羅格列酮對急性高脂血癥性胰腺炎大鼠干預研究

黃曉麗 王國品 王平 湯玉蓉 滕曉琨 葛建新

羅格列酮對急性高脂血癥性胰腺炎大鼠干預研究

黃曉麗 王國品 王平 湯玉蓉 滕曉琨 葛建新

隨著人們生活水平的提高、飲食結構和生活習慣的改變，高脂血癥性胰腺炎(hyperlipidemic pancreatitis,HLP)的發病率逐年升高，且HLP患者較非HLP患者的癥狀重、并發癥多、預后差。高脂血癥患者往往伴有體內脂肪組織增多，脂肪組織可釋放脂肪細胞因子。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)作為重要的脂肪因子之一，在HLP 中發揮重要作用。羅格列酮為選擇性過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(peroxisome proliferator-activated receptor,PPAR-γ)激動劑，具有增強細胞對胰島素敏感性，減輕胰島素抵抗等藥理作用，在炎癥調控中也起到一定作用 。本研究應用羅格列酮干預HLP和非HLP大鼠，觀察胰腺組織TNF-α表達的變化，探討羅格列酮保護HLP大鼠的作用機制。

一、材料和方法

1．實驗動物與分組：雄性SD大鼠48只，體重200～250 g，購自浙江省實驗動物中心，許可證號：SCXK(浙)2008-0033。按數字表法隨機分為6組，每組8只。對照組大鼠用普通飼料喂養4周，開腹輕輕翻動十二指腸和胰腺后即關腹。高脂血癥(HL)組大鼠用高脂飼料(77%普通飼料+20%豬油+3%膽固醇)喂養4周，術中亦僅輕輕翻動十二指腸和胰腺。非HLP(NHLP)組大鼠用普通飼料喂養4周，采用5%牛黃膽酸溶液(Sigma公司)逆行注入胰膽管方法制備急性壞死性胰腺炎(ANP)模型。HLP組大鼠用高脂飼料喂養4周后同法制備ANP模型。NHLP及HLP治療組在NHLP及HLP大鼠造模后經股靜脈注射10%DMSO溶解的羅格列酮(成都恒瑞制藥有限公司)6 mg/kg體重。其他4組在術后經股靜脈注射等容積生理鹽水。術后12 h處死動物，取胰腺組織和血標本。

2．胰腺組織病理學檢查：取部分胰腺組織常規固定、石蠟包埋、制片、HE染色，由2名病理醫師讀片，每片選取4個視野，根據Schmidt等[1]的標準從水腫、炎細胞浸潤、出血、壞死4個方面評分，取均值，各單項平均分之和為病理總分。

3．血清TNF-α、三酰甘油(TG)和淀粉酶活性測定：ELISA法測定血清TNF-α水平，采用全自動生化分析儀檢測血清TG水平及淀粉酶活性。

4．胰腺組織TNF-α mRNA表達檢測：取100 mg新鮮胰腺組織，加入1 ml Trizol(Invitrogen公司)抽提總RNA，先應用逆轉錄酶M-MLV和Oligo(dT)引物(Promega公司)合成第一鏈cDNA。再取1 μl cDNA為模板，用PCR試劑盒(TaKaRa公司)進行擴增。引物序列：TNF-α(210 bp)上游5′-TAGCAAACCACCAAGCAG-3，下游：5′-GGTATGAAATGGCAAATCG-3′，內參GAPDH(470 bp)上游5′-TCAACGGCACAGTCAAGG-3′，下游5′-ACCAGTGGATGCAGGGAT-3′。PCR反應條件： 95℃ 5 min，94℃ 30 s、54℃ 35 s、72℃ 45 s，35個循環，72℃延伸10 min。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離、溴化乙啶染色，在凝膠影像分析儀(Bio-Rad ChemiDoc XRS)上成像并掃描，以TNF-α與GAPDH吸光度比值表示mRNA的表達水平。

