MALT1基因2種轉錄本在正常人和B細胞白血病患者中的表達特點

王 旭， 張 帆， 徐 艷， 吳秀麗， 陳少華， 楊力建， 李 萡， 盧育洪， 李揚秋,△

(暨南大學 1再生醫學教育部重點實驗室， 2醫學院血液病研究所，3第一附屬醫院血液科, 廣東 廣州 510632)

MALT1基因2種轉錄本在正常人和B細胞白血病患者中的表達特點

王 旭1， 張 帆2， 徐 艷1， 吳秀麗2， 陳少華2， 楊力建2， 李 萡2， 盧育洪3， 李揚秋1,2△

(暨南大學1再生醫學教育部重點實驗室，2醫學院血液病研究所，3第一附屬醫院血液科, 廣東 廣州 510632)

目的比較正常人和B細胞白血病患者外周血中黏膜相關淋巴樣組織淋巴瘤轉位基因1(MALT1)2種異構體的分布和表達差異。方法根據MALT1基因的結構特點，設計2對引物，通過建立2種轉錄本的逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)方法分析8例B細胞急性淋巴細胞白血病(B-ALL)、8例B細胞慢性淋巴細胞白血病(B-CLL)和8例正常人的外周血單個核細胞(PBMC)中MALT1的表達情況。實時定量PCR分析各組樣本的MALT1 mRNA表達水平。結果所有樣本中均能得到所預期的PCR產物，其中第1對引物可以擴增出2條片段，分別為MALT1轉錄本1(包含第5、6、7、8、9外顯子)和MALT1轉錄本2(包含第5、6、8、9外顯子)，第2對引物只能擴增出1條包含轉錄本1的片段，所有PCR產物均通過核苷酸序列分析證實。MALT1 2種轉錄本均在外周血中有表達，并且MALT1轉錄本2表達水平高于轉錄本1。通過灰度分析發現，在B-ALL中，MALT1轉錄本1的灰度與正常人相比顯著增高(P<0.05)，而MALT1轉錄本2顯著降低(P<0.05)；在B-CLL中，MALT1 2種轉錄本的灰度與正常人相比無顯著差異(P>0.05)。此外，B-ALL中，MALT1 mRNA表達水平(中位數：1.253)低于正常人(中位數：1.976)(P=0.05)；而B-CLL中，MALT1 mRNA的表達水平與正常人相比無顯著差異(P>0.05)。結論MALT1 2種轉錄本均表達于正常和B細胞白血病樣本中，但B-ALL中兩者的表達水平有所差異，同時，B-ALL的MALT1 mRNA表達水平也有所降低。B-ALL中MALT1基因表達的異常可能影響MALT1信號通路而與疾病的發生發展相關。

黏膜相關淋巴樣組織淋巴瘤轉位基因1； 轉錄本； 白血病，B細胞； 基因表達

黏膜相關淋巴樣組織淋巴瘤轉位蛋白1 (mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma translocation protein 1, MALT1) 是核因子κB (nuclear factor κB, NF-κB)信號通路中的一種調控蛋白，其功能：(1)作為支架蛋白促進依賴于IKK的NF-κB的活化；(2)類似于細胞凋亡蛋白酶 (caspase) 的蛋白，水解一些NF-κB相關因子，故MALT1又被稱為paracaspase[1-2]。MALT1在T細胞受體介導的NF-κB活化和調控淋巴細胞增殖和分化的過程中具有重要作用[3-4]。根據基因庫資料顯示MALT1基因存在2種轉錄本，但這2種轉錄本在正常人和血液腫瘤中的分布特點尚未見報道。本研究首先分析MALT1 2種轉錄本在正常人和B細胞白血病中的分布和表達特點，期望為以MALT1為靶點治療B細胞白血病的研究提供依據。

