中國先天性副肌強直一家系致病基因初步研究

桑道乾 談昕煜 陳靜 時鵬 許文芳 陳齊鳴 胡松年

中國先天性副肌強直一家系致病基因初步研究

桑道乾 談昕煜 陳靜 時鵬 許文芳 陳齊鳴 胡松年

目的對收集的中國先天性副肌強直(PC)一家系致病基因進行初步篩查。方法采用測序的方法對中國PC家系的患者和正常人的SCN4A基因24個外顯子測序，分析比較中國PC家系的患者和正常人與正常人群的差異。結果未發現該中國PC家系在SCN4A基因24個外顯子存在致病突變。結論該中國PC家系的發病與SCN4A基因無關。

先天性副肌強直(paramyotonia congenita，PC)又稱為Eulenburg病，是一常染色體顯性遺傳病，以冷刺激或運動誘發的發作性面、舌、頸和手部肌強直，持續數分至數小時為顯著特征，臨床罕見。目前多數學者認為是骨骼肌細胞膜上鈉通道Ⅳ型α亞單位(alpha subunit type Ⅳ of voltage-gated sodium channel，SCN4A)基因突變所致。本研究收集了中國一家族性先天性副肌強直，調查和分析患者的臨床特征，并對其致病基因進行了初步篩查。

1 家系資料

調查該家系3代，有血緣關系者15人，如下圖。明確發病者2代4人即：

Ⅱ1、Ⅱ5、Ⅲ1、Ⅲ2、Ⅲ3、Ⅲ4、Ⅲ5、Ⅲ6、Ⅲ7、Ⅲ8和Ⅲ9因年齡小尚不明確是否為患者。Ⅰ1和Ⅰ2因死亡年代久遠，無從知曉是否為患者。先證者Ⅱ1，男，60歲，電工。發作性肌肉僵硬三十年入院。三十年前出現雙下肢小腿和大腿肌肉僵硬，常在運動后或勞累后發作，發作時持續一到數分鐘，數天發作一次。肌肉僵硬逐漸累及腹肌、胸背肌肉、雙上肢肌肉、頸部肌肉和咀嚼肌肉。常有張口后不能立刻閉觜，雙手長時用力持握老虎鉗或冬季騎摩托車不能放松，癥狀持續約5 min后緩解。同時有夜間起床后不能立即行走，需全身搖晃5～10 min后才能行走。肌肉僵硬冬天較夏天發作頻繁。近兩月發作加重，一天數次，累及腹肌、胸背肌肉、四肢肌肉、頸部肌肉和咀嚼肌肉。患者2女兒和一弟有類似癥狀。體檢：寬矮體型，四肢肌力和肌張力正常，深反射正常，病理反射未引出，腓腸肌、肱二頭肌叩診未見肌球；右手冰水侵浴10min后見肌肉僵硬發作。輔助檢查：電解質結果正常，肌酶譜結果正常；肌電圖檢查未見強直放電；重復刺激實驗未見運動復合電位(compound motor action potential， CMAP)波幅明顯衰減；短時運動誘發電位實驗可見CMAP波幅即刻輕微衰減，長時運動誘發電位實驗可見CMAP波幅延遲輕微衰減，運動后半小時CMAP波幅達最低點，然后緩慢恢復，90分鐘后恢復初始波幅。苯妥英鈉，0.1g/次，3次/d無效，0.2g/次，3次/d，每天三次有效。

該家系患者共同的臨床特征是25歲后發病，寒冷和運動誘發肌肉僵硬，苯妥英鈉治療有效。先證者Ⅱ1特征性的癥狀是雙手長時用力持握老虎鉗或冬季騎摩托車不能放松。先證者Ⅱ1的女兒Ⅲ1和Ⅲ2特征性的癥狀是雙手常在冬季洗衣時出現僵硬。先證者Ⅱ1的弟弟Ⅱ5是搬運工，特征性的癥狀是搬運貨物時常出現四肢僵硬。

2 分子遺傳學研究

對家系中表型明確的患者和正常人進行SCN4A基因24個外顯子測序，分析比較家系中患者和正常人以及正常人群的差異。

2.1DNA提取 采集患者Ⅱ1、Ⅱ5、Ⅲ1、Ⅲ2和家系中正常人Ⅱ3、Ⅱ7靜脈血2毫升，使用Axygen血基因組DNA小量試劑盒提取DNA。

2.2SCN4A基因24個外顯子PCR擴增及測序引物序列如下表。

表1

2.3PCR擴增體系及條件 PCR擴增體系(15μl)： DNA模板1.0μl，10xBuffer(Mg2+) 1.5μl，正向引物(10 mM)0.3μl，負向引物(10 mM)0.3μl， dNTP (2.5 mM)0.4μl，Taq酶 (5U/μl)0.3μl，ddH2O 11.1μl。PCR擴增條件：94°C 預變性3 min，94°C變性 30s，56°C復性30s，72°C 延伸1 min，共32個循環，最后72°C延伸10 min。

