同種異基因骨髓移植小鼠aGVHD模型的建立

北京市懷柔區第一醫院（101400）寧涓

造血干細胞移植（HSCT）尤其是異基因HSCT（allo-HSCT）現廣泛應用于血液腫瘤或非血液惡性腫瘤、再生障礙性貧血、某些遺傳性疾病等的治療，甚至認為allo-HSCT是治愈某些血液腫瘤和遺傳性疾病的唯一方法。目前，移植物抗宿主病（GVHD）仍是allo-HSCT移植后相關死亡的主要原因，是移植的首要障礙，即使在接受HLA配型完全相合的同胞供者移植的患者中，也常發生嚴重的急性移植物抗宿主病（aGVHD）而致死。因此，利用動物型模來研究aGVHD的發病機理，具有十分重要的理論和實用價值。因此，我院利用C57BL/6（H-2b）和BALB/c（H-2d）小鼠來建立一種穩定可靠的同種異基因骨髓移植（BMT）aGVHD模型，以便更好的研究aGVHD的發病機理。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 ①清潔級雌性BALB/c（H-2d）小鼠36只，6～8w，18～22g；②清潔級雄性BALB/c（H-2d）小鼠24只，6～8w，18～22g；③清潔級雄性C57BL/6（H-2b）小鼠24只，6～8w，18～22g；均購自首都醫科大學實驗動物中心，并在首都醫科大學實驗動物中心層流房中飼養。

1.1.2 主要試劑及其配置 含抗生素的飲用水（紅霉素250mg/L，慶大霉素32×104U/L，氟哌酸200mg/L），PBS緩沖液（NaCl 8g、KCl 0.2g、Na2HPO41.44g、KH2PO40.24g溶解后加三蒸水至1L，調pH 7.2，4℃保存），RPMI-1640培養液（GIBCO公司），紅細胞裂解液（Tris 2.6g、NH4Cl 7.47g溶于1L三蒸水中，0.22μm濾膜過濾除菌，調pH 7.2，4℃保存），PCR引物合成（英駿生物技術有限公司），普通PCR試劑盒（深圳中晶生物技術有限公司），瓊脂糖粉（sigma公司），DNA Marker（上海申能博采公司），3S Spin Genomic DNA Miniprep Kit V3.0（上海申能博采公司）。

1.1.3 實驗儀器 普通離心機：LD-2A型（北京醫用離心機廠制造），低溫高速臺式離心機（Universal 32，德國），PTC-0200型PCR儀（美國），恒溫恒壓電泳儀（國產），YH-1型超凈工作臺（廣州），Olympus倒置顯微鏡（Olympus公司，日本），X線直線加速器-231型（VARIAN公司，美國），凝膠圖像光密度分析儀UVP-GDS型（英國），紫外分光光度計GeneQuant Ⅱ（Pharmacia Biotech公司，英國），200目不銹鋼篩網（廣州），微量加樣器（0.5-1000μL，Eppendorf）。

1.2 方法

1.2.1 受鼠準備 移植前1w將BALB/c（H-2d）小鼠置于空氣層流房的動物飼養空氣層流柜中無菌飼養，所有墊料、飼料及飲用水均經高壓滅菌處理，移植前5d接受含抗生素的飲用水直至移植后2w。

1.2.2 預處理 移植4h前BALB/c（H-2d）小鼠接受全身照射（TBI），總劑量為8.0Gy，劑量率為0.5Gy/min，照射源與動物之間間隔90cm。

1.2.3 造血干細胞和淋巴細胞移植

1.2.3.1 供鼠骨髓單個核細胞分離 ①斷頸處死供鼠，75%酒精浸泡5min，在超凈臺內將小鼠腹部向上平放，在腹區下部皮膚上做一長橫切口，剝開皮膚，露出臀部及后肢。②用鼠齒鑷拉緊后肢，用剪刀盡可能將肌肉剪開，在髖關節處將后肢與軀干分離，分離時勿傷長骨骨骺，取下的后肢放入有RPMI-1640培養液的平皿中。③用剪刀盡可能去除股骨及脛骨表面黏附的肌肉，將脛骨、股骨放入RPMI-1640培養液的平皿中浸泡5min，更換器械，嚴格無菌操作；然后剪開兩端的骨骺，用1mL注射器針頭刺入骨髓腔中。④用裝有RPMI-1640培養液的注射器反復沖洗骨髓腔，沖洗液裝入10mL無菌離心管，用吸管反復吹打，靜置片刻，去除試管底部沉淀；用紅細胞裂解液裂解紅細胞；之后離心，去除上清液（1500rpm，5min），加RPMI-1640培養液洗滌1次，再加入RPMI-1640液培養液2mL，反復吹打使細胞充分混勻，隨后在顯微鏡下計數有核細胞的數量，最后用RPMI-1640培養液調整細胞濃度為1×108/mL，備用。

