脂肪間充質干細胞對野百合堿誘發的肺動脈高壓大鼠肺動脈鈣離子通道的影響*

鄭蘇梨， 謝良地， 李宏亮， 梁敏烈， 許昌聲

(福建醫科大學附屬第一醫院，福建省高血壓研究所，福建 福州 350005)

·論著·

脂肪間充質干細胞對野百合堿誘發的肺動脈高壓大鼠肺動脈鈣離子通道的影響*

鄭蘇梨， 謝良地△， 李宏亮， 梁敏烈， 許昌聲

(福建醫科大學附屬第一醫院，福建省高血壓研究所，福建 福州 350005)

目的探討脂肪間充質干細胞(adipose tissue-derived mesenchymal stem cells，ADMSCs)移植對野百合堿(monocrotaline,MCT)誘發的肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)大鼠肺動脈鈣離子通道的影響。方法膠原酶消化法分離培養ADMSCs。雄性SD大鼠24只，分為正常對照組(Ctr組)、PAH組和ADMSCs組，每組8只。右心導管法測定大鼠的平均肺動脈壓(MPAP)；稱重法測右心室肥厚指數(RVHI)；分別用RT-PCR及Western blotting法測定大鼠肺動脈干電壓門控性鈣離子通道α1c亞基(CaVα1c)肌漿/內質網Ca2+ATP酶2a(SERCA-2a)、三磷酸肌醇受體1(IP3R-1)、瞬時受體電位通道1(TRPC1)和TRPC6 mRNA和蛋白的表達水平。結果(1)MCT注射4周后，與Ctr組相比， PAH組大鼠MPAP和RVHI均顯著升高(P<0.05)；ADMSCs移植2周后，與PAH組相比，ADMSCs組MPAP和RVHI均明顯降低(P<0.05)。(2)與Ctr組相比，PAH組大鼠肺動脈CaVα1c、TRPC1和TRPC6 mRNA及蛋白表達水平均明顯增強(P<0.05)，SERCA-2a 和IP3R-1 mRNA及蛋白表達水平均明顯降低(P<0.05)；與PAH組相比，ADMSCs組CaVα1c、TRPC1和TRPC6的表達均明顯降低(P<0.05)，SERCA-2a 和IP3R-1的表達均明顯增強(P<0.05)。結論ADMSCs能有效地降低MCT誘發的PAH大鼠的肺動脈壓力，減輕右心室肥厚。ADMSCs降低肺動脈壓力可能與鈣離子通道變化有關。

脂肪間充質干細胞； 肺動脈高壓； 鈣通道

肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)是一種難治性疾病，以肺動脈壓力和肺血管阻力升高為主要特點，可逐漸進展為右心室衰竭，甚至死亡。肺血管重構，最終導致肺小動脈管腔的阻塞，是肺動脈高壓的主要發病機制[1]。肺動脈平滑肌細胞內游離Ca2+濃度(intracellular free calcium，[Ca2+]i)升高是引起肺血管收縮的重要因素。電壓門控性鈣離子通道α1c亞基(voltage-gated calcium channel α1c subunit, CaVα1c)、肌漿/內質網Ca2+ATP酶 2a(sarcoplasmic/endoplasmic reticulum cal-cium ATPase 2a,SERCA-2a)、三磷酸肌醇受體 1(inositol 1,4,5-triphosphate receptor 1, IP3R-1)和瞬時受體電位通道[2](transient receptor potential channel,TRPC)是調節[Ca2+]i的重要鈣離子通道亞基。我們先前的研究證實[3]，PAH大鼠肺動脈存在CaVα1c、SERCA-2a和IP3R-1的表達異常。目前用于治療PAH的藥物主要有鈣離子通道阻滯劑、前列腺素類、內皮素受體拮抗劑、磷酸二酯酶抑制劑等，但療程長，費用昂貴，而且療效有限。近年來，國內外一些研究表明移植干細胞有助于改善肺血管的內皮功能，降低肺動脈壓力并且改善肺小動脈的重構[4-6]。脂肪間充質干細胞(adipose tissue-derived mesenchymal stem cells，ADMSCs)是從脂肪組織中分離出的多潛能干細胞，具有促進血管生成、抑制炎癥等特性[7-8]。而且，ADMSCs來源豐富，易獲取，無倫理學上的限制，具有良好的應用前景。本文主要研究ADMSCs移植對野百合堿(monocrotaline,MCT)誘導的PAH大鼠肺動脈鈣離子通道的影響，探討ADMSCs治療PAH的可能性及其機制。

