甜菜堿對老齡db/db小鼠脂肪性肝損害的影響*

劉光潔， 劉光澤, 蘭 丹， 陳媚娟, 廖漢雄, 劉海霞, 鄒清雁△

(1長春師范學院計算機科學與技術學院，吉林 長春 130032； 2解放軍第四五八醫院全軍肝病中心，廣東 廣州 510602；3廣州諾金制藥有限公司，廣東 廣州 511356； 4廣州賽吉生物科技有限公司，廣東 廣州 510663)

·短篇論著·

甜菜堿對老齡db/db小鼠脂肪性肝損害的影響*

劉光潔1， 劉光澤2, 蘭 丹4， 陳媚娟2, 廖漢雄3, 劉海霞4, 鄒清雁4△

(1長春師范學院計算機科學與技術學院，吉林 長春 130032；2解放軍第四五八醫院全軍肝病中心，廣東 廣州 510602；3廣州諾金制藥有限公司，廣東 廣州 511356；4廣州賽吉生物科技有限公司，廣東 廣州 510663)

目的通過高脂飲食誘發db/db小鼠非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)模型，探索甜菜堿對遺傳性小鼠脂肪肝脂質代謝的影響。方法50只7月齡db/db鼠隨機分為低、中、高劑量組、生理鹽水對照組和陽性藥物組。所有小鼠均飼以高脂飼料, 以誘發NAFLD 模型。 小鼠分別以200 mg/kg(低劑量組)、400 mg/kg(中劑量組)和800 mg/kg(高劑量組)甜菜堿溶液灌胃，連續6周。測定血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)和低密度脂蛋白(LDL)水平，并行葡萄糖耐量測定和肝組織病理學觀察。結果甜菜堿可顯著降低血清ALT、TC和LDL的水平(P<0.05或P<0.01)。組織學結果表明甜菜堿可顯著減少小鼠肝細胞的脂肪樣變性。結論甜菜堿可以顯著改善老齡db/db小鼠的脂類代謝紊亂和肝功能，明顯降低脂肪在肝細胞中的積蓄。

甜菜堿； 非酒精性脂肪性肝病；db/db小鼠

非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver,NAFL) 又稱非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)，是發病率和復發率均較高的常見病，其確切的病因和發病機制仍不完全明了。隨著社會經濟的發展和人們飲食結構、生活方式的變化，與脂代謝異常密切相關的非酒精性脂肪性肝病的發病率大幅度上升。雖然認為NAFLD是無痛性的良性病變，但確有相當一部分病例具有隱匿地向肝纖維化、肝硬化發展的特點，因此NAFLD的防治工作受到國內外的廣泛重視[1-4]，目前還缺乏統一有效的藥物治療方案。

甜菜堿(betaine)作為一種高效甲基供體，在彌補人類甲基化功能不足方面(如甲基四氫葉酸還原酶缺失)起著重要的作用。有關文獻研究發現甜菜堿可增加S-腺苷甲硫氨酸水平，具有改善NAFL的作用[5-9]。眾多學者認為NAFLD是一種遺傳性疾病，但甜菜堿能否對人類遺傳性脂肪肝有效及治療效果還缺乏相關動物實驗研究。

db/db小鼠是國內外最常用的遺傳性脂肪肝模型，由小鼠瘦素受體基因的自然突變所誘發。這種小鼠不能產生飽感,即對飽感物質(瘦素)缺乏反應, 易多食，引起脂肪堆積而肥胖；逐漸可導致過度攝食、肥胖、高脂血癥和脂肪肝。本研究以老齡(7月齡)db/db小鼠為模型，觀察甜菜堿對遺傳性小鼠脂肪肝的影響，旨在探索甜菜堿作為藥物治療有遺傳背景NAFLD的可能性。

