羅格列酮對急性壞死性胰腺炎大鼠肺損傷的保護機制

殷濤 陳曉燕 丁佑銘 陳辰 王衛星

·論著·

羅格列酮對急性壞死性胰腺炎大鼠肺損傷的保護機制

殷濤 陳曉燕 丁佑銘 陳辰 王衛星

目的探討羅格列酮(ROSI)對急性壞死性胰腺炎(ANP)肺損傷的保護機制。方法雄性Wistar大鼠75只，按隨機表法分為假手術組、ANP組和羅格列酮處理組(ROSI組)。采用膽胰管逆行注射5%牛磺膽酸鈉制備ANP模型。ANP組在制模后30 min股靜脈注射10%二甲基亞砜(DMSO)0.2 ml/100 g體重。ROSI組在制模后30 min股靜脈注射10% DMSO溶解的ROSI 6 mg/kg體重。假手術組在膽胰管內注入等容積生理鹽水，術后30 min股靜脈注射等量10% DMSO。術后3、6、12 h分批處死大鼠，取血檢測血清淀粉酶，測肺濕、干重比(W/D)，取肺組織行病理學檢查，蛋白質印跡法檢測肺組織STAT1蛋白及磷酸化STAT1(p-STAT1)蛋白表達。結果ANP組血淀粉酶活性、肺W/D、肺組織病理評分均隨時間延長逐漸升高，在各時點均顯著高于假手術組(P值均<0.05)，12 h時達峰值，分別為(5017±203)U/L、3.12±1.30、(3.33±0.18)分；STAT1蛋白表達無明顯變化，p-STAT1的表達水平則在3 h達到峰值，為0.87±0.06，以后逐漸下降，但仍顯著高于假手術組(P值均<0.01)。ROSI組12 h時的血淀粉酶活性、肺W/D、肺組織病理評分分別為(1912±164)U/L、1.83±1.26、(2.78±0.16)分，均顯著低于同時點的ANP組(P值均<0.05)；STAT1蛋白表達無明顯變化，3、6、12 h的p-STAT1表達量分別為0.41±0.04、0.22±0.05、0.15±0.03，均顯著低于同時點的ANP組(P值均<0.05)。結論羅格列酮對ANP大鼠的肺損傷具有保護作用，其機制可能與早期抑制肺組織STAT1蛋白磷酸化有關。

胰腺炎，急性壞死性； 過氧化物酶體增殖物激活受體； 羅格列酮； 肺損傷

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)時常激活炎癥細胞釋放大量炎癥遞質，導致全身炎癥反應綜合征，累及多個胰外臟器損傷。肺臟是最常受累的胰外器官，急性胰腺炎肺損傷(acute pancreatitis associated-lung injury，APALI)是SAP患者早期病死的主要原因之一[1]。信號轉導與轉錄激活因子(signal transducer and activator of transcription，STAT)是一種新型細胞內信號轉導和基因表達調控因子。細胞因子通過JAK/STATs途徑激活STATs而誘導目的基因的表達[2]。羅格列酮(rosiglitazone，ROSI) 屬于人工合成的高選擇性過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(peroxisome proliferator-activated receptors-γ，PPAR-γ)的激動劑，對急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)具有抗炎作用[3]。本研究探討羅格列酮對急性壞死性胰腺炎(acute necrotizing pancreatitis, ANP)抗炎作用的機制。

材料與方法

一、實驗動物與分組

76只SPF級雄性Wistar大鼠，體重200～250 g，由湖北省疾病預防控制中心提供。按隨機表法分為假手術組、ANP組和羅格列酮處理組(ROSI組)。假手術組15只大鼠，ANP組及ROSI組各30只大鼠。采用膽胰管逆行注射5%?；悄懰徕c(Sigma公司)0.1 ml/100 g體重的方法制備ANP模型。假手術組大鼠膽胰管內注入等容積生理鹽水。ROSI組于造模后30 min經股靜脈注射10% DMSO溶解的羅格列酮(Cayman公司)6 mg/kg體重，其他兩組注射等容積10% DMSO。術后3、6、12 h分批剖殺大鼠，取血及肺組織。