材 料 和 方 法

1脂肪間充質干細胞的培養

無菌條件下取雄性SD大鼠(100～150 g，上海斯萊克實驗動物有限責任公司)雙側腹股溝皮下脂肪，參照文獻[9-10]報道的方法分離培養ADMSCs。取生長良好的第3代ADMSCs，融合達50%時，加入感染復數為100的Ad5-EGFP重組腺病毒感染ADMSCs。

2動物分組及肺動脈高壓模型建立

雄性SD大鼠24只(200～230 g，上海斯萊克實驗動物有限責任公司)，隨機分為3組，每組8只：正常對照組(Ctr組)、MCT誘導組(PAH組)和MCT誘導+ADMSCs治療組(ADMSCs組)。PAH組和ADMSCs組均按文獻報道[11-12]的方法配制MCT(Sigma)，予腹腔一次性注射40 mg/kg，正常對照組給予等體積生理鹽水腹腔注射。

3脂肪間充質干細胞移植

MCT注射后2周，胰酶消化綠色熒光標記的ADMSCs，調整細胞懸液密度為1×109cells/L，ADMSCs組經頸外靜脈移植ADMSCs細胞1 mL，鏈霉素1×105U肌肉注射預防感染。Ctr組及PAH組給予等體積生理鹽水。實驗結束后，取ADMSCs組肺組織行冰凍切片，觀察綠色熒光標記細胞在肺組織中的定植。

4血流動力學檢測

按孫波等[13]的報道，在本實驗室建立測定大鼠平均肺動脈壓(mean pulmonary arterial pressure, MPAP)的方法，MCT注射4周后測量各組MPAP。

5肺組織HE染色切片制作

血流動力學檢測后，打開胸腔取出整個心肺，肺動脈干保存在液氮罐內，右肺中葉組織塊以10%甲醛溶液固定1 d。常規石蠟包埋，沿右肺門水平橫切，片厚5 μm。切片進行HE染色，制成病理切片。光鏡下觀察肺小動脈病變。

6右心室肥厚指數(rightventricularhypertrophyindex,RVHI)的測定

取出整個心臟，沿房室溝剪去心房及大血管根部，用剪刀沿后室壁間溝將右心室切下，濾紙吸水后稱右心室游離壁(right ventricular,RV)及左心室+室間隔(left ventricular and ventricular septum,LV+S)的重量，并計算RVHI：RVHI=RV/(LV+S)。

7RT-PCR檢測

從液氮中取出肺動脈干，采用Invitrogen公司Trizol試劑盒提取總RNA，752-C紫外分光光度計測定其純度及含量。按照Promega公司試劑盒說明書進行cDNA第1鏈的合成，采用Primer 3.0軟件設計PCR引物(表1)，進行擴增(MyGene 32 Thermal Block PCR儀)。以大鼠GAPDH mRNA為內參照，進行半定量分析，比值表示其相對含量。

表1 RT-PCR引物序列

8Westernblotting檢測

提取總蛋白后，Bradford法測定各樣品蛋白質濃度，經SDS-PAGE分離，1 mA/cm2轉膜,5%脫脂奶粉中室溫下封閉1 h，抗CaVα1c抗體(1∶200，Alomone Labs)和抗SERCA-2a抗體(1∶1 000，Abcam)、抗IP3R-1抗體(1∶1 000，Millipore)、抗TRPC1抗體(1∶200，Alomone Labs)和抗TRPC6抗體(1∶200，Alomone Labs)4 ℃孵育過夜。加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的Ⅱ抗(1∶2 000，北京中杉金橋生物技術有限公司)，37 ℃孵育1 h，電化學發光法(ECL)顯影。以β-actin作為內參照，進行半定量分析，比值表示其相對含量。