材 料 和 方 法

1樣本

收集正常人、B細胞慢性淋巴細胞白血病(B-cell chronic lymphocytic leukemia,B-CLL)和B細胞急性淋巴細胞白血病(B-cell acute lymphocytic leukemia,B-ALL)患者外周血樣本各8例，利用淋巴細胞分離液(Ficoll)分離外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)。Toledo(彌漫大B細胞淋巴瘤B細胞)、EJ-1(彌漫大B細胞淋巴瘤B細胞)、Jurkat(淋巴細胞瘤T細胞)、Motl4(急性淋巴母細胞白血病T細胞)、K562(慢性髓性白血病細胞)和HL-60(急性粒細胞白血病細胞)細胞株作為對照。

2主要方法

2.1RNA提取和cDNA合成 應用RNAzol試劑盒提取RNA 并應用隨機引物和反轉錄酶試劑盒反轉錄合成cDNA 第1鏈, 均按常規方法進行。合成cDNA 經過β2-微球蛋白(β2-microglobulin,β2M)的RT-PCR鑒定合成質量。

2.2設計并合成PCR引物 根據基因庫報道的人類MALT1基因(Accession No. NM006785, NM173844)2種轉錄本的序列特點設計引物(表1), 引物由上海英駿生物技術有限公司合成。轉錄本2比轉錄本1缺少33個堿基，包含MALT1轉錄本1第6個外顯子的最后1個堿基，第7個外顯子和第8個外顯子的第1個堿基(圖1)。第1對引物分別位于第5和第9外顯子上，即能確定擴增出2個相差33 bp的片段，MALT1轉錄本1和MALT1轉錄本2；而第2對引物的上游引物與第1對引物上游引物相同，下游引物位于第7外顯子上(轉錄本2缺失的區域內)，僅能擴增出MALT1轉錄本1的基因片段。

表1 用于RT-PCR檢測的MALT1基因引物序列

Figure 1. Diagrams of the 2MALT1 transcript variants and the sequencing results. A: the diagram ofMALT1 transcript variant 1；B: the diagram ofMALT1 transcript variant 2; C：the sequencing result of part ofMALT1 transcript variant, arrows showing the segment deleted inMALT1 transcript variant 2 (33 bp); D: the sequencing result of part ofMALT1 transcript variant.

圖1MALT1基因2種轉錄本示意圖和測序結果

2.3RT-PCR 總反應體系為20 μL，含1 μL cDNA模板、1.25 U Taq聚合酶、0.1 mmol/L dNTP、4 μL 5× PCR 緩沖液、1.5 mmol/L MgCl2和0.5 μmol/L的上、下游引物(同時檢測2種轉錄本所采用引物為MALT1-1F和MALT1-1R，即引物對MALT1-1;而檢測轉錄本1所采用引物為MALT1-1F和MALT1-2R,即引物對MALT1-2)。反應在PCR 擴增儀中進行。反應分別設陽性對照、陰性對照及樣品組。反應條件: 94 ℃ 30 s (首次10 min)，59 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，末次10 min, 共35個循環。PCR產物于3%瓊脂糖凝膠中進行電泳并分析結果[5]。

2.4核苷酸測序 隨機選取引物擴增的PCR 產物各1份進行核苷酸序列分析。具體操作: 20 μL PCR產物置于3%瓊脂糖凝膠中進行電泳, 引物對MALT1-2 PCR產物只有1條帶，而引物對MALT1-1的PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳得到2個產物，分別收集2產物條帶的瓊脂糖凝膠。將產物置于干凈的離心管中，普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收PCR產物并純化, 純化的產物送上海英駿生物技術有限公司測序[6]。

