.82±3.45、1.00±0.00、0.07±0.10、0.88±1.48、0.52±0.98、0.15±0.19；Smo mRNA的相對表達量分別為144.00±58.33、3.48±3.77、1.00±0.00、81.68±28.26、0.72±0.87、0.34±0.60、0.02±0.03，其中K-ras基因野生型細胞株BxPC-3的Gli1、Smo mRNA表達水平均顯著低于K-ras基因突變型細胞株AsPC-1(P值均<0.05)。

三、K-ras基因野生型與突變型細胞株Gli1、Smo mRNA的表達差異

K-ras基因野生型胰腺癌BxPC-3、Capanc-2細胞的Gli1、Smo mRNA的表達水平較突變型胰腺癌細胞株顯著降低(P值均<0.05，圖2)。其中野生型BxPC-3細胞的Gli1、Smo mRNA表達與突變型AsPC-1細胞的差異最顯著。

圖2K-ras基因野生型與突變型胰腺癌細胞株Gli1(上)、Smo mRNA(下)表達量的比較

討 論

Hedgehog信號通路以組織特異的方式控制細胞的增殖及分化，在胚胎的正常發育中發揮重要作用，在正常成熟胰腺中不表達或僅輕度表達[3]。近年來研究發現，多種人類惡性腫瘤的發生、發展與Hedgehog信號通路的異常調控密切相關，如基底細胞癌、小細胞肺癌、食管癌、前列腺癌、胰腺癌等[4-5]。Ji等[6]研究認為，癌基因K-ras突變導致胰腺癌發生的機制部分是通過激活Hedgehog信號通路來實現的。Xu等[7]認為，Hedgehog信號通路配體Shh可以通過增強K-ras癌基因的活性誘導胰腺癌發生，降低腫瘤細胞對持續性激活的Ras信號通路的依賴性。Pasea di Magliano等[8]采用一種可特異性激活胰腺上皮細胞中Hedgehog信號通路的小鼠模型研究胰腺癌的發病機制，結果發現小鼠生長到成年后可形成胰腺未分化癌，激活Ras信號通路可進一步導致廣泛性胰腺上皮內瘤變并提高腫瘤致死性，提示特異性激活胰腺上皮細胞中Hedgehog信號通路可以誘導胰腺瘤變，Ras和Hedgehog信號通路共同參與胰腺導管腺癌的形成。此外，Morton等[9]研究發現，由K-ras和Hedgehog聯合誘導的腫瘤細胞株在應用Hedgehog信號通路拮抗劑后，盡管信號通路被抑制，而腫瘤細胞仍可繼續增殖。因此深入探討胰腺癌發生分子機制中的Hdgehog信號通路與其他信號通路之間的相互作用成為研究的熱點。本研究檢測了7株胰腺癌細胞株的K-ras基因突變狀況及Hedgehog信號通路主要成員Gli1、Smo mRNA的表達，結果顯示K-ras基因野生型胰腺癌細胞株Gli1、Smo mRNA的表達水平較突變型胰腺癌細胞株顯著降低，其中野生型BxPC-3細胞的Gli1、Smo mRNA表達水平與突變型AsPC-1細胞的差異最顯著，提示Gli及Smo基因表達與K-ras基因突變在胰腺癌發生、發展過程中具有相關性。

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ThestudyonthecorrelationofactivationoftheHedgehogsignalingpathwayandK-rasgenemutationsinpancreaticcancercelllines

HUJia-jia,WUHong-yu,JINJing,ZHUChun-ping,LIZhao-shen,GAOJun,LIShu-de.

DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryUniversity,Shanghai200433,China

Correspondingauthor:LIShu-de,Email:lishude57@126.com;GAOJun,Email:gaojunaaa@gmail.com

ObjectiveTo investigate the correlation of K-ras gene mutations and activation of Hedgehog signaling pathway in pancreatic cancer cell lines.MethodsReal-time PCR was used to detect K-ras gene mutations at codon 12 and 13 in pancreatic cancer cell lines of SW1990, PaTu8988, CFPAC-1, PANC1, AsPC-1, Capanc-2, BxPC-3 and the mRNA expression of Gli1, Smo in these cell lines.ResultsThe K-ras mutation of PANC1, CFPAC-1, AsPC-1, PaTu8988 was at codon 12, while SW1990 was at codon 13, BxPC-3, Capanc-2 were wild type. The expressions of Gli1 mRNA of AsPC-1, CFPAC-1, PANC1, PaTu8988, SW1990, BxPC-3, Capanc-2 were 7.84±8.92, 1.82±3.45, 1.00±0.00, 0.07±0.10, 0.88±1.48, 0.52±0.98, 0.15±0.19, and the expressions of Smo mRNA were 144.00±58.33, 3.48±3.77, 1.00±0.00, 81.68±28.26, 0.72±0.87, 0.34±0.60, 0.02±0.03. Gli1, Smo mRNA expressions of cells with wild tpye K-ras were significantly lower than those with mutant type, and wild type BxPC-3′s Gli1, Smo mRNA expressions were significantly lower than that of mutant AxPC-1 (P<0.05).ConclusionsActivation of Hedgehog signaling pathway may be related to K-ras gene mutations.

Pancreatic neoplasms; K-ras; Point mutation; Hedgehog signaling pathway; Transcription factor

2013-06-03)

(本文編輯：屠振興)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.04.012

重大國際合作項目(30910103911)

200433 上海，第二軍醫大學長海醫院消化內科

李淑德，Email：lishude57@126.com；高軍，Email：gaojunaaa@gmail.com