9統計學處理

數據以均數±標準差(mean±SD)表示。采用SPSS 11.5統計軟件分析。組間均數比較采用One-way ANOVA檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1ADMSCs治療對MCT誘發的PAH大鼠血流動力學的影響

與Ctr組相比，PAH組的MPAP及RVHI均明顯升高(P<0.01)；與PAH組相比，ADMSCs組MPAP及RVHI均顯著降低(P<0.01)，見表2。

表2ADMSCs治療對大鼠血流動力學的影響

Table 2. Effects of ADMSCs transplantation on mean pulmonary arterial pressure (MPAP) and right ventricular hypertrophy index (RVHI) of rats (Mean±SD.n=8)

GroupMPAP(mmHg)RVHICtr15.03±0.8725.67±1.26PAH32.22±0.71**53.44±2.13**ADMSCs21.87±0.78△△38.97±1.59△△

**P<0.01vsCtr group;△△P<0.01vsPAH group.

2肺小動脈顯微結構觀察

Ctr組大鼠肺小動脈管壁厚薄一致，管腔內膜結構完整，血管周圍僅有少量結締組織，見圖1A；PAH組大鼠肺小動脈管壁增厚、管腔縮小，管腔內膜結構不完整或斷裂，血管周圍有大量結締組織增生，管壁有大量細胞浸潤，見圖1B；ADMSCs組大鼠肺小動脈管壁厚度輕度增加，較均勻，管腔縮小不明顯，見圖1C。

3ADMSCs在大鼠肺組織定植

冰凍切片熒光觀察， ADMSCs組大鼠的肺組織血管中可見綠色熒光細胞分布，Ctr組大鼠的肺組織未見綠色熒光信號，見圖2。

Figure 1. Effects of ADMSCs on histological changes of small pulmonary arteries (HE staining,×100). A: Ctr group;B: PAH group;C: ADMSCs group.

圖1大鼠肺小動脈組織學改變

Figure 2. GFP-labeled ADMSCs were observed in pulmonary tissues (×200).A,B:Ctr group;C,D:ADMSCs group.A,C:phase-contrast images;B,D:fluorescence images.The white arrow indicates GFP-labeled ADMSCs.

圖2GFP標記的ADMSCs定植于肺組織的熒光顯微鏡觀察

4ADMSCs治療對MCT誘發的PAH大鼠肺動脈鈣離子通道mRNA及蛋白的影響

4.1ADMSCs對PAH大鼠肺動脈CaVα1c表達的影響 與Ctr組相比，PAH組肺動脈CaVα1c mRNA及蛋白表達明顯增強(P<0.01)。ADMSCs組的CaVα1c表達水平較PAH組明顯降低(P<0.05)，見圖3。

4.2ADMSCs對PAH大鼠肺動脈SERCA-2a表達的影響 與Ctr組相比，PAH組肺動脈SERCA-2a mRNA及蛋白表達明顯降低(P<0.05)。與PAH組相比，ADMSCs組的SERCA-2a表達水平明顯增高(P<0.05)，見圖4。

4.3ADMSCs對PAH大鼠肺動脈IP3R-1表達的影響 與Ctr組相比，PAH組肺動脈IP3R-1 mRNA及蛋白表達明顯降低(P<0.05)。與PAH組相比，ADMSCs組的IP3R-1表達水平明顯增高(P<0.05)，見圖5。

4.4ADMSCs對PAH大鼠肺動脈TRPC1表達的影響 與Ctr組相比，PAH組肺動脈TRPC1 mRNA及蛋白表達明顯增高(P<0.05)。與PAH組相比，ADMSCs組的IP3R-1表達水平明顯降低(P<0.05)，見圖6。

4.5ADMSCs對PAH大鼠肺動脈TRPC6表達的影響 與Ctr組相比，肺動脈高壓組肺動脈TRPC6 mRNA及蛋白表達明顯增高(P<0.05)。與PAH組相比，ADMSCs組的TRPC6表達水平明顯降低(P<0.05)，見圖7。

