紫花苜蓿高效遺傳轉化受體系統的建立

王文斌，王 琳

（山西農業大學生命科學學院，山西太谷030801）

紫花苜蓿是世界上種植面積最大，應用最為廣泛的豆科牧草，素有“牧草之王”的美稱，產業化市場前景廣闊[1-3]。其不僅富含蛋白質、多種維生素和礦物質[4-6]，而且其發達的根系還具有防風固沙和保持水土等重要的生態功能[7-8]。但是干旱、鹽漬等多種逆境限制了它的推廣和應用。

國內外已有將外源基因導入紫花苜蓿獲得再生植株的報道，而異源目的基因的高效遺傳轉化有賴于植物高頻再生體系的建立[9-10]。在植物遺傳轉化的研究中，通過愈傷組織再生植株的方法，有利于保持原有品種的優良性狀，再通過轉移控制特定性狀的目的基因，從而達到改良其品質或其他特性的目的。

本試驗以新疆大葉和新牧一號苜蓿下胚軸、子葉為材料，研究不同基因型、外植體、培養基及激素配比對其愈傷組織誘導和分化的影響，旨在建立針對這2個品種的高頻轉化受體系統，為苜蓿的遺傳轉化奠定堅實的基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試紫花苜蓿品種為新疆大葉（Medicago sativa L.cv.Xinjiang Daye）、新牧一號（Medicago sativa L.cv.Xinmu No.1），均由新疆農業大學草業工程學院張博教授惠贈。試驗采用5 d苗齡的紫花苜蓿無菌苗子葉和下胚軸為外植體。

1.2 主要試劑及培養基

1.2.1 主要試劑 SH鹽，使用濃度為3183.25mg/L；SH維生素，使用濃度為1 010.5 mg/L；MS，含MS鹽和維生素，使用濃度為 4 405.19 mg/L；2，4-D，用少量95%乙醇溶解后加蒸餾水配制成1 mg/mL貯備液，4℃保存；KT，BAP，NAA，IBA，分別用少量 1 mol/L KOH溶解后加蒸餾水配制成1 mg/mL貯備液，4℃保存；以上試劑均購自Sigma公司。

1.2.2 基本培養基 試驗以MS（含MS鹽和MS維生素）和SH（含SH鹽和SH維生素）為基本培養基；進行愈傷誘導、分化和生根時，分別添加不同濃度的植物生長激素和細胞分裂素，附加30 g/L蔗糖、7 g/L植物瓊脂；1/2 MS培養基中，MS成分減少1/2，其他成分不變。所有培養基的pH值均為5.7，121℃高壓滅菌15 min，分裝備用。

1.3 試驗方法

1.3.1 種子消毒及無菌苗培養 選取籽粒飽滿種子，簡單沖洗1 min，轉入無菌離心管，每管約為100粒種子，70%酒精中浸泡30s，無菌水沖洗3次；然后在0.5%NaClO中消毒5 min，再用無菌水沖洗7～8次。接種于無激素的1/2 MS培養基，封口膜密封，（25±2）℃暗培養 2 d，再于（25±2）℃、光強150 μmol/（m2·s）及16 h/8 h光周期條件下培養3 d。

1.3.2 愈傷組織誘導 選取5 d苗齡的健康幼苗，分別切取下胚軸（下胚軸切成0.5 cm左右的小段）和子葉（子葉沿靠近子葉柄的部位橫切，去距葉柄葉面積的1/3，余2/3面積的子葉），作為愈傷誘導的外植體，分別接種于不同愈傷誘導培養基。供試培養基及激素配比為：MS＋2 mg/L 2，4-D＋0，0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30，0.50 mg/L KT；SH＋2 mg/L 2，4-D＋0，0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30，0.50 mg/L KT；MS＋2 mg/L 2，4-D ＋1 mg/L BAP＋4 mg/L NAA[11-12]。每 90 mm（直徑）×15 mm（高）的培養皿接種20塊，每種外植體、每個激素水平設置80～100塊，16 h/8 h光周期培養，溫度（25±2）℃、光強150 μmol/（m2·s）。每隔2周繼代培養一次，繼代培養基同愈傷誘導培養基。誘導4周后，觀察愈傷組織生長狀況，并統計出愈數，計算出愈率。

1.3.3 愈傷組織分化 下胚軸經愈傷誘導培養4周后，按愈傷組織的不同來源，各取60～80塊，分別接入MS和SH（均添加1.0 mg/L BAP和0.3 mg/L NAA）芽分化培養基，每100 mm（直徑）×40 mm（高）的培養皿接種10塊，16 h/8 h光周期培養，（25±2）℃、光強150 μmol/（m2·s）。每2周繼代培養一次，繼代培養基同芽分化培養基。誘導8周后，統計再生芽的愈傷組織數，計算分化率。

1.3.4 根的誘導 不同來源的愈傷組織在芽分化培養基上誘導30～50 d后可生成芽，待無根小苗長至2～3 cm時，從基部切下，移入1/2 MS或1/2 MS＋1 mg/L IBA生根培養基上進行根的誘導，每100 mm（直徑）×40 mm（高）的培養皿接種10個，培養條件同芽分化，觀察并統計生根情況。