材 料 和 方 法

1材料

1.1動物db/db小鼠和正常db/m小鼠，由中國人民解放軍第四五八醫院全軍肝病研究中心轉基因動物實驗室提供。

1.2材料 甜菜堿由廣州賽吉生物科技有限公司提供;地奧脂必妥片由成都地奧九泓制藥廠生產；哺乳動物組織蛋白質抽提試劑 LY005 MT-Cel-Lytics和BCA-100 蛋白質定量測定試劑盒由上海博彩生物科技有限公司提供；游離脂肪酸測定試劑盒(南京建成生物科技有限公司)；高脂飼料(D12331, Research diets生產)。

2方法

2.1動物模型及分組 50只db/db小鼠，飼喂高脂飼料1個月后，以肥胖、血清總膽固醇(total cholesterol,TC)≥3.0 mmol/L和丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase,ALT)≥120 U/L的db/db小鼠入選。隨機分為低劑量組(灌胃甜菜堿200 mg/kg)、中劑量組(灌胃甜菜堿400 mg/kg)、高劑量組(灌胃甜菜堿800 mg/kg)、生理鹽水組(灌胃等體積的生理鹽水)和陽性藥物組(灌胃等脂必妥水劑400 mg/kg)；每組10只，持續飼養實驗周期為6周。

2.2檢測指標

2.2.1體重和肝臟指數 每周稱重,喂養6周后，禁食12 h后收集血清，肝臟稱重。肝臟指數(%)=肝臟質量/體重×100%。

2.2.2眼眶采血，離心收集血清做生化分析，測定血清谷ALT、TC、甘油三酯(triglyceride,TG)和低密度脂蛋白(low-density lipoprotein,LDL)等生化指標。

2.2.3葡萄糖水平和靜脈葡萄糖耐量試驗(intravenous glucose tolerance test,IGTT) 安樂死前2周，實驗動物禁食過夜，采血檢測血漿葡萄糖水平,最后1周進行IGTT檢測。

2.2.4組織形態學檢測 對肝臟組織進行冰凍切片和油紅O染色以觀察肝臟細胞中脂質的累積情況；另取一部分肝臟組織固定，HE染色，以觀察肝組織形態學的變化。

3統計學處理

采用SPSS 13.0軟件包進行統計學分析，數據以均數±標準差(mean±SD)表示，組間均數比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1甜菜堿對db/db小鼠體重和肝臟指數的影響

db/db小鼠經甜菜堿藥物灌胃6周時，每周稱取體重1次。各組老齡實驗鼠體重雖均呈下降趨勢，但經統計分析，組間各個時點體重比較均無顯著差異。甜菜堿低、中、高劑量組小鼠的體重與對照組相比無顯著差異，表明甜菜堿對老齡實驗鼠體重無明顯影響(P>0.05),見表1。

表1 各組小鼠體重的變化

The weight of normaldb/mmice was (21.80±1.19) g.

給藥6周后，甜菜堿各劑量組小鼠的肝臟指數與對照組相比差異均不顯著(P>0.05),見表2。

2甜菜堿對db/db小鼠血清脂類生化指標和肝功能的影響

2.1TC 實驗前各組血清TC水平無顯著差異。在實驗后甜菜堿中、高劑量組和陽性藥物組血清TC水平均低于生理鹽水組(P<0.01), 甜菜堿高劑量組降低35.41%。甜菜堿低劑量組與生理鹽水組差異不明顯；第3周時僅陽性藥物組與生理鹽水組有差異。這表明中、高劑量甜菜堿具有降低血清膽固醇的作用，而脂必妥降膽固醇的效果最明顯，見表3。

表2甜菜堿對肝臟指數的影響

Table 2. The effect of betaine on liver index (%. Mean±SD.n=10)

GroupLiverindexLowdose4.50±1.08Mediumdose3.88±0.84Highdose3.96±0.66Salinecontrol3.78±0.67Positivedrug3.69±1.22

表3甜菜堿對db/db小鼠血清TC水平的影響

Table 3. The effect of betaine on serum TC level indb/dbmice (mmol/L. Mean±SD.n=10)

Group0week3weeks6weeksLowdose5.05±1.464.50±0.924.07±0.49Mediumdose5.16±1.394.61±1.613.67±0.58**Highdose5.14±1.174.46±1.643.32±0.72**Salinecontrol5.06±1.554.90±1.644.51±1.17Positivedrug5.00±1.273.32±0.43*3.04±0.41**

Serum TC level in normal db/m mice was (2.14±0.22) mmol/L.*P<0.05,**P<0.01vssaline control.