二、結果

1．胰腺組織病理學改變：對照組胰腺組織無明顯改變。HL組胰腺的部分細胞脂質空泡形成，中等量炎癥細胞浸潤，未見明顯出血及壞死。NHLP組與HLP組胰腺實質大量壞死伴出血，間質顯著充血、水腫，大量炎細胞浸潤。NHLP治療組與HLP治療組胰腺實質壞死、出血、間質水腫、炎細胞浸潤程度均較相應未治療組減輕(圖1)。NHLP組和HLP組胰腺病理評分顯著高于對照組(P值均<0.01)，HLP組評分又顯著高于NHLP組及HL組(P<0.05、P<0.01)，NHLP治療組評分顯著低于NHLP組(P<0.05)，HLP治療組顯著低于HLP組(P<0.01，表1)。

2．血清TG及淀粉酶水平的變化：HL組及HLP組血TG濃度顯著高于對照組(P值均<0.01)，但羅格列酮治療不降低血TG的水平。HL組與對照組的血淀粉酶活性比較差異無統計學意義，但NHLP組、NHLP治療組、HLP組、HLP治療組血淀粉酶活性均顯著高于對照組(P值均<0.01)，且HLP組亦顯著高于HL組(P<0.05，表1)。羅格列酮治療能顯著降低HLP組的血淀粉酶活性，但不降低NHLP組血淀粉酶活性。

圖1對照組(a)、HL組(b)、NHLP組(c)、NHLP治療組(d)、HLP組(e)、HLP治療組(f)的胰腺病理改變(HE ×100)

3．血清TNF-α濃度的變化：HL組、NHLP組、HLP組、NHLP治療組、HLP治療組血TNF-α濃度均顯著高于對照組(P<0.05或<0.01)，且NHLP組、HLP組、NHLP治療組、HLP治療組血TNF-α濃度均顯著高于HL組(P值均<0.01，表1)。羅格列酮治療能顯著降低NHLP組及HLP組的血TNF-α濃度。

表1 各組大鼠血清TG、淀粉酶、TNF-α水平及胰腺組織病理學評分

注：與對照組比較，aP<0.05，bP<0.01；與HL組比較，cP<0.05，dP<0.01；與NHLP組比較，eP<0.05，fP<0.01；與HLP組比較，gP<0.05，hP<0.01

4．胰腺組織TNF-α mRNA表達水平的變化：對照組、HL組、NHLP組、HLP組、NHLP治療組、HLP治療組胰腺組織TNF-α mRNA表達水平分別為0.72±0.13、1.00±0.19、1.22±0.08、1.66±0.11、1.06±0.15、1.38±0.07(圖2)。HL組、NHLP組、HLP組、NHLP治療組、HLP治療組TNF-α mRNA表達水平均顯著高于對照組，且HLP組亦顯著高于HL組(P值均<0.05)，羅格列酮治療能顯著下調HLP組胰腺組織TNF-α mRNA表達(P<0.05)，但NHLP治療組與NHLP組胰腺組織TNF-α mRNA表達水平的差異無統計學意義。

圖2對照組(1)、NHLP治療組(2)、NHLP組(3)、HL組(4)、HLP治療組(5)、HLP組(6)大鼠胰腺組織TNF-α mRNA表達

討論TNF-α來源廣泛，主要由單核細胞、巨噬細胞和T細胞產生，另外脂肪組織亦高表達TNF-α。文獻報道[2-3]，TNF-α與急性胰腺炎的發病密切相關。劉梅芳等[4]研究顯示，TNF-α能夠上調脂肪細胞內脂肪分化相關蛋白，并增加其磷酸化水平，促進脂肪細胞分解，釋放大量脂肪酸(FFA)，加重胰腺損傷。Suganami等[5]體外實驗證實，FFA又可以刺激巨噬細胞產生TNF-α。因此，HLP大鼠體內形成FFA和TNF-α之間的惡性循環，導致脂肪酸和TNF-α大量釋放，而兩者均可加重胰腺損傷。本研究結果顯示，NHLP組和HLP組胰腺病理組織學評分、血清淀粉酶活性明顯高于對照組及HL組，HLP組和HL組血TG水平明顯高于對照組，提示制模成功。HL組大鼠血TNF-α濃度及胰腺組織TNF-α mRNA表達均高于對照組大鼠，HLP組大鼠胰腺病理損傷較NHLP組重，血清TNF-α濃度及胰腺組織TNF-α mRNA表達均顯著高于NHLP組，提示HLP大鼠胰腺組織TNF-α高表達及血清TNF-α水平升高是HLP時胰腺損傷加重的重要原因之一。