二、方法

1．血清淀粉酶測定：采用全自動生化分析儀測定。

2．肺濕、干重比：取右肺中葉，拭去肺組織表面血跡及水分后稱濕重，置70℃烘箱24 h后稱干重，計算肺濕、干重比(W/D)。

3．肺組織病理學檢查：取右下肺組織置4%多聚甲醛固定，常規石蠟包埋、切片、HE染色，光鏡下觀察，參照文獻[4]對肺組織行病理學評分。

4．肺組織STAT1蛋白和磷酸化STAT1(p-STAT-1)蛋白檢測：取新鮮液氮凍存后置-80℃冰箱保存的肺組織，融化后制備組織勻漿，蛋白定量后常規行蛋白質印跡法檢測STAT1和p-STAT1表達。兔抗大鼠p-STAT1多抗購自Cell Signaling公司，工作濃度1∶600；兔抗大鼠STAT1抗體購自美國Santa Cruz公司，工作濃度1∶3000； HRP-山羊抗兔IgG二抗購自美國Pierce公司，工作濃度1∶5000；ECL化學發光顯色試劑盒購自Millipore公司。以β-actin為內參。凝膠成像系統掃描條帶灰度值，以目的條帶與β-actin條帶灰度比值代表蛋白的表達水平。

三、統計學處理

結 果

一、血清淀粉酶活性及肺W/D的變化

ANP組大鼠血清淀粉酶活性及肺W/D比隨著時間的延長逐漸升高，12 h達到峰值；而ROSI大鼠的血清淀粉酶活性、肺W/D比較ANP組顯著下降，差異有統計學意義(t值5.31～24.26，F=83.581，P值均<0.05，表1)。

二、肺組織病理學改變

假手術組大鼠肺組織結構清晰，肺泡壁完整，無明顯水腫和滲出。ANP組大鼠肺組織間質明顯充血、水腫，細胞浸潤，間質明顯增寬，隨著時間延長肺損傷加重，肺組織病理評分逐漸增高。ROSI組大鼠肺組織間質充血、水腫和浸潤程度較ANP組減輕，病理評分下降，其中3、6、12 h的病理評分與同時間點ANP組的差異有統計學意義(P值均<0.05)，與假手術組比較，差異均無統計學意義(圖1，表1)。

圖1假手術組(a)、ANP組(b)、ROSI組(c) 3 h時大鼠肺組織病理改變(HE ×200)

三、肺組織STAT1及p-STAT1蛋白的表達

假手術組、ANP組、ROSI組STAT1蛋白表達在各時間點差異均無統計學意義。ANP組p-STAT1蛋白表達水平于3 h時達峰值，6 h時開始下降，12 h時明顯下降，但均顯著高于假手術組(P值均<0.01)。ROSI組p-STAT1蛋白在3、6、12 h時均較同時點ANP組顯著下降，差異有統計學意義(F=26.317，P值均<0.05，圖2，表1)。

圖2假手術組(1)、ANP組(2)、ROSI組(3)3、6、12 h(a、b、c)肺組織STAT1及p-STAT1蛋白表達

表1 各組大鼠血淀粉酶活性、肺W/D、肺組織病理評分及STAT1、p-STAT1表達的變化

注：與假手術組比較,aP<0.05，bP<0.01；與ANP組比較,cP<0.05

討 論

炎癥遞質的過度表達是很多炎癥性疾病發生、發展的作用機制之一。目前，細胞信號通路與炎癥發生機制之間的關系是研究的重點。信號轉導和轉錄激活因子(STAT)是一類DNA結合蛋白，作為JAK的底物與酪氨酸磷酸化耦聯從而發揮轉錄調控作用，介導細胞因子的多種生物學效應。

炎癥過程中，大量細胞因子和炎癥遞質的釋放，引起JAK活化并使其受體磷酸化，然后與STATs結構中的SH2功能結構域相互作用，使其早期磷酸化而被激活，進入細胞核與相應的靶基因啟動子結合激活相應基因的轉錄和表達。不同的STATs蛋白具有不同的功能[5]。有研究顯示，抑制STATs蛋白的表達對AP大鼠肺損傷具有保護作用[6]。而STAT1目的基因被證實具有促進炎癥發生和抵抗細胞增殖作用[7]。在膿毒癥大鼠肺損傷模型中，抑制STAT1活化可以減輕膿毒癥所致肺組織損傷[8]。