2.4AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒純化PCR產物。

2.5測序反應 (1)測序PCR反應體系(10μl)： 純化的PCR產物2μl，測序引物NF 1μl，BigDye 2μl，ddH2O 5μl。(2)測序PCR擴增條件：96℃變性2 min后進行PCR循環，PCR循環參數為96℃ 10s，50℃ 5s，60℃3Min10s，30個循環。(3)測序反應的純化后上測序儀ABI 3730XL測序儀測序。

2.6序列變異分析結果 家系中正常人和患者SCN4A基因的第10外顯子的變異位點為第118位核苷酸由腺嘌呤核苷酸變異為鳥嘌呤核苷酸，導致其所編碼的氨基酸由Ser(絲氨酸)變為Gly(甘氨酸)，單核苷酸多態(SNP)編號為rs6504191，該核苷酸位于轉錄本NM000334的第1647位。家系中正常人和患者SCN4A基因的其他外顯子未發現變異。

3 討論

PC的顯著癥狀是寒冷或運動誘發的骨骼肌強直，與先天性肌強直不同的是PC無運動后強直緩解所謂溫熱現象(warm-up phenomenon)。診斷PC主要依靠臨床特征[1]。肌強直放電有助于診斷，但肌強直放電受溫度影響。當溫度低于28°C時，肌電圖檢查會出現纖顫電位；當溫度低于20°C時，肌強直性放電消失[2]。有些患者，室溫下肌電圖檢查可完全正常[3]。因此，依靠肌電圖所見肌強直放電診斷PC不可靠。本家系肌電圖檢查未出現肌強直性放電可能是檢查條件限制所致。本家系臨床特征符合PC診斷條件，短時和長時運動誘發肌電圖也支持診斷。

目前對于PC的分子遺傳學研究文獻報道集中于SCN4A基因，該基因位于17q23-q25.3。Park JH等報道一韓國PC家系患者的致病突變位點為SCN4A G1306V[4]。Koch MC等[5]報道一德國PC家系患者的致病突變位點為SCN4A Val1293Ile。然而Schose BGH等[6]對另一德國4代17例患者的PC大家系研究發現致病位點是SCN4AA1481D。Davies NP等[7]研究發現一愛爾蘭PC家系的致病突變是SCN4AG4367A。Sallansonnet-Froment M等[8]報道法國一PC家系的致病位點在SCN4AArg1448Cys。Kinoshita M等[9]報道日本一PC家系的致病位點在SCN4A Thrl313Met。Parasivam S等[10]發現澳大利亞PC家系的致病位點在SCN4AT1313。Feng Y等[11]研究發現中國伴有周期性麻痹的PC家系的突變位點在SCN4AMet1592Val。Matthew E等[12]對來自英國的42例PC患者，其中包括28例有血緣關系的PC患者進行研究，結果發現R1448L 和L1436P兩個新的致病位點，同時也發現10例(包括8例有血緣關系)PC無SCN4A無突變。Sampaolo S等[13]報道一意大利PC家系的SCN4A基因既無突變也無異常剪切。由此可見，PC存在遺傳異質性。本研究對SCN4A基因的24個外顯子測序未發現致病突變，初步排除了SCN4A基因為該中國PC家系的致病基因。該中國PC家系的致病基因有待進一步研究。

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PreliminarystudyofcausativegeneforaChinesefamilyparamyotoniacongenital

SANGDao-qian,TANXin-yu,CHENJing,etal.

DepartmentofNeurology,TthefirstAffiliatedHospitalofBengbuMedicalCollege,AnhuiBengbu233004,China

ObjectiveTo study the causative gene in a Chinese family paramyotonia congenital(FPC).MethodsDNA sequencing analysis for exons of alpha subunit type Ⅳ of voltage-gated sodium channel (SCN4A) was conducted between affected and normal individuals of the Chinese FPC and other normal people, each other.ResultsUnexpectly, no causative mutation for the Chinese FPC was found in SCN4A.Conclusionthe Chinese FPC has no relationship with SCN4A.

233004 蚌埠醫學院第一附屬醫院神經內科(桑道乾 陳靜 時鵬 許文芳 陳齊鳴)；中國科學院北京基因組研究所(談昕煜 胡松年)