2.2TG 與生理鹽水組比較，甜菜堿各劑量組和陽性藥物組血清TG水平差異均不明顯，見表4。

表4甜菜堿對db/db小鼠血清TG水平的影響

Table 4. The effect of betaine on serum TG level indb/dbmice (mmol/L. Mean±SD.n=10)

Group0week3weeks6weeksLowdose1.49±0.421.75±0.591.74±0.42Mediumdose1.41±0.221.69±0.591.59±0.24Highdose1.35±0.361.56±0.491.68±0.43Salinecontrol1.41±0.461.75±0.501.70±0.54Positivedrug1.50±0.431.76±0.601.55±0.52

Serum TG level in normaldb/mmice was (1.75±0.18) mmol/L.

2.3LDL 與正常db/m小鼠相比，老齡db/db小鼠血清LDL水平顯著升高，仍維持高脂血癥；實驗6周后，用藥組血清LDL水平與生理鹽水組相比顯著降低(P<0.01)，表明甜菜堿和脂必妥均能降低血清LDL水平，具有明顯的降血脂效果，見表5。

表5甜菜堿對db/db小鼠血清LDL水平的影響

Table 5. The effect of betaine on serum LDL level indb/dbmice (mmol/L. Mean±SD.n=10)

Group0week3weeks6weeksLowdose1.64±0.151.74±0.201.55±0.19**Mediumdose1.68±0.201.69±0.241.44±0.12**Highdose1.75±0.151.62±0.211.36±0.18**Salinecontrol1.68±0.141.84±0.161.80±0.11Positivedrug1.68±0.141.48±0.161.34±0.11**

Serum LDL level in normaldb/mmice was (0.46±0.15) mmol/L.**P<0.01vssaline control.

2.4ALT 實驗前各組小鼠血清ALT水平均較高。治療6周后，甜菜堿各劑量組和陽性藥物組小鼠血清ALT水平均顯著減低，與生理鹽水組比較差異有統計意義(P<0.05)。這表明脂必妥和甜菜堿均能明顯改善肝功能，見表6。

表6甜菜堿對db/db小鼠血清ALT水平的影響

Table 6. The effect of betaine on serum ALT level indb/dbmice (U/L. Mean±SD.n=10)

Group0week3weeks6weeksLowdose233.78±98.88224.89±60.71125.44±22.57*Mediumdose224.17±93.28212.60±103.33106.88±19.22*Highdose213.75±48.95158.50±28.24103.25±25.55*Salinecontrol190.44±87.82176.63±59.32131.00±36.46Positivedrug185.50±53.85136.75±51.3589.00±26.05*

Serum ALT level in normaldb/mmice was (34.17±4.26) U/L.*P<0.05vssaline control.

3甜菜堿對db/db小鼠葡萄糖耐量的影響

給藥6周后的IGTT結果表明，各組血糖水平均于30 min升至最高，后又逐漸降低。與生理鹽水組相比，甜菜堿各劑量組和陽性藥物組小鼠葡萄糖耐量在各時間點未見明顯差異，見表7。

表7 各組小鼠6周后IGTT結果

4肝組織形態學觀察

小鼠經甜菜堿藥物灌胃6周時，肝組織HE染色結果顯示，生理鹽水組肝臟小葉結構消失，中度至重度脂肪變，肝竇被擠壓變窄，肝細胞形態不規則，肝細胞內胞漿空泡較多，細胞核位于中間，伴濁腫樣變性及輕度的肝細胞點狀壞死，氣球樣變的細胞占肝組織的50%以上，提示有重度脂肪肝的表現。甜菜堿處理組和陽性藥物脂必妥處理組小鼠肝組織中空泡樣變細胞較生理鹽水組明顯減少。甜菜堿處理組肝臟病理表現以輕度至中度脂肪變為主，伴有一定程度濁腫樣變性，肝細胞形態大致正常，肝細胞內脂肪滴減少，散在分布，核圓位于細胞中央，炎癥細胞浸潤減輕，偶見細胞壞死。但水樣變性各實驗組普遍存在，見圖1和表8。

Figure 1. The histological observation and lipid accumulation of the liver tissues in the mice (×400).

