擬南芥HSP70基因啟動子表達載體的構建及在煙草BY2細胞中的應用

鄭 幫，陳 燕，褚艷霞，孫虎林，鄭亞潔，孫恒吉，司英語，周樹敏，張 衛

(上海大學 生命科學學院，上海200444)

0 引言

熱激蛋白HSP70是擬南芥HSP70基因家族中的一種，其表達會隨著溫度的升高而增強，即熱激特性［1］．這種熱激特性是由熱激蛋白HSP70的啟動子決定的，因此擬南芥的HSP70基因啟動子也成為研究的熱點之一．在以擬南芥植株為實驗材料，將含有擬南芥的HSP70基因啟動子的表達載體轉入其中進行表達．受到植株生長周期長的影響，會造成實驗周期長，對實驗進展造成一定的影響．煙草BY2細胞(Nicotiana tabacum L．cv Bright Yellow2，BY2)是非常重要而且用途廣泛的細胞系［2－3］，由 Kato 等于1972年分離得到［4］．BY2細胞可以比較容易地轉化外源基因，此外，BY2細胞系擁有高度的同一性，且生長迅速，可獲得具高度同周期性的BY2細胞，1周內便可增加80～100倍．因此，BY2細胞已成為研究生物研究的模式系統［5］，而且轉基因BY2細胞團和懸浮培養細胞都較容易獲得．因此若能將含有擬南芥的HSP70基因啟動子且以GFP為報告基因的表達載體轉入其中，且可正常表達報告基因，則可明顯縮短實驗周期，對熱激蛋白HSP70啟動子的后續實驗研究提供大量豐富的實驗材料．

1 材料

1．1 植物材料

本實驗室自有擬南芥Columbia生態型(Arabidopsis thaliana)，置于溫度為22℃，光照為16 h光照，8 h黑暗的人工光照溫室培養［6］．實驗室自有液體懸浮煙草 BY2細胞，27℃，130 r/min，暗培養［7］．培養基配方見參考文獻

1．2 引物和試劑

在www．arabidopsis．org網站下載HSP70啟動子的序列并依據啟動子的序列設計引物，在上下游引物兩端分別加入HindⅢ和Sac1酶切位點．長度選取轉錄起始點至上游1．5 kbp．實驗所用引物如表1所示．

實驗室自有GFP－T質粒．GFP基因序列已經測序驗證且正確．

表1 實驗所用引物

引物合成由上海生工生物工程公司進行合成．

PCR擴增采用takara公司生產的KOD PCR擴增試劑盒．PCR擴增參數為:

膠回收試劑盒由takara公司生產的膠回收試劑盒進行膠回收．

pMD18－T載體和連接酶Solution I由TAKARA公司生產．連接體系(10μL)如下所示:

2 方法

2．1 基因組抽提

采用試劑盒抽提基因組的方法．試劑盒購自康為世紀生物技術公司．

2．2 表達載體的構建流程

2．3 轉化入農桿菌

將構建好的表達載體采用熱激轉化的方法轉入農桿菌GV3101，并對農桿菌菌落進行陽性克隆的篩選和鑒定．轉化方法詳見參考文獻［8－9］．

2．4 轉基因

(1)將鑒定已經轉入表達載體的農桿菌GV3101陽性克隆劃板，且挑取單克隆進行小型搖培(5 mL)，繼而進行轉基因操作．具體轉化步驟:

(2)從農桿菌平板上挑取單菌落于2 mL LB培養基，250 r/min，28℃過夜，OD600至0．6．

(3)洗農桿菌:1 mL菌液:2500 g離心10 min，室溫，去上清，加入1 mL 10 mmol/L MgSO4，混勻，2500 g離心10 min，去上清，加入1 mL 10 mmol/L MgSO4，混勻，加入2μL 200 mmol/L As(有利于轉化，也可不加)，室溫靜置2 h．