討 論

本研究采用MCT成功誘導了PAH模型，PAH組MPAP和RVHI均明顯高于Ctr組，HE染色可見肺小動脈管壁增厚、管腔縮小，管腔內膜結構破壞，血管周圍結締組織增生。本研究發現，移植綠色熒光蛋白標記的ADMSCs后，大鼠肺組織血管中可檢測到熒光，說明ADMSCs定植在大鼠的肺組織內。陳明等[14]利用腺病毒感染標記ADMSCs，經靜脈移植后可歸巢于宿主特定組織并分化為內皮細胞，并認為ADMSCs對血管內皮有修復功能。本研究移植ADMSCs后，發現MPAP和RVHI較PAH組明顯降低，肺小動脈管壁結構改善，內膜完整，管腔面積擴大，說明ADMSCs可能通過定植并分化為內皮細胞，修復血管內皮屏障而起到延緩肺動脈高壓進展的作用。何志旭等[15]經靜脈移植骨髓間充質干細胞后發現，其可定植于肺間質，通過形成新生血管建立側枝循環，有效減輕MCT誘導的肺動脈高壓和肺組織病變程度。Liu等[16]研究也發現，移植自體脂肪間充質細胞可降低PAH大鼠平均肺動脈壓，改善肺小血管重構，同時肝細胞生長因子及一氧化氮合酶表達增加，進而促進肺血管再生。近年來對脂肪干細胞分泌蛋白質組的研究也發現[17-19]，脂肪干細胞可分泌血管內皮生長因子、轉化生長因子、肝細胞生長因子等多種可溶性因子，在血管生成、組織修復過程中發揮了重要作用。

Figure 3. Effects of ADMSCs transplantation on CaVα1c mRNA (A) and protein (B) levels in pulmonary hypertensive rats. Mean±SD.n=5.**P<0.01vsCtr group；△P<0.05vsPAH group.

圖3ADMSCs對PAH大鼠肺動脈CaVα1cmRNA及蛋白表達水平的影響

Figure 4. Effects of ADMSCs transplantation on SERCA-2a mRNA (A) and protein (B) levels in pulmonary hypertensive rats. Mean±SD.n=5.*P<0.05vsCtr group；△P<0.05vsPAH group.

圖4ADMSCs對PAH大鼠肺動脈SERCA-2amRNA及蛋白表達水平的影響

Figure 5. Effects of ADMSCs transplantation on IP3R-1 mRNA (A) and protein (B) levels in pulmonary hypertensive rats. Mean±SD.n=5.**P<0.01vsCtr group；△△P<0.01vsPAH group.

圖5ADMSCs對PAH大鼠肺動脈IP3R-1mRNA及蛋白表達水平的影響

Figure 6. Effects of ADMSCs transplantation on TRPC1 mRNA (A) and protein (B) levels in pulmonary hypertensive rats. Mean±SD.n=5.*P<0.05vsCtr group；△P<0.05vsPAH group.

圖6ADMSCs對PAH大鼠肺動脈TRPC1mRNA及蛋白表達水平的影響

Figure 7. Effects of ADMSCs transplantation on TRPC6 mRNA (A) and protein (B) levels in pulmonary hypertensive rats. Mean±SD.n=5.*P<0.05vsCtr group；△P<0.05vsPAH group.