附表1 小鼠分組

附表2 各組小鼠平均存活時間

1.2.3.2 供鼠淋巴細胞懸液的制備 ①在供鼠腹區沿腹部中線做一縱切口，打開腹腔，取下脾臟（盡量剔除脂肪組織），置于預先加入5mL RPMI-1640培養液的無菌平皿中。②在平皿中用注射器針芯在無菌200目不銹鋼篩網上輕輕研磨脾臟，并用移液管吸取RPMI-1640培養液沖洗不銹鋼篩網，沖洗2遍，移至10mL刻度離心管，以1000rpm（常規臺式離心機）離心10min，加入5mL預冷的紅細胞裂解液，混勻，靜置6min，加入RPMI-1640培養液5mL中止裂解液裂解，1000rpm離心10min，RPMI-1640培養液洗滌2遍，以RPMI-1640培養液調整細胞濃度為3×108/mL，備用。③將上述兩種細胞懸液等體積混合，此時脾細胞濃度為1.5×108/mL，骨髓細胞濃度為0.5×108/mL，小鼠移植前4h行X射線全身照射（TBI 8.0Gy，計量率0.5Gy/min），在無菌條件下用1mL注射器沿受鼠尾靜脈輸注供鼠骨髓細胞和淋巴細胞混合懸液0.2mL，此時脾細胞數為3×107，骨髓細胞數為1×107。

1.2.4 小鼠分組及造血干細胞和淋巴細胞移植見附表1。

附圖1 各組小鼠肝臟表現

1.2.5 結果判斷標準

1.2.5.1 移植植活狀態好 體重增加，脾臟見到明顯的脾結節，外周血WBC＞1.0×109/L，PCR可檢測出Y染色體。

1.2.5.2 移植失敗 照射后很快死亡，死亡時外周血WBC＜0.5×109/L，沒有嵌合體形成。

1.2.5.3 感染 外周血WBC＞0.5×109/L，外周血見中性粒細胞核左移，胞漿中有中毒顆粒。

1.2.5.4 aGVHD的判斷標準 外周血WBC＞1.0×109/L，且伴有倦怠，精神萎靡，嗜睡，食欲下降，體重下降，弓背，脫毛，腹瀉，出血；病理檢查可見肝臟、脾臟組織淋巴細胞浸潤，正常組織結構破壞。

1.2.6 統計學分析 所有數據均采用SPSS13.0統計軟件包進行處理，小鼠造血重建時間采用獨立樣本t檢驗，受鼠生存時間采用K Independent Samples Test分析。

2 結果

2.1 造血重建 本研究動態觀察結果表明，預處理后第3d三組受鼠WBC＜1×109/L，且單純照射組WBC始終＜1×109/L，同基因組和異基因組WBC＞1.0×109/L的時間分別為9.33±2.31d、10.33±1.65d（P＝0.501），兩組造血重建時間差異無統計學意義。

2.2 小鼠一般狀況和aGVHD觀察 三組小鼠照射后前6d變化類似：體重進行性下降，伴活動減少，嗜睡，皺毛，弓背但無腹瀉。A組小鼠于第6d開始死亡，死亡高峰在移植后9～12d，第12d全部死亡；B組小鼠第7d起體重逐漸增加，至移植后3w時體重恢復正常并繼續增加，該組小鼠未出現aGVHD的癥狀，全部存活時間＞60d；C組小鼠第7～10d體重略回升，11d后體重再度開始下降，并在11d左右再次出現活動減少，嗜睡，弓背，脫毛，腹瀉等典型GVHD表現[1]，死亡高峰在移植后15～17d，第17d全部死亡，三組小鼠生存時間存在顯著性差異（P＜0.01）。各組小鼠移植后平均存活時間見附表2。