2.5實時定量RT-PCR 利用SYBR GreenⅠ染料進行各基因的實時熒光定量PCR檢測，擴增總反應體系為20 μL,應用Real Master Mix試劑盒(Tiangen，北京)，其中包括2× Real Master Mix 9 μL、 10 mmol/L上、下游引物0.5 μL以及1 μL cDNA等。每一標本均設復孔，每一基因均設陰性對照孔。反應條件為95 ℃預變性15 min后，共進行45個循環擴增，每一循環包括95 ℃ 30 s，60 ℃ 40 s。隨后,以0.17 ℃/s變化速度從55 ℃到95 ℃每隔2 s記錄1次熒光值,獲得熔解曲線。反應在CFX96熒光定量PCR儀(Bio-Rad)中進行[7]。

2.6MALT1 mRNA表達水平的計算方法 采用相對定量法分別分析B-ALL患者、B-CLL患者和正常人PBMC中MALT1 mRNA表達水平的差異，以β2M為內參照。計算公式[8]為：相對mRNA表達量=2-ΔCt×100%，其中，ΔCt=Ct(MALT1)-Ct(β2M)。

2.7灰度分析 應用凝膠成像分析軟件Gel-Pro Analyzer 4(Media Cybernetics)對正常人、B-ALL和B-CLL 3份凝膠圖像進行灰度分析，得出MALT1轉錄本1和MALT1轉錄本2所占的灰度比。

3統計學處理

利用SPSS 17.0軟件進行統計學分析。數據以中位數表示，組間比較均采用秩和檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

利用本實驗所設計針對MALT1 2種轉錄本檢測的3個引物，分別檢測同時含有2種MALT1轉錄本(圖2A)和僅含MALT1轉錄本1(圖2B)的PCR產物。所擴增出PCR產物與預期產物片段大小相一致。圖2A可見擴增出2條不同大小的片段分別為MALT1的2種轉錄本，224 bp和191 bp;而圖2B則可見所擴增的PCR產物為單一的MALT1轉錄本1基因片段，大小為195 bp。分別將凝膠電泳中所見的2種不同大小的PCR產物分離、純化和進行序列分析，證明其核苷酸序列與2種轉錄本的序列相同，見圖1C、D。

Figure 2. The expression of the 2MALT1 transcript variants in different hematologic malignancy cell lines.A:PCR products amplified by MALT1-1F and MALT1-1R primers; B: PCR products amplified by MALT1-1F and MALT1-2R primers. M: DNA marker; 1： Toledo; 2： EJ-1; 3： Jurkat; 4： Motl4; 5： K562; 6： HL-60; 7, 8： healthy individuals.

圖2MALT12種轉錄本在不同血液腫瘤細胞株中的表達

進一步比較正常人、B-ALL患者和B-CLL患者樣本中MALT1 2種轉錄本的表達情況，結果顯示，所有樣本均表達2種轉錄本，在正常人和B細胞白血病患者的大多數樣本中MALT1轉錄本2比轉錄本1表達量要高，見圖3。在所檢測的6種細胞株(Toledo、EJ-1、Jurkat 4、Motl4、K562和HL-60)中，2種轉錄本表達水平差別不大，見圖2A。

Figure 3. The expression of the 2MALT1 transcript variants in PBMC from healthy individuals (A), B-CLL patients (B) and B-ALL patients (C). M: DNA marker.

圖3MALT12種轉錄本在B-ALL患者、B-CLL患者和正常人PBMC中的表達

對B-ALL和B-CLL 患者2種轉錄本的凝膠成像進行灰度分析，并分別與正常人進行秩和檢驗發現，B-ALL患者中MALT1轉錄本1的灰度比(中位數為13.3725)與正常人(中位數為7.205)相比顯著增高(P<0.05)，MALT1轉錄本2的灰度比(中位數為86.626)與正常人(中位數為92.795)相比顯著降低(P<0.05)；B-CLL患者中MALT1 2種轉錄本的灰度比(中位數分別為6.765和93.235)與正常人(中位數分別為7.205和92.795)相比差異無統計學意義(P>0.05)；而B-ALL患者中的MALT1轉錄本1的灰度比(中位數為13.372)較B-CLL(中位數為6.765)有明顯增高(P<0.05)，MALT1轉錄本2的灰度比(中位數為86.628)較B-CLL(中位數為93.235)有明顯降低(P<0.05)。