圖1各組肝組織HE和油紅O染色圖

表8肝組織形態學觀察結果

Table 8. The morphological changes of the hepatic tissues of the mice (n=10)

GroupHydropicdegenerationSlightfattydegenerationSeverefattydegenerationFocalnecrosisLowdose10555Mediumdose8634Highdose8703Salinecontrol10375Positivedrug9723

小鼠經甜菜堿藥物灌胃6周時，肝組織油紅O染色結果顯示，生理鹽水組肝細胞內充滿紅色粗大塊狀物，表明肝細胞脂肪變性明顯。甜菜堿和陽性藥物脂必妥處理組小鼠肝細胞內紅色粗大顆粒減少，脂肪變性范圍減小、程度減輕。脂必妥組肝細胞中水樣變性較明顯，空泡較多，原因不清楚，可能與脂必妥為中草藥有關，見圖1。這表明甜菜堿和陽性藥物脂必妥處理組小鼠肝細胞中脂質累積水平較生理鹽水組顯著降低。

討 論

甜菜堿治療NAFL的藥效學動物模型一般均采用正常實驗鼠進行高脂飲食誘導[6]獲得，缺乏遺傳背景因素，而人類NAFL一般均具有遺傳背景影響，因此眾多學者懷疑動物實驗結果的可靠性[10]。我們利用遺傳性脂肪肝小鼠模型，進一步研究了甜菜堿對脂肪肝的保護作用，為甜菜堿治療人類NAFL的藥效學實驗提供了新的證據。

db/db小鼠是國內外目前最常用的肥胖癥和脂肪肝模型。由于db/db小鼠腦細胞表面不能產生瘦素受體，瘦素刺激不能傳達到腦，不能產生飽感，即對飽感物質(瘦素)缺乏反應。多食后，合成代謝大于分解代謝,引起脂肪堆積而肥胖,逐漸可致過度攝食、肥胖、高脂血癥和轉氨酶升高等表現。這種小鼠出生10 d后即表現多食、肥胖及血糖升高，4周后由于體重增加明顯，肥胖顯著，很容易分辨，從6周開始體重出現顯著差異。高脂飲食飼養1個月即可誘發3月齡db/db小鼠出現非酒精性脂肪肝。

面對發病日益增多的肥胖人群及其導致的相關疾病，體重是相關實驗重要的觀察指標之一。本實驗觀察結果提示甜菜堿對小鼠體重沒有明顯的影響，不能抑制小鼠的食欲，不會改變其食量和增加能量的消耗。

脂質代謝紊亂是NAFLD 發病的重要因素之一。脂肪代謝失衡, 肝臟內脂肪積聚, 這是脂肪肝的主要動因。而在肝臟脂肪沉積基礎上所發生的氧化應激和脂質過氧化又可進一步干擾肝內脂類代謝, 使脂質沉積增多, TC和TG 增加, 而脂質沉積的增多又能加重脂質過氧化反應，加重細胞損傷，導致惡性循環[11-12]。

甜菜堿的主要功能是提供甲基，參與機體內的甲基轉移。所謂甲基轉移就是指甲基供體的去甲基反應、甲基碳離子的轉移及甲基受體的甲基吸附作用。研究顯示，S-腺苷蛋氨酸水平的降低可導致脂肪性肝病的發生。甜菜堿能增加S-腺苷蛋氨酸水平,使酒精性肝病動物模型脂肪肝的發生明顯降低，尤其是S-腺苷蛋氨酸能保護肝臟免遭TG沉積和肝損傷的發生。也有不少實驗證實S-腺苷蛋氨酸、蛋氨酸和膽堿可直接對非酒精性肝損傷有保護作用[6]。