1.3.5 擴繁及移栽 再生苗的擴繁培養基與生根培養基相同，切取抗性苗頂芽或帶1個腋芽的莖段接入擴繁培養基，培養條件同芽分化。觀察并統計生根情況。當再生的小植株出現3條以上健壯根時，稍打開培養皿蓋，室內鍛煉1～2 d后再將幼苗從培養皿中取出，小心用流水沖凈根部附著的培養基，移栽于盛有花土的小花盆中，花土需經浸水過夜。最初3～5 d，盛裝小花盆的容器可遮上塑料薄膜以保持濕度，當小苗長出健壯莖葉時，可將其移入大花盆中。

1.4 測定項目及方法

出愈率＝產生愈傷組織的外植體數/接種的外植體數×100%；分化率＝分化出芽的愈傷組織數/接種的愈傷組織數×100%；生根率＝生根的植株數/接種的無根小苗數×100%。

2 結果與分析

2.1 不同基本培養基對愈傷誘導的影響

試驗首先以新疆大葉下胚軸為材料，研究不同的基本培養基對愈傷誘導的影響，結果表明，接種到MS培養基（含2 mg/L 2，4-D）上培養4周后，出愈率達86.5%；而接種到SH培養基（含2 mg/L 2，4-D）上時，愈傷組織開始發生的時間相對較遲，但最終出愈率為83.5%，與在MS培養基上培養之間無明顯差異。

2.2 不同基因型、外植體和激素配比對愈傷誘導及其生長狀況的影響

從表1可以看出，在MS并附加各種激素的培養基上，無論對于下胚軸還是子葉外植體，2種基因型苜蓿間出愈率均沒有明顯差異；而在SH培養基上，新牧一號下胚軸和子葉的出愈率均高于新疆大葉，但基因型間愈傷組織的形態特征及生長速率沒有明顯差別。

激素配比對愈傷組織誘導影響較大。在MS和SH這2種培養基上，KT濃度為0.2 mg/L時，出愈率達到最大，下胚軸出愈率92.7%～98.5%，子葉出愈率80.4%～85.6%。在含2 mg/L 2，4-D，1.0 mg/L BAP和4.0 mg/L NAA的MS培養基上，下胚軸和子葉的出愈率明顯小于在MS或SH培養基上附加0.2 mg/L KT時的出愈率，愈傷組織呈黃色團塊狀，質地堅硬。下胚軸和子葉不同外植體在相同培養條件下的愈傷組織誘導率差異較為明顯。在各種培養基及激素配比下，下胚軸愈傷啟動時間短，在第3～5天時，就開始有愈傷組織形成，而子葉最早要到第7天，而且下胚軸的出愈率明顯高于子葉。

表1 不同基因型、外植體和激素配比對愈傷誘導的影響

綜合評價，MS＋2 mg/L 2，4-D＋0.2 mg/L KT 培養基適用于新疆大葉下胚軸和子葉的愈傷誘導，SH＋2 mg/L 2，4-D＋0.2 mg/L KT適用于新牧一號。

2.3 不同愈傷組織來源及培養基對愈傷組織分化的影響

為了進一步比較不同培養基、激素及基因型對下胚軸外植體再生的影響，選擇了4個試驗組合（表2）分析其再生率。

表2 不同的培養基組合

從MS和SH（均附加2 mg/L 2，4-D和0.2 mg/L KT）培養基中分別挑選不同基因型下胚軸來源的新鮮淡綠色愈傷組織，接種到MS和SH（附加1.0 mg/L BAP和0.3 mg/L NAA）的培養基上，進行愈傷組織的分化培養。在2種培養基上培養1周后，愈傷組織表面均開始出現綠色芽點（圖1-A），并逐漸轉變為成熟的胚狀體（圖1-B，C）。繼續培養4～6周后，部分愈傷組織分化出芽（圖1-D）。

從分化培養8周后統計的分化率結果（表3）可以看出，相同來源的愈傷組織在MS培養基上的分化率均高于SH培養基，表明培養基類型對愈傷組織的分化影響較大，添加1 mg/L BAP和0.3 mg/L NAA的MS培養基更加適宜不定芽誘導。

表3 不同基因型下胚軸在不同組合條件中的再生率

2.4 生根、擴繁及移栽情況

在愈傷組織分化誘導培養基上培養30～50 d后，將長至2～3 cm的再生芽從愈傷組織基部切下，轉入不含激素的1/2 MS培養基，7～10 d即可生根，生根率達100%。選取抗性苗頂芽或帶1個腋芽的莖段接入不含激素的1/2 MS培養基誘導生根，結果發現，在擴繁培養第2代后，生根過程明顯推遲至第15～20天，而且多為短而粗的主根，很少出現不定根。為此，向1/2 MS培養基中添加1 mg/L IBA，生根過程略有提前，并有不定根形成（圖1-E）。將出現3條以上健壯根的再生小植株經室內鍛煉后移入小花盆（圖1-F），成苗率達100%。