羅格列酮是高選擇性PPAR-γ激動劑。有研究發現，激活PPAR-γ可以阻止脂多糖引起的單核細胞、HL60細胞與人體動脈內皮細胞結合，從而抑制TNF-α等致炎細胞因子表達，抑制炎癥反應[6]。Hao等[7]報道，羅格列酮通過活化PPAR-γ，抑制了JAK-STAT信號通路的活化，進而抑制TNF-α mRNA的表達，減輕胰腺的病變損傷。Pini等[8]認為，羅格列酮能通過降低伴急性胰腺炎的肥胖大鼠內臟脂肪皂化和減輕紅細胞生成抑制而提高大鼠的生存率、促進胰腺炎癥恢復，但能促進伴急性胰腺炎的非肥胖大鼠胰腺腺泡和脂肪組織的壞死。本研究結果顯示，HLP大鼠經羅格列酮治療后胰腺病理學評分、血清TNF-α濃度、胰腺組織TNF-α mRNA表達均顯著降低，而NHLP大鼠經羅格列酮治療后血清TNF-α濃度顯著降低，但胰腺病理組織學評分及胰腺組織TNF-α mRNA表達的下降不明顯，提示羅格列酮對HLP的治療效果較NHLP強，為臨床應用此藥提供一定的幫助。

[1] Schmidt J, Lewandrowsi K, Fernander-Del Castill C, et al. Histopathologic correlates of serum amylase activity in acute experimental pancreatitis. Dig Dis Sci,1992,37:1426.

[2] Bishehsari F, Sharma A, Stello K,et al. TNF-alpha gene (TNFA) variants increase risk for multi-organ dysfunction syndrome (MODS) in acute pancreatitis. Pancreatology, 2012,12:113-118.

[3] 郝云龍，聞勤生.急性壞死性胰腺炎與TNFA，IL-6，IL-8的關系及奧曲肽的作用.中國現代醫學雜志,2002,12:29-30.

[4] 劉梅芳,俎魯霞,徐沖,等.腫瘤壞死因子-α上調大鼠分化脂肪細胞脂肪分化相關蛋白水平及其機制.北京大學學報(醫學版),2008,40:578-582.

[5] Suganami T,Nishida J,Ogawa Y.A panracrine loop between adipocytes and macrophages aggravates inflammatory changes:role of free fatty acids and tumor necrosis factor alpha.Arteriosecler Thromb Vasc Biol,2005,25:2062-2068.

[6] Jiang C,Ting AT,Seed B.PPAR-gamma agonists inhibit production of monocyte inflammatory cytokines.Nature,1998,391：82-86.

[7] Hao SX, Wang WX, Chen C，et al.The effect of rosiglitazone on the activity of STAT1 in rats with severe acute pancreatitis. Zhonghua Wai Ke Za Zhi, 2009, 47:218-221.

[8] Pini M, Rhodes DH, Castellanos KJ,et al.Rosiglitazone improves survival and hastens recovery from pancreatic inflammation in obese mice. PLoS One, 2012,7:e40944.

2013-01-14)

(本文編輯：呂芳萍)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.04.020

南通大學自然科學研究項目(10Z12)

210048 南京，南通大學附屬南京江北人民醫院消化內科

黃曉麗，Email：h_xiaoli2012@163.com