沉默Notch1基因促進人乳腺癌MCF-7細胞JNK1和p53磷酸化*

袁 磊， 陳旭東， 范文娟， 楊旭光， 王建國

(漯河醫學高等專科學校，河南 漯河 462002)

沉默Notch1基因促進人乳腺癌MCF-7細胞JNK1和p53磷酸化*

袁 磊， 陳旭東， 范文娟， 楊旭光， 王建國△

(漯河醫學高等專科學校，河南 漯河 462002)

目的探究沉默Notch1基因對人乳腺癌MCF-7細胞JNK1和p53磷酸化的影響。方法選取人乳腺癌MCF-7細胞作為研究對象，構建shRNA-Notch1真核表達質粒用于轉染MCF-7細胞使Notch1基因沉默。采用Western blotting方法檢測MCF-7細胞Notch1、Hes-1、PUMA和NOXA蛋白的表達，JNK1和p53蛋白磷酸化水平以及caspase-3活化水平的改變。應用流式細胞術檢測細胞凋亡和線粒體膜電位的變化。結果人乳腺癌MCF-7細胞Notch1基因被沉默后，Notch1和Hes-1蛋白表達量明顯減少(P<0.01)，細胞凋亡率顯著升高(P<0.01)，JNK1和p53的磷酸化水平明顯高于對照組(P<0.01)，PUMA和NOXA表達量顯著升高(P<0.05)，cleaved caspase-3蛋白明顯多于對照組(P<0.01)，線粒體膜電位明顯下降(P<0.05)。結論沉默Notch1基因可能通過激活JNK1信號通路活化p53，促進PUMA和NOXA蛋白表達，進而通過線粒體途徑導致人乳腺癌MCF-7細胞凋亡。

Notch1蛋白； 短發夾RNA； JNK1蛋白； p53蛋白； MCF-7細胞

近年來，在果蠅發育的研究中，發現了一條在細胞間傳導相互作用的信號途徑，稱為Notch信號途徑。隨后證實該信號途徑廣泛存在于無脊椎動物和脊椎動物體內，并且在進化過程中高度保守。Notch信號途徑的激活始于Notch受體胞外區與相鄰細胞表面的Notch配體胞外區的結合。脊椎動物Notch配體分為Delta和Jagged 2個家族，人的Notch配體有Delta-1、-3、-4和Jagged-1、-2，人的Notch受體家族有4個成員(Notch1～4)。Notch信號途徑不僅影響著胚胎發育、血管發生、程序性細胞死亡和細胞增殖等多種生理過程[1-5]，在腫瘤的侵襲、轉移、凋亡、增殖和血管生成等病理過程中也發揮著關鍵作用[6-7]。本研究通過構建shRNA-Notch1真核表達質粒以探究沉默Notch1基因對人乳腺癌MCF-7細胞凋亡的影響及其分子機制。

材 料 和 方 法

1材料

MCF-7細胞購自中國科學院細胞庫，大腸桿菌菌株DH5α由本校分子醫學實驗中心提供。胎牛血清和RPMI-1640培養基購自Gibco；pRS質粒載體購自Origene；質粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自北京天根公司；限制性核酸內切酶BamH I、Hind III、XhoI和T4 DNA連接酶購自TaKaRa；脂質體Lipofectamine 2000和Annexin V/PI檢測凋亡試劑盒購自Invitrogen； Notch1、Hes-1、p-JNK(Thr183/Tyr185)、p-p53(Ser15)、PUMA(p53-upregulated modulator of apoptosis)、NOXA、cleaved caspase-3和β-actin抗體購自Santa Cruz；Rhodamine123購自Sigma；Notch1特異性DNA干擾序列由大連寶生物公司合成。

2方法

2.1設計shRNA靶序列 利用NCBI數據庫檢索人Notch1 mRNA序列(GenBank Accession：NM_017617)，根據shRNA設計原則，使用Invitrogen公司在線設計軟件針對Notch1編碼區(2 015～2 035)設計特異性靶序列,另設計一條由Notch1特異性靶序列隨機重排而成的序列作為陰性對照，經BLAST比對分析與人類基因編碼序列無同源性。shRNA設計模板采用BamH I+Sense+Loop+Antisense+終止序列+XhoI+HindIII(其中Loop: 5’-TTCAAGAGA-3’, 終止序列: TTTTTT)，具體序列見表1，下劃線部分為靶序列，由大連寶生物公司合成。