羅格列酮屬于噻唑烷二酮(TZD)類，其發揮抗炎作用的機制尚未完全明確。Cuzzocrea等[9]研究發現，羅格列酮能減少中性粒細胞浸潤和細胞間黏附分子的表達，從而減輕蛙皮素誘導的AP各臟器損傷程度。PPAR-γ激動劑的抗炎機制可能通過抑制JAK/STAT1信號通道的炎癥轉錄因子，如STAT1，從而抑制下游炎癥遞質TNF-α、ICAM-1 mRNA的表達，進一步減輕炎癥反應[10-12]，表明羅格列酮能減輕ANP大鼠的肺損傷，

本研究結果顯示，各組大鼠STAT1蛋白表達差異無統計學意義，但ANP組 STAT1蛋白在1 h時即被磷酸化而活化，3 h時達到高峰， 6 h后明顯下降，12 h表達最低，與Severgnini等[13]的報道一致。應用羅格列酮干預后大鼠胰腺組織p-STAT1蛋白表達降低，且血清淀粉酶及肺濕、干重比和肺組織病理學評分均較ANP組顯著下降，其機制可能是通過抑制STAT1蛋白的磷酸化進而下調炎癥因子如TNF-α、IL-6和細胞間黏附分子等促炎遞質的表達，改善AP大鼠的臟器損傷[9-10,12,14]。

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Protectivemechanismofrosiglitazoneonacutenecrotizingpancreatitisassociatedlunginjuryinrats

YINTao,CHENXiao-yan,DINGYou-ming,CHENChen,WANGWei-xing.

DepartmentofHepatobiliaryPancreasSurgary,CancerHospitalofHubeiProvince,Wuhan430079,China

Correspondingauthor:WANGWei-xing,Email：sate.llite@163.com

ObjectiveTo investigate the protective effect of rosiglitazone on acute necrotizing pancreatitis (ANP) associated lung injury in rats.MethodsSeventy-five male Wistar rats were randomly divided into sham operation group (SO group), acute necrotizing pancreatitis group (ANP group) and rosiglitazone pretreatment group (ROSI group). ANP model was induced by retrograde infusion of 5% sodium taurocholate into the biliopancreatic duct. Thirty minutes after ANP induction, ANP groups were injected with 10% DMSO (0.2 ml/100 g) through femoral vein, and ROSI group were injected with ROSI dissolved with 10% DMSO (6 mg/kg) through femoral vein, while SO group was injected with normal saline, and 30 minutes later was injected with same amount of 10% DMSO. Rats were sacrificed at 3 h, 6 h and 12 h after the operation. Serum amylase and lung wet/dry weight ratio (W/D) were measured, lung tissues were harvested for pathologic examinations. STAT1 protein and phosphorylation-STAT1 protein (p-STAT1) expression were detected by Western blot.ResultsThe serum levels of amylase, lung W/D, pathologic score of lung tissues in ANP group were increased with time, and reached the peak at 12 h, which were (5017±203)U/L, 3.12±1.30, (3.33±0.18) score, and these were significantly higher than those in SO group (P<0.05 or 0.01), the expression of STAT1 protein was not statistically significant, but the expression of p-STAT1 reached the peak at 3 h (5.23±0.03), then it gradually decreased, but it was still significantly higher than that in SO group (0.16±0.04,p<0.01). The serum levels of amylase, lung W/D, pathologic score of lung tissues in ROSI group at 12 h were (1912±164) U/L, 1.83±1.26, (2.78±0.16), which were significantly lower than those in ANP group (P<0.05). The expression of STAT1 protein was not statistically significant, and the expressions of p-STAT1 at 3 h, 6 h, 12 h was 0.41±0.04, 0.22±0.05, 0.15±0.03, which were significantly lower than those in ANP group (P<0.05).ConclusionsRosiglitazone has the protective effect on ANP associated lung injury by inhibition of phosphorylation-STAT1 protein expression in the early phase.

Pancreatitis, acute necrotizing; Peroxisome proliferator-activated receptors; Rosiglitazone; Lung injury

2012-10-18)

(本文編輯：屠振興)

通知

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.04.013

湖北武漢，湖北省腫瘤醫院肝膽胰外科(殷濤)；武漢大學人民醫院肝膽腔鏡外科(殷濤、陳曉燕、丁佑銘、陳辰、王衛星)

王衛星，Email：sate.llite@163.com

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