2.5 不同培養基及激素組合下植株的比較

由表3還可知，對于新疆大葉而言，盡管組合Ⅰ，Ⅱ中的出愈率略高于組合Ⅲ，Ⅳ，但分化率明顯降低，并由此導致再生率降低，下胚軸再生率最高的為組合Ⅲ，達46.54%；而新牧一號下胚軸在組合Ⅲ，Ⅳ中的出愈率及分化率均高于組合Ⅰ，Ⅱ，所以再生率也顯著提高，其中組合Ⅲ的再生率達54.96%。

3 討論與結論

多數研究認為，基因型對苜蓿的再生能力影響較大。馬海燕等[13]研究表明，以下胚軸為外植體，在MS＋2 mg/L 2，4-D＋2 mg/L NAA＋1 mg/L KT 培養基上培養2周內，新疆大葉和新牧一號的出愈率均達92%以上，且新疆大葉略優于新牧一號；至4周時，二者愈傷誘導無顯著差別，在附加15 mg/L GSH＋6 mg/L ABA的MS分化培養基上，新疆大葉的分化率高于新牧一號。而蘭研[14]的研究則認為，以葉片為外植體，在同樣的培養基上新疆大葉出愈率較新牧一號高，但在MS＋4 mg/L KT的分化培養基上，新牧一號的綠點率及成苗率高于新疆大葉。可見，不能簡單判斷二者再生能力的大小，所謂再生能力的強弱是基于其所處的培養條件。本試驗中，盡管新疆大葉和新牧一號的再生能力也存在一定差異，如在SH＋2 mg/L 2，4-D＋0.2 mg/L KT培養基上新疆大葉的出愈率略高于新牧一號，而在其他培養基上新牧一號則高于新疆大葉，但差異不顯著，2種基因型下胚軸來源的愈傷組織的分化能力也無明顯差異。由此可見，在本試驗中，基因型對苜蓿的再生能力并沒有顯著影響，但需要說明的是，這個結論的得出基于試驗中所采用的相同的外植體、培養基類型及激素配比這個前提條件。

在植物離體培養的過程中，外植體的內源激素水平不斷變化，在培養基中添加不同種類、不同濃度的生長調節物質可以影響內源激素的水平，從而影響外植體的生長狀況，控制細胞脫分化和形態建成[15]。一些試驗結果顯示，低濃度的細胞分裂素能夠提高愈傷組織的誘導率[16]。在本試驗中，也得到了類似的結果，在愈傷組織的培養階段，KT能輔助2，4-D發揮更好的效果，0.2 mg/L是KT對于下胚軸愈傷組織誘導及生長最適宜的濃度，過高濃度的KT反而會降低愈傷組織的誘導率。這也與潘競麗等[16]的研究以及王涌鑫等[17]對保定苜蓿的研究結果相一致。但肖燕等[12]以2mg/L2，4-D＋1mg/L BAP＋4 mg/L NAA的激素配比成功從新疆大葉和新牧一號下胚軸誘導出愈傷組織，且培養4周時出愈率達100%；而本試驗中盡管通過該培養基也誘導出愈傷組織，但出愈率較低，最高出愈率僅為86.7%，愈傷組織狀況也不如附加2 mg/L 2，4-D＋0.2 mg/L KT的培養基，這可能是由于試劑不同所造成的，具體的原因還有待進一步分析。借鑒馬暉玲等[18]的研究，本試驗中愈傷組織在含1.0mg/LBAP和0.3 mg/L NAA的培養基上也成功分化出芽，且分化率最高達到55.8%。

幾乎苜蓿所有器官或組織都可以作為外植體，但對于不同的基因型、在不同的培養條件下，合適的外植體選擇也是決定再生體系成功的一個關鍵因素。近年來，在紫花苜蓿再生體系建立的研究中，子葉和下胚軸是較常用的外植體[12，19-21]，且下胚軸的愈傷誘導率高于子葉。本試驗結果也表明，無論是對于不同的基因型，還是不同的培養基、不同濃度的KT，下胚軸的愈傷誘導率均明顯高于子葉，下胚軸最高出愈率達98.5%，子葉最高為85.6%，而且下胚軸愈傷啟動時間短，愈傷質量較好。

愈傷組織的誘導和分化對培養基的需求是不同的。在愈傷組織誘導階段，新疆大葉在MS培養基上的出愈率略優于SH培養基，新牧一號則相反，但是愈傷組織的分化率結果證明，來源于SH培養基的愈傷組織分化能力要明顯高于MS培養基。在愈傷組織分化階段，含相同激素的MS分化培養基要優于SH培養基。受不同培養基的影響，植株的再生率也出現顯著差異。由此可見，對于2種苜蓿而言，SH更加適宜愈傷組織的誘導，而MS培養基更利于愈傷組織的分化。

綜上所述，適用于2種苜蓿愈傷組織誘導、分化及生根培養的培養基分別為SH（附加2 mg/L 2，4-D 和 0.2 mg/L KT），MS（附加 1.0 mg/L BAP和0.3 mg/L NAA）和 1/2 MS（擴繁時附加 1 mg/L IBA）。

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