2.3 GVHD發生率 A組、B組小鼠未發生aGVHD，C組小鼠全部出現aGVHD表現，發生率100%。

2.4 生存期觀察 經統計學分析，A、B、C三組小鼠間的生存時間存在顯著差異（Log rank＝28.025，P＝0.000）。

2.5 移植后各組小鼠肝臟、脾臟的GVHD相關病理形態學改變 對各組小鼠的肝臟、脾臟標本作常規病理切片結果顯示：三組小鼠肝臟、脾臟第3d、第7d未見病變；單純照射組小鼠第12d（瀕死前）肝臟病變：肝臟部分肝細胞輕度水腫，出現空泡；脾臟髓質脾小體明顯消失，大量紅細胞壞死，含鐵血黃素沉積。同基因骨髓移植組小鼠肝臟第14d病理學檢查未見異常；脾臟可見脾小體縮小，髓質淋巴細胞未減少，纖維組織增生。異基因骨髓移植組小鼠第14d（發生aGVHD后3d）肝臟病變：肝臟出現肝細胞點狀壞死，嗜酸性變，匯管區淋巴細胞浸潤；脾臟髓質脾小體消失，脾竇擴張、淤血、纖維組織增生，組織細胞增生典型，見附圖1和2。

2.6 PCR法特異性擴增Y染色體進行嵌合體檢測 移植后生存時間＞10d的所有小鼠（BALB/c，♀）進行PCR法擴增外周血Y染色體檢查，全部均檢查到Y染色體，提示供鼠（C57BL/6，♂）骨髓細胞植入成功。

3 討論

HSCT廣泛用于惡性與非惡性疾病的治療，尤其是allo-HSCT被認為是治愈某些疾病的唯一方法。移植發展至今，盡管在許多方向獲得極大發展，但影響allo-HSCT預后的最主要并發癥GVHD仍未得到很好解決。同種異體HSCT后GVHD的發生率高達50%～80%，并造成30%的移植相關死亡率，嚴重影響移植后患者的生存時間和生存質量[2]。因此，需要建立一種穩定可靠的GVHD動物模型以便更好地研究防治GVHD的方法具有十分重要的意義。鑒于此，筆者利用C57BL/6（H-2b）和BALB/c（H-2d）小鼠來建立一種穩定可靠的同種異基因骨髓移植（BMT）aGVHD模型。

附圖2 各組小鼠脾臟病理特點

GVHD主要是由T細胞介導的免疫反應，是由供者來源的T細胞識別受者的主要組織相容性和/或次要組織相容性抗原從而被活化，通過釋放炎癥細胞因子和直接殺傷作用，損傷受者組織器官的免疫病理過程[3][4][5][6]。眾多因素與GVHD的發生有關，其中移植物中免疫活性細胞的數量、供受者之間的組織相容性抗原不合和宿主缺乏對移植物發動免疫攻擊能力是GVHD發生的3個必備條件。在小鼠aGVHD動物模型中為滿足上述3個條件，筆者對小鼠進行骨髓移植前預處理，移植前4h利用X射線全身照射（total body irradiation，TBI），總劑量8.0Gy，劑量率為0.5Gy/min，照射的目的是清除受者的骨髓造血組織并抑制受者的免疫功能。目前研究認為，GVHD的效應是供體的活化淋巴細胞，有文獻報道當移植的脾細胞＞1×107個時，方可造成典型的aGVHD的征象，骨髓細胞必須＞1×106個時方可以保證成功地植入。本研究骨髓細胞數和脾細胞數分別為1×107和3×107，滿足實驗要求。

本研究中單純照射組小鼠照射后6～12d全部死亡，同基因移植組小鼠全部長期生存，無aGVHD征象，實驗組小鼠移植后11d再次出現活動減少，嗜睡，弓背，脫毛，腹瀉等典型aGVHD表現；肝臟、脾臟、皮膚病理切片檢查小鼠符合aGVHD征象；aGVHD的發病率100%。同時對同基因移植組和異基因移植組生存時間＞10d的所有小鼠（BALB/c，♀）進行PCR法擴增外周血Y染色體檢查，全部均檢查到Y染色體，提示供鼠（C57BL/6，♂）骨髓細胞植入成功。筆者成功建立同種異基因骨髓移植模型，且aGVHD表現典型，發病率100%，從開始發生aGVHD至小鼠全部死亡有7d時間，為筆者提供充分觀察aGVHD的時間。

綜上所述，C57BL/6→BALB/C作為MHC不相合異基因移植動物模型，具有重復性好，發病率高，aGVHD表現典型，可作為aGVHD研究的理想參照。