表1 shRNA干擾序列

2.2構建pRS-shRNA表達質粒 將pRS空質粒于37 ℃用限制性核酸內切酶BamH I和HindIII酶切過夜，經1%瓊脂糖凝膠電泳后，采用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收。將合成的shRNA模板單鏈進行退火處理形成雙鏈，然后與雙酶切后的線性化載體于16 ℃連接過夜。將連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，涂布于含ampicillin抗性的LB平板上，37 ℃培養過夜，挑取單克隆菌落，置于含有ampicillin抗性的LB培養基中，37 ℃、200 r/min過夜。收集菌液，采用質粒提取試劑盒提取質粒。

2.3重組質粒的鑒定 提取的質粒用XhoI做酶切鑒定。空質粒pRS的DNA序列中不存在XhoI的酶切位點，而在插入的shRNA片段中，我們加入了1個XhoI的酶切位點。若重組質粒構建成功，就能被XhoI酶切。對酶切鑒定正確的質粒送大連寶生物公司測序。鑒定正確的質粒分別命名為pRS-Notch1和pRS-non。

2.4細胞培養和轉染 用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養MCF-7細胞，每隔48 h更換1次細胞培養液。當細胞匯合度達80%以上時換為不含胎牛血清的RPMI-1640培養基培養過夜。將重組質粒pRS-Notch1和pRS-non分別轉染MCF-7細胞，轉染方法參照Lipofectamine 2000操作說明書進行，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養6 h后用PBS洗去轉染試劑，加入新鮮的培養基繼續培養24 h。MCF-7細胞轉染分組：(1)shControl組：轉染重組質粒pRS-non；(2)shNotch1組：轉染重組質粒pRS-Notch1。

2.5流式細胞術檢測細胞凋亡 制備各實驗組細胞懸液，用PBS洗滌細胞2次，加入結合緩沖液懸浮細胞，加入Annexin V-FITC輕輕混勻后于4 ℃避光孵育10 min。800 r/min離心5 min，棄上清，重懸細胞于結合緩沖液中，加入PI染色液輕輕混勻后于4 ℃避光孵育5 min，送流式細胞儀檢測。

2.6Western blotting檢測蛋白水平 裂解各組細胞提取總蛋白，用BCA法定量后，進行SDS-PAGE電泳并轉移至PVDF膜。封閉液(5%BSA/TBST)封閉1 h，加入Ⅰ抗(1∶1 000稀釋)，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，加入Ⅱ抗(1∶1 000稀釋)室溫下孵育1 h，TBST洗膜3次，加入ECL進行發光反應，壓片、顯影、定影，觀察蛋白印記，運用ImageJ軟件測定各蛋白條帶灰度值。

2.7流式細胞術檢測線粒體膜電位 羅丹明123(rhodamine 123, Rh123)是一種可以通過細胞膜的選擇性染色活細胞線粒體的熒光染料，細胞內Rh123的平均熒光強度(mean fluorescence intensity, MFI)與線粒體跨膜電位呈正相關。制備各實驗組細胞懸液，用PBS洗滌細胞2次，重懸細胞于培養基中，加入Rh123(終濃度為5 mg/L)，37 ℃孵育箱中放置30 min，再用細胞培養基洗滌細胞2次，送流式細胞儀檢測。

3統計學處理

用SPSS 16.0統計軟件進行分析。數據用均數±標準差(mean±SD)表示，兩組間均數比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1pRS-shRNA重組質粒的鑒定

將重組質粒和空質粒分別用XhoI進行單酶切鑒定。空質粒pRS因其序列中無XhoI的酶切位點而不能被XhoI酶切；但在重組質粒pRS-Notch1和pRS-non的序列中插入了XhoI的酶切位點，可被XhoI酶切，酶切產生的線狀DNA因空間位阻較環狀質粒大導致電泳速度慢于環狀質粒。對酶切鑒定正確的質粒測序, 經過比對，2個重組質粒中含有目的shRNA片段，表明重組質粒構建成功，見圖1。

Figure 1. Single restriction endonuclease digestion of pRS-Notch1 and pRS-non. M: 1 kb DNA marker; 1～3: pRS, pRS-Notch1 and pRS-non without digestion,respectively; 4～6: pRS, pRS-Notch1 and pRS-non digested byXhoI,respectively.

圖1重組質粒pRS-Notch1和pRS-non的單酶切鑒定

2shRNA干擾對Notch1和Hes-1蛋白表達的影響

Western blotting結果顯示，shNotch1組Notch1/β-actin灰度比顯著低于shControl組(P<0.01)。Hes-1基因是Notch1的主要下游基因之一，當shNotch1組Notch1蛋白表達被抑制后，該組Hes-1蛋白表達較shControl組明顯下降(P<0.01)，這表明Notch1信號途徑受到明顯抑制，見圖2。

Figure 2. Expression of Notch1 and Hes-1 proteins in human breast cancer MCF-7 cells after pRS-non/pRS-Notch1 transfection. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsshControl group.