對MALT1 mRNA表達量的定量PCR結果進行秩和檢驗發現，在B-ALL患者中MALT1 mRNA的表達量(中位數為1.253)較正常人(中位數為1.976)降低(P=0.05)；在B-CLL患者中，MALT1 mRNA表達量(中位數為3.560)與正常人(中位數為1.976)相比差異沒有統計學意義(P>0.05)；而B-ALL MALT1 mRNA表達量較B-CLL差異有統計學意義(P<0.05)。

Figure 4. Relative expression level of MALT1 mRNA in PBMC from B-ALL patients,B-CLL patients and healthy individuals. ·2: outlier.

圖4B-ALL患者、B-CLL患者與正常人中MALT1mRNA的相對表達水平

討 論

在淋巴細胞中，MALT1與B細胞淋巴瘤10 (B-cell lymphoma/leukemia 10, Bcl-10)和含caspase募集結構域的膜相關鳥苷酸激酶1 [caspase-recruitment domain (CARD)-containing membrane-associated guanylate kinase protein 1, CARMA1] 結合形成CBM復合物，活化NF-κB,對于調控淋巴細胞的增殖和分化有著重要的作用。故MALT1 mRNA或蛋白的異常表達，可造成NF-κB的持續性表達[2,9]，是一些淋巴瘤發病的主要原因[10]。

MALT1基因位于染色體18q21區域，全長78 753 bp，含有位于N端的死亡結構域、與其緊連的2個免疫球蛋白樣結構域和C端的caspase樣結構域[10]。基因庫資料顯示人類MALT1存在2種轉錄本。但并沒有詳細文獻報道2種轉錄本在正常人和不同疾病患者中表達的差異性，為了進一步研究MALT1在淋巴細胞腫瘤中的作用特點，本研究首先比較分析正常人與B細胞白血病患者中MALT1轉錄本分布差異特點。MALT1轉錄本2相較于轉錄本1缺少第7個外顯子、第6外顯子的最后1個和第8外顯子第1個堿基。根據這個基因結構上的特點，本研究通過設計可同時擴增2種轉錄本的引物和定點在轉錄本2缺失區域的引物，后者只能擴增轉錄本1這一種產物，PCR和核苷酸序列分析實驗結果證明了與預期設計完全相同。

從電泳結果中我們發現，B-ALL患者、B-CLL患者和正常人外周血中都表達MALT1的2種轉錄本，并且轉錄本2比轉錄本1表達量高，兩者之間表達量相差較大。經過灰度分析和統計學分析發現在B-ALL中，MALT1轉錄本1灰度比正常人要高。B-ALL中MALT1轉錄本1相對高表達的特點是否與B-ALL發生發展有著一定的相關性，有待進一步研究。有趣的是，定量分析則發現MALT1 mRNA(包括2種轉錄本)的表達水平低于正常人，該結果與既往發現的MALT1高表達在黏膜相關淋巴樣組織淋巴瘤發生中具有重要作用的結果有所不同[4]，這可能由于MALT1調控細胞的增殖和分化是通過與Bcl-10結合激活NF-κB來實現的，單獨的MALT1并沒有激活NF-κB的能力。有報道認為，MALT1的缺失對NF-κB的活化影響不大[10-11]，因此，MALT1的低表達可能不是介導B-ALL發生的主要因素。其次，MALT1是腫瘤抑制因子A20的降解介導分子，后者擁有抗凋亡和抑制腫瘤的雙重功能，而MALT1的低表達，可能有助于A20發揮抗凋亡作用而在B-ALL的發生中起到相應的作用[12-15]。然而，這些推測還有待進一步驗證。本研究發現B-CLL患者MALT1的2種轉錄本分布和表達水平與正常對照組沒有明顯差異，提示MALT1可能與B-CLL細胞相關信號通路表達變化關系不大。而對B-ALL和B-CLL患者 2種轉錄本的分布和表達水平的分析發現，兩方面都存在明顯的統計學差異，值得進一步比較B-ALL與B-CLL之間的差異，以期發現其可能的新分子機制。此外，我們在多個不同的白血病細胞株中發現MALT1 2種轉錄本的表達水平很接近，與我們檢測樣本有很大的不同，這一結果值得我們進一步研究不同白血病中MALT1轉錄本1的高表達特點和意義。