圖7ADMSCs對PAH大鼠肺動脈TRPC6mRNA及蛋白表達水平的影響

目前研究認為PAH引起MPAP增高與肺血管痙攣收縮及重構密切相關[20]，也有研究認為血管壁增厚、血管重構與平滑肌細胞鈣離子通道表達異常有關[21]。Roberto等[22]研究發現，增殖型平滑肌細胞中IP3R、TRPC1、TRPC6等鈣離子通道蛋白表達明顯升高；Liu等[23]研究還發現，PAH大鼠肺動脈TRPC1和TRPC6表達明顯升高；Dinesh等[24]研究發現CaVα1c表達上調與RVHI增加及管壁增厚有關；Katharina等[25]認為SERCA表達下調導致平滑肌細胞過度增殖。本研究發現，與Ctr組相比，PAH組CaVα1c、TRPC1和TRPC6表達明顯增高，SERCA-2a和IP3R-1表達明顯降低。IP3R可引起肌漿網及內質網中鈣離子釋放，并通過“鈣誘導鈣釋放”途徑使得鈣離子持續釋放，亦誘導其它鈣離子通道的開放，另外細胞膜上CaVα1c、TRPC1和TRPC6等鈣離子通道表達的增加，可引起細胞外鈣離子內流增加，導致細胞內游離鈣離子濃度升高。而肌漿網及內質網上的SERCA-2a表達減少，導致鈣離子泵回減少，使得細胞內游離鈣離子濃度進一步升高。本實驗中，隨著肺動脈高壓的進展，細胞內游離鈣離子濃度處于持續高濃度狀態，反而抑制了IP3R的表達，Haeri等[26]也認為，IP3R與鈣離子濃度間存在非線性關系，高濃度的鈣離子對IP3R有抑制作用。同時，我們還發現，與PAH組相比，ADMSCs組CaVα1c、TRPC1和TRPC6表達明顯降低(P<0.05)，SERCA-2a 和IP3R-1表達較PAH組明顯增強(P<0.05)，提示ADMSCs可調節鈣離子通道的表達。遺憾的是，本實驗沒有動態觀察肺動脈高壓進展過程中鈣離子通道的變化及細胞內游離鈣離子濃度的變化。

總之，本研究證實肺動脈高壓時存在鈣離子通道表達異常，可導致細胞內游離鈣離子濃度升高促進肺血管收縮。我們推測ADMSCs通過調節鈣離子通道表達，進而調節細胞內游離鈣離子濃度而延緩肺動脈高壓的進展。但本研究中ADMSCs對鈣離子通道的影響是由于其組織修復作用還是繼發于肺動脈壓力下降后的作用仍未明確，有待進一步深入研究。

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Effectsofadiposetissue-derivedmesenchymalstemcellsoncalciumchannelsofpulmonaryarteryinratswithpulmonaryarterialhypertensioninducedbymonocrotaline

ZHENG Su-li, XIE Liang-di, LI Hong-liang, LIANG Min-lie, XU Chang-sheng

(FujianHypertensionInstitute,TheFirstAffiliatedHospitalofFujianMedicalUniversity,Fuzhou350005,China.E-mail:ldxie@hotmail.com)

AIM: To investigate the effects of adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (ADMSCs) on calcium channels of pulmonary artery in monocrotaline (MCT)-induced pulmonary hypertensive rats.METHODSADMSCs were isolated from adipose tissue by collagenase digestion. Twenty-four Sprague-Dawley rats were randomly divided into 3 groups: normal control (Ctr) group, pulmonary arterial hypertension (PAH) group and ADMSCs transplantation group. Mean pulmonary arterial pressure (MPAP) was measured by catheterization, and right ventricular hypertrophy index (RVHI) was calculated. The expression of voltage-gated calcium channel α1c subunit (CaVα1c), sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium ATPase 2a (SERCA-2a), inositol 1,4,5-triphosphate receptor 1(IP3R-1), transient receptor potential channel 1 (TRPC1) and TRPC6 at mRNA and protein levels in the pulmonary trunks was determined by RT-PCR and Western blotting, respectively.RESULTSMPAP and RVHI were higher in PAH group than those in Ctr group, while those in ADMSCs group were significantly decreased as compared with PAH group. The expression of CaVα1c, TRPC1 and TRPC6 at mRNA and protein levels was obviously increased in PAH group as compared with Ctr group, while that in ADMSCs group was significantly decreased as compared with PAH group. Compared with Ctr group, the expression of SERCA-2a and IP3R-1 at mRNA and protein levels was obviously decreased in PAH group, while that in ADMSCs group was significantly increased as compared with PAH group.CONCLUSIONMPAP and RVHI are attenuated by ADMSCs in MCT-induced pulmonary hypertensive rats. The reduction of pulmonary arterial pressure by ADMSCs transplantation in MCT-induced pulmonary hypertensive rats may be related to the changes of calcium channels.

Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells; Pulmonary arterial hypertension; Calcium channels

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.06.001

1000- 4718(2013)06- 0961- 08

2012- 12- 07

2013- 04- 15

國家自然科學基金資助項目(No. 81270111/H0109)

△通訊作者 Tel： 0591-87982618； E-mail： ldxie@hotmail.com