圖2pRS-non/pRS-Notch1轉染MCF-7細胞后Notch1和Hes-1蛋白的表達

3沉默Notch1基因對細胞凋亡的影響

流式細胞術結果顯示，shNotch1組MCF-7細胞凋亡率為23.8%±1.7%，較shControl組(2.1%±0.5%)顯著升高(P<0.01)，見圖3。

4沉默Notch1基因對JNK1和p53磷酸化的影響

shNotch1組p-JNK1/β-actin和p-p53/β-actin的灰度比分別為1.050 3±0.071 2和0.830 2±0.063 5，均顯著高于shControl組(P<0.05)，見圖4。

5沉默Notch1基因對PUMA、NOXA和cleavedcaspase-3蛋白表達的影響

shNotch1組PUMA/β-actin、NOXA/β-actin和cleaved caspase-3/β-actin的灰度比分別為0.827 1±0.070 8、1.737 6±0.096 3和1.234 1±0.078 2，均顯著高于shControl組，(P<0.05)，見圖5。

Figure 3. Effect ofNotch1 silencing on apoptosis of MCF-7 cells detected by flow cytometry. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsshControl group.

圖3流式細胞術檢測沉默Notch1對MCF-7細胞凋亡的影響

Figure 4. Effect ofNotch1 silencing on phosphorylations of JNK1 and p53 in MCF-7 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsshControl group.

圖4沉默Notch1對MCF-7細胞JNK1和p53磷酸化的影響

Figure 5. Effect ofNotch1 silencing on the protein levels of PUMA,NOXA and cleaved caspase-3 in MCF-7 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsshControl group.

圖5沉默Notch1對MCF-7細胞PUMA、NOXA和cleavedcaspase-3蛋白水平的影響

6沉默Notch1基因對線粒體膜電位的影響

流式細胞術結果顯示，shControl組的FI為5 576±410，以此為對照，沉默Notch1基因后MCF-7細胞的FI降為4 332±338 (P<0.05)，表明抑制Notch1蛋白表達可引起MCF-7細胞線粒體膜電位下降，見圖6。

Figure 6. Effect ofNotch1 silencing on mitochondrial membrane potential of MCF-7 cells detected by flow cytometry. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsshControl group.

圖6流式細胞術檢測沉默Notch1基因對MCF-7細胞線粒體膜電位的影響

討 論

Notch1單鏈前體(300 kD)首先在內質網合成，運輸至高爾基體后被Furin 樣轉化酶切割成含胞外區的N端片段(180 kD)與含跨膜區和胞內區的C端片段(120 kD)，兩者通過非共價鍵結合為異源二聚體后被轉運到細胞膜。當Notch與相鄰細胞表面的配體結合后，Notch1相繼發生2次蛋白水解。先由ADAM10/Kuz或ADAM17/TACE酶切其C端片段的胞外部分產生Notch1胞外截短體(Notch extracellular truncation, NEXT)，再由γ-促分泌酶復合體酶切NEXT釋放Notch1胞內段 (Notch intracellular domain，NICD)，NICD進入細胞核與CSL [CBF1/Su(H)/LAG1]結合[8]。CSL蛋白是一種轉錄抑制因子，在哺乳動物中又被稱為C-啟動子結合因子1 (C-promoter binding factor 1, CBF1)或轉錄因子重組信號結合蛋白 Jκ (recombination signal binding protein-Jκ, RBP-Jκ)。沒有NICD存在時，CSL與Notch1靶基因啟動子結合并抑制其轉錄，當NICD與CSL結合并募集Mastermind組成轉錄激活復合體后，CSL由轉錄抑制因子轉變為轉錄激活因子，激活Notch1靶基因的轉錄，如Hes-1、Hey-1、CDK8和CCND1等[9]。

本研究針對Notch1的開放讀碼框設計了特異性的shRNA干擾序列，以此構建的重組質粒pRS-Notch1在轉染人乳腺癌MCF-7細胞后有效抑制了Notch1基因的表達。為進一步明確Notch1信號通路是否被有效抑制，我們檢測了Notch1信號通路的特異性靶基因Hes-1的表達水平，結果顯示，隨著Notch1蛋白表達的抑制，Hes-1蛋白的表達顯著降低，這表明重組質粒pRS-Notch1能夠有效沉默Notch1基因和抑制Notch1信號通路。