(4)分裝懸浮培養的煙草BY2細胞5 mL于小培養皿中(一般1個基因做2個，1個空白對照)，用移液器吹打20次，誘導缺口，有利于轉化．

(5)加入100μL處理好的農桿菌，輕輕搖勻，對照加入100 lL ddH2O．

(6)28℃靜置暗培養48 h．

(7)每個培養皿中加入5 mL BY2液體培養基輕輕搖勻．

(8)轉入50 mL EP管，用BY2液體培養基補到總體積25 mL．

(9)1000 g離心5 min，室溫．

(10)小心倒去上清，均勻倒在含有潮霉素的BY2固體培養基平板．

(11)28℃靜置培養3周．

2．5 陽性克隆細胞團的篩選

轉基因BY2細胞轉化后約3周可在50μg/mL的潮霉素和萬古霉素抗性平板上長出陽性單克隆的細胞團，潮霉素起到篩選陽性克隆的作用，萬古霉素起抑制農桿菌的生長，并將所篩選到的陽性單克隆細胞團移出至新的50μg/mL的潮霉素抗性平板傳接一代，再接至液體培養基培養傳代，如圖1所示:

圖1 轉化后的BY2細胞傳代

3 結果

3．1 HSP70啟動子克隆

從擬南芥基因組中PCR擴增HSP70啟動子(圖2)和HSP70啟動子與T－載體連接后的酶切(圖3)鑒定電泳圖．

圖2 PCR擴增HSP70啟動子

圖3 HSP70啟動子與T－載體連接后酶切鑒定

將HSP70啟動子測序結果與NCBI網站的原始序列進行比對，測序結果和原始序列完全匹配，無缺失、錯配等．

HSP70啟動子序列如圖4所示．

圖4 HSP70啟動子序列

3．2 表達載體的鑒定

將構建好的表達載體陽性克隆抽提質粒并進行酶切鑒定．對HSP70啟動子采用HindⅢ和Sac I進行雙酶切鑒定(圖5)，對GFP采用BamH I和Sal I進行雙酶切鑒定(圖6)，并用HindⅢ和Sal I進行雙酶切切出HSP70啟動子加GFP片段(圖7)，分別切出1．5 kb條帶，750 bp條帶，2．25 kb條帶以及剩余的載體條帶．酶切鑒定結果如圖7．

3．3 轉基因BY2細胞鑒定

對篩選到的陽性細胞團基因組進行PCR鑒定，PCR擴增條帶包括GFP及HSP70啟動子部分片段，長度約為550bp，抗性平板共篩選到11個陽性細胞團，PCR鑒定結果如圖8．

圖5 HSP70啟動子酶切鑒定

圖6 GFP酶切鑒定

圖7 HSP70啟動子和GFP酶切鑒定

圖8 轉基因細胞PCR鑒定

3．4 熒光觀察

通過采用激光共聚焦熒光顯微鏡對轉基因和非轉基因即野生型(WT)BY2細胞的熒光觀察發現，野生型即非轉基因BY2細胞有極其微弱的自發熒光，幾乎看不到，但轉基因BY2細胞的熒光要遠遠強于野生型BY2細胞(圖9)．同時對野生型和熒光強度進行定量(圖10)．RT－PCR結果證明野生型BY2細胞中并無GFP的表達，而轉基因BY2細胞中表達很強(圖11)．

圖9 BY2細胞熒光觀察

圖10 熒光定量結果

圖11 RT－PCR結果

4 討論

擬南芥的HSP70基因啟動子是一種熱激起動子，對其的研究一直是現代生物學的熱點，其表達的強弱受到受到多方面因素的影響，如外界溫度，自身啟動子的順式元件以及反式元件的協同作用［1］．隨著現代分子生物學的發展，實驗操作的很多環節均可采用試劑盒來快速完成實驗的操作，大大節省了時間，但是植物種植的時間很難縮短，因此在實驗材料的獲得上往往會限制實驗的進展速度，具體以擬南芥為例，其生育周期常為42～56 d，在生長到20 d左右時可以轉化，收到種子干燥10 d后才可篩選陽性苗，在篩選陽性苗的過程中還要經過春化，發苗等過程，在陽性苗生長到可以取材進行時，后續實驗還要生長一段時間［10］，且植株生長周期有限，有幼苗期和衰老時期不可能隨時進行取材，但是液體懸浮培養的BY2細胞生命周期短，轉接傳代操作簡單，可隨時取材進行觀察，省去植物種植的時間，因此將擬南芥的HSP70基因啟動子表達GFP的表達載體轉入液體懸浮培養的BY2細胞，可在一次轉化后大量傳接培養，4～7 d便可傳代培養一次，相比于種植一代植物可節省大量時間，可明顯縮短后續實驗的周期，且由于液體懸浮培養的BY2細胞繁殖快，可大量傳接，因此可以獲得大量的實驗材料，從而利于對擬南芥的HSP70基因啟動子的研究，并對其他基因的研究提供可借鑒的思路．

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