本實驗結果表明，甜菜堿與脂必妥均可降低db/db小鼠的血清TC和LDL水平，而降低血清TG的效果均不明顯。脂必妥能抑制肝內VLDL 和LDL 的生物合成，或增加VLDL 和LDL 的降解速度，降低膽固醇的效果比甜菜堿明顯。

甜菜堿作為甲基供應體的一種，能促進肉堿的合成，從而抑制膽固醇在肝臟堆積，促進長鏈脂肪酸的β-氧化，加速脂質代謝，保護線粒體電子偶聯呼吸系統，減輕了脂質過氧化對肝臟的損傷[13-14]。轉氨酶可作為反映肝臟損傷的靈敏指標,實驗結果顯示高脂組與正常組比較,ALT 顯著升高;而甜菜堿組與高脂組比較則明顯降低,表明甜菜堿能顯著抑制脂肪肝造成的血清轉氨酶水平的升高。ALT 下降可能與肝內脂肪水平相關，原因可能是甜菜堿促進肝內脂肪向肝外轉移，降低了肝中脂肪，減輕了脂肪與脂質過氧化作用對肝臟的損傷，從而降低了血清中轉氨酶水平。

肝組織HE染色觀察表明，生理鹽水對照組肝細胞空泡樣變明顯，占肝組織的50%以上，提示有中、重度脂肪肝。甜菜堿組肝細胞形態大致正常，以輕度至中度脂肪變為主，伴有一定程度水樣變性； 肝組織脂肪油紅O染色結果表明：生理鹽水組小鼠肝組織中脂肪的比例占80%以上，說明油紅O染色對脂肪肝的診斷更敏感，中、高劑量甜菜堿和脂必妥組中肝臟細胞中脂質累積水平較生理鹽水對照組小鼠顯著降低，表明在維持NAFLD小鼠肝組織完整性和抑制肝中脂肪堆積方面，甜菜堿可降低肝中脂肪蓄積。

甜菜堿對肝臟指數影響不明顯的原因不清。理論上甜菜堿能促進載脂蛋白的合成，促進肝內脂肪向肝外轉移。甜菜堿在促進肝內脂肪向肝外轉移的同時也可能促進了肝細胞的蛋白合成，從而使肝組織比重增加。

甜菜堿對IGTT影響不明顯，即甜菜堿的降血糖效果不顯著，提示今后利用甜菜堿治療代謝紊亂綜合征時要注意患者血糖的控制，至于甜菜堿能否促進胰島素和二甲雙胍類藥物的降血糖作用還有待深入研究。

綜上所述，甜菜堿可以改善老齡db/db小鼠肝損傷, 減輕脂質過氧化反應, 降低高脂血癥和肝中脂肪蓄積，表明甜菜堿具有較好的降血脂、保護肝臟和減輕脂肪肝形成的作用。甜菜堿源自植物，安全無害，是降血脂、保護肝臟的天然藥物。

[1] 中華醫學會肝病學分會脂肪肝和酒精性肝病學組. 非酒精性脂肪性肝病診療指南(2010年修訂版)[J]. 中華肝臟病學雜志,2010, 18(3): 163-166.

[2] Ratziu V, Bellentani S, Cortez-Pinto H, et al. A position statement on NAFLD/NASH based on the EASL 2009 special conference[J]. J Hepatol, 2010, 53(2): 372-384.

[3] 郭秀麗，任 莉，梁丕霞，等. 非酒精性脂肪肝發病機制[J]. 醫師進修雜志，2005，28(9A)：53-55.

[4] O’Shea RS, Dasarathy S, McCullough AJ.Alcoholic liver disease[J]. Hepatology, 2010, 51(1): 307-328.

[5] Comar KM,Sterling RK. Drug therapy for non-alcoholic fatty liver disease[J].Aliment Pharmacal Ther，2006，23(2)：207-215.