抑制Notch1信號通路可促進多種細胞發生凋亡，然而在不同的細胞環境中，分子機制不盡相同。運用γ-分泌酶抑制劑(γ-secretase inhibitor，GSI)阻斷Notch信號通路可下調骨髓瘤細胞Akt、Bcl-2和Bcl-xL蛋白的表達[10]；通過siRNA沉默前列腺癌細胞Notch1基因可抑制Akt和轉錄因子FoxM1的表達[11]，下調Bcl-2蛋白和上調Bax蛋白的表達[12]。在轉移性前列腺癌細胞中通過下調Notch1或Jagged1蛋白的表達抑制Notch1信號通路后，Akt和mTOR蛋白的表達均受到抑制，同時NF-κB信號通路及其下游蛋白MMP-9、VEGF和uPA的表達也均受到抑制[7]。

本研究發現，沉默乳腺癌MCF-7細胞Notch1基因可促進JNK1和p53的磷酸化。這可能是由于Notch1信號通路活化產生的NICD可與JNK1競爭結合JNK相互作用蛋白1(JNK-interacting protein 1, JIP1)，從而干擾了JIP1-JNK1信號通路的活化[13]，沉默Notch1基因后，解除了NICD對JIP1-JNK1信號通路的抑制，促進了JNK1的磷酸化。JNK1激活后可磷酸化p53使之活性增強[14]。在人肝癌HepG2細胞中，DNA損傷可引起p53蛋白磷酸化(Ser15)， PUMA、NOXA、Bax和Bcl-2蛋白表達增多，繼而促使細胞色素C和Smac/DIABLO蛋白從線粒體膜間腔釋放至胞漿，激活caspase-9和caspase-3導致細胞凋亡[15]。

BH3-only蛋白PUMA和NOXA為p53的下游蛋白，可與Bcl-2蛋白家族中抗凋亡蛋白結合，促進Bax的活化，活化的Bax可插入線粒體外膜并寡聚成孔道，也可與線粒體外膜中的電壓依賴性陰離子通道 (voltage-dependent anion channel, VDAC)結合引起線粒體通透性轉變孔 (mitochondrial permeability transition pore, MPTP)的持續開放，進而引起線粒體外膜通透化 (mitochondrial outer membrane permeabilization, MOMP)和線粒體膜電位消散，釋放線粒體膜間腔中的促凋亡蛋白，激活半胱天冬酶(caspase)，最終導致細胞凋亡[16-17]。本研究發現，在沉默乳腺癌MCF-7細胞Notch1基因后，隨著p53蛋白磷酸化水平的升高，PUMA和NOXA蛋白的表達明顯增強，進而導致線粒體膜電位降低和caspase-3活化。

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Notch-1genesilencingpromotesphosphorylationsofJNK1andp53inhumanbreastcancerMCF-7cells

YUAN Lei, CHEN Xu-dong, FAN Wen-juan, YANG Xu-guang, WANG Jian-guo

(LuoheMedicalCollege,Luohe462002,China.E-mail:wr0395@sina.com)

AIM: To investigate the effect ofNotch1 gene silencing on phosphorylations of JNK1 and p53 in human breast cancer MCF-7 cells.METHODSshRNA-Notch1 eukaryotic expression plasmid was constructed and transfected into MCF-7 cells. The expression of Notch1 and Hes-1 was observed by Western blotting after transfction. Apoptosis and mitochondrial membrane potential were detected by flow cytometry. Western blotting was also used to determine the protein levels of p-JNK1, p-p53, PUMA, NOXA and cleaved caspase-3 afterNotch1 silencing was performed in MCF-7 cells.RESULTSSilencing ofNotch1 significantly reduced the expression of Notch1 and Hes-1 in MCF-7 cells (P<0.01). In shNotch1 group, the number of apoptotic cells was much higher (P<0.01) and mitochondrial membrane potential was much lower (P<0.05) than those in shControl group. The protein levels of p-JNK1, p-p53, PUMA, NOXA and cleaved caspase-3 increased obviously after silencing ofNotch1 was performed in MCF-7 cells (P<0.05).CONCLUSIONNotch1 silencing induces apoptosis of human breast cancer MCF-7 cells through promoting phosphorylations of JNK1 and p53, and increasing the production of PUMA, NOXA and cleaved caspase-3.

Notch1 protein; Short hairpin RNA; JNK1 protein; p53 protein; MCF-7 cells

R737.9

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.06.010

1000- 4718(2013)06- 1014- 06

2012- 12- 31

2013- 04- 02

河南省基礎與前沿技術研究計劃項目(No.122300410277);漯河醫學高等專科學校科研基金資助項目(No.2010-S10)

△通訊作者 Tel： 0395-2112681； E-mail： wr0395@sina.com