總之，本研究建立了檢測2種MALT1轉錄本的方法，并首先報道了其在正常人和B細胞白血病之間分布和表達的差異特點，這些結果有助于深入探討MALT1在B-ALL細胞中的作用特點。進一步構建MALT1基因轉錄本的表達載體，分析其功能差異將是一項有意義的工作。

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TranscriptsofMALT1geneinhealthyindividualsandB-cellleukemiapatients

WANG Xu1, ZHANG Fan2, XU Yan1, WU Xiu-li2, CHEN Shao-hua2, YANG Li-jian2, LI Bo2, LU Yu-hong3, LI Yang-qiu1,2

(1KeyLaboratoryforRegenerativeMedicineofMinistryofEducation,2InstituteofHematology,SchoolofMedicine,3DepartmentofHaematology,theFirstAffiliatedHospital,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:jnyangqiuli@163.com)

AIM: To investigate the difference of the distribution and expression of mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma translocation gene 1(MALT1) transcripts in healthy individuals and B-cell leukemia patients.METHODSTwo pairs of primers were designed according to the sequences of differentMALT1 transcripts. RT-PCR was performed to detect the distribution ofMALT1 gene in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from 8 healthy individuals, 8 patients with B-cell acute lymphocytic leukemia (B-ALL) and 8 patients with B-cell chronic lymphocytic leukemia (B-CLL). The mRNA expression of MALT1 in all samples from the 3 groups was determined by real-time PCR.RESULTSExpected amplicons were amplified by the 2 primer pairs, and 2 PCR products of different sizes were amplified by the first primer pair (the larger one included exons 5, 6, 7, 8 and 9, and the small one included exons 5, 6, 8 and 9). Moreover, theMALT1 transcript variant 1 was conformed by the second primer pair. All the PCR products were confirmed by the nucleotide sequencing analysis. Two transcripts ofMALT1 were identified in all samples from both healthy individuals and B-cell leukemia patients, and the expression level ofMALT1 was predominant in transcript variant 2. The gray level ofMALT1 transcript variant 1 in B-ALL patients was significantly higher than that in healthy individuals, whereas theMALT1 transcript variant 2 was significantly lower than that in healthy group. However, no significant difference of the gray level was found in the 2MALT1 transcript variants in B-CLL group as compared with healthy group. In addition, the expression level of MALT1 mRNA in B-ALL group (median=1.253) was lower than that in healthy group (median=1.976,P=0.05), while no significant difference of the expression level of MALT1 mRNA between B-CLL patients and healthy individuals was found.CONCLUSIONTwo transcripts ofMALT1 have common distribution in both healthy individuals and B-cell leukemia patients, while the significant differences of distribution ofMALT1 transcript variants and the expression level of MALT1 mRNA are characterized in B-ALL patients. The abnormal expression ofMALT1 gene might involve in the genesis and development of leukemia via MALT1 signaling pathway.

Mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma translocation gene 1; Transcript variants; Leukemia, B-cell; Gene expression

R329.21

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.06.028

1000- 4718(2013)06- 1124- 06

2012- 12- 12

2013- 04- 24

國家自然科學基金資助項目(No.91129720);廣東省科技計劃(國際合作)項目(No.2012B050600023)

△通訊作者 Tel: 020-85226877; E-mail: jnyangqiuli@163.com