[6] Kathirvel E, Morgan K, Nandgiri G,et al. Betaine improves nonalcoholic fatty liver and associated hepatic insulin resistance: a potential mechanism for hepatoprotection by betaine[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2010,299(5):G1068-G1077.

[7] Patrick L. Nonalcoholic fatty liver disease: relationship to insulin sensitivity and oxidative stress. Treatment approaches using vitamin E, magnesium, and betaine[J]. Altern Med Rev, 2002, 7(4):276-291.

[8] 王淑芳，張 巍，周 鳳，等. 甜菜堿對非酒精性脂肪性肝炎大鼠胰島素抵抗的影響[J].中西醫結合肝病雜志,2010,20(6):358-359.

[9] Duvnjak M, Tomasic V, Gomercic M, et al. Therapy of nonalcoholic fatty liver disease: current status[J]. J Phy-siol Pharmacol, 2009, 60(Suppl 7): 57-66.

[10] Mukherjee S.Betaine and nonalcoholic steatohepatitis: back to the future？[J]. World J Gastroenterol, 2011,17(32):3663-3664.

[11] Larter CZ, Yeh MM. Animal models of NASH: getting both pathology and metabolic context right[J]. J Gastroenterol Hepatol, 2008,23(11):1635-1648.

[12] Shen L, Fan JG, Shao Y, et al. Prevalence of nonalcoho-lic fatty liver among administrative officers in Shanghai: an epidemiological survey[J]. World J Gastroenterol, 2003, 9(5): 1106-1110.

[13] Peluso G, Barbarisi A, Savica V,et al. Carnitine: an osmolyte that plays a metabolic role[J]. J Cell Biochem, 2000,80(1):1-10.

[14] Shin OH, Mar MH, Albright CD, et al . Methyl-group donors cannot prevent apoptotic death of rat hepatocytes induced by choline-deficiency[J]. J Cell Biochem,1997,64(2):196-208.

Effectofbetaineonliverinjuriesinagingdb/dbmiceinducedbylipids

LIU Guang-jie1, LIU Guang-ze2, LAN Dan4, CHEN Mei-juan2, LIAO Han-xiong3, LIU Hai-xia4, ZOU Qing-yan4

(1CollegeofComputerScienceandTechnology,ChangchunNormalUniversity,Changchun130032,China;2CenterofHepatopathy, 458thHospitalofPLA,Guangzhou510602,China;3GuangzhouKnockimPharmacyCo.Ltd.,Guangzhou511356,China;4GuangzhouCell-GeneBiotechCo.Ltd.,Guangzhou510663,China.E-mail:zqy966@126.com)

AIM: To evaluate the effect of betaine on lipid metabolism disorder in inheriteddb/dbmice with long-term nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD).METHODSExperimental NAFLD models were established by feeding thedb/dbmice with high-fat diet. Fifty 7-month-olddb/dbmice were randomly divided into 5 groups: the mice in low, medium and high dose groups were given betaine by intragastric administration at doses of 200 mg/kg, 400 mg/kg and 800 mg/kg for 6 weeks, respectively,while the mice in saline control group and positive drug group were given normal saline and positive control drug,respctively. All the animals were killed, and serum alanine aminotransferase (ALT), triglyceride (TG), total cholesterol (TC), low-density lipoprotein (LDL) and glucose tolerance were detected. The pathological changes of the liver tissues were also observed.RESULTSBetaine significantly decreased the levels of ALT, TC and LDL (P<0.05 orP<0.01). The pathological changes of the liver tissues indicated that the content of lipid in the hepatocytes of betaine treatment groups was less than that in saline control group.CONCLUSIONBetaine significantly improves the lipid metabolism and the liver function in the agingdb/dbmice, and reduces the accumulation of lipid in the hepatocytes.

Betaine; Nonalcoholic fatty liver disease;db/dbmice

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.06.026

1000- 4718(2013)06- 1114- 05

2013- 01- 03

2013- 04- 10

國家重大新藥創制項目(No.2011ZX09401-307)；廣州高新技術開發區項目(No.2011Q-P033)

△通訊作者 Tel: 020-87796965; E-mail: zqy966@126.com