脂肪特異性蛋白27對大鼠肝星狀細胞活化的影響*

俞富祥， 宋才鑫， 吳志偉， 張啟瑜

(溫州醫學院附屬第一醫院肝膽胰外科，浙江 溫州 325000)

脂肪特異性蛋白27對大鼠肝星狀細胞活化的影響*

俞富祥， 宋才鑫， 吳志偉， 張啟瑜△

(溫州醫學院附屬第一醫院肝膽胰外科，浙江 溫州 325000)

目的探討脂肪特異性蛋白27(Fsp27)對肝星狀細胞(HSCs)增殖和活化的影響及其對纖維化相關蛋白的調節作用。方法從SD大鼠肝臟提取HSCs并培養，采用實時熒光定量PCR、免疫熒光染色和Western blotting檢測原代HSCs和活化HSCs中Fsp27 mRNA和蛋白的表達。構建攜帶Fsp27基因的慢病毒，轉染活化的HSCs并繼續培養72 h，通過CCK-8比色法檢測Fsp27對HSCs增殖的影響；Western blotting檢測HSCs中α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的表達，了解HSCs的活化狀態；實時熒光定量PCR檢測Fsp27對HSCs中纖維化相關蛋白[包括基質金屬蛋白酶2(MMP-2)、金屬蛋白酶組織抑制物1(TIMP-1)和轉化生長因子β1(TGF-β1)] mRNA表達的影響。結果成功分離大鼠原代HSCs。Fsp27在原代HSCs和活化HSCs中的表達差異顯著(P<0.01)；活化HSCs成功轉染攜帶Fsp27基因的慢病毒后繼續培養72 h，與對照組比較，HSCs的活化與增殖被明顯抑制(P<0.05)；Fsp27促進MMP-2 mRNA的表達(P<0.05)，降低TIMP-1和TGF-β1mRNA的表達(P<0.05)。結論Fsp27可抑制HSCs的增殖和活化，并調節纖維化相關蛋白的表達。Fsp27的作用可能與其維持HSCs靜息狀態細胞表型有關。

脂肪特異性蛋白27； 肝星狀細胞； 活化

眾所周知，肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSCs)的活化與增殖是肝纖維化發生發展的中心環節。HSCs增殖激活后可分泌大量細胞外基質，引起膠原纖維沉積導致纖維化。阻止HSCs的增殖活化有可能阻斷肝纖維化肝硬化的進程[1-4]。針對HSCs的有關肝纖維化機制及對其防治的研究近年已成為國內外生物學、醫學研究的熱點之一。

HSCs活化的一個重要特征是胞漿內脂滴的消失。現有針對脂肪細胞的研究提示脂肪特異性蛋白27(fat-specific protein 27，Fsp27)是脂肪細胞胞漿內脂滴形成的一個重要蛋白，其基因在肝臟中是過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)的直接靶基因，脂肪細胞儲脂功能的實現主要通過Fsp27而實現[5]。另外有研究通過導入外源基因PPARγ在HSCs中表達，顯示PPARγ可使HSCs由活化態向靜止態轉變。在本研究中，我們增強Fsp27在活化HSCs中的表達，以了解Fsp27能否對HSCs活化增殖過程產生影響。

材 料 和 方 法

1材料及試劑

健康6周齡雄性SD大鼠10只，體重200～300 g，供分離原代HSCs，由溫州醫學院實驗動物中心提供；L-DMEM培養基，購自HyClone；小牛血清購自Gibco；Ⅳ型膠原酶、DNaseⅠ購自Sigma；OptiPrep分離液購自Axis Shield；6孔塑料培養板購自Millipore；鼠抗α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)單克隆抗體購自Southern-Biotech；AEC試劑盒購自博士德生物公司。RNA Trizol試劑盒購自Invitrogen。

2方法

2.1HSCs的分離、培養 使用本實驗室前期建立的方法，即膠原酶原位灌注及密度梯度離心技術從大鼠分離提取原代HSCs。原代細胞經形態學及免疫細胞化學法鑒定(原代HSCs活化后表達α-SMA)，HSCs純度可達95%。將細胞接種于培養瓶中, 37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養箱中常規培養。培養液為含10%小牛血清的L-DMEM，根據細胞生長情況，每2～3 d換液1次。

2.2實時熒光定量PCR 按TRIzol試劑盒說明書提取總RNA，測定RNA的濃度及純度，逆轉錄反應條件參照試劑盒說明，PCR反應條件為95 ℃變性15 s后，按95 ℃ 5 s變性，60 ℃ 30 s退火，共45個循環。Fsp27上游引物5’-CCTCTATGACACATACTCGCTTTC-3’，下游引物5’-TGTTCTTCCTCAGTGGCATCC-3’，產物長度168 bp。GAPDH上游引物5’-GAGGACCAGGTTGTCTCCTG-3’，下游引物5’-GGATGGAATTGTGAGGGAGA -3’， 產物長度215 bp。

2.3Western blotting 在原代HSCs及活化HSCs中分別加入現配的細胞裂解液，冰上裂解30 min，于4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清進行蛋白定量。取一定量蛋白樣品上樣。SDS-PAGE分離，轉移至PVDF膜，封閉緩沖液室溫搖床振蕩1 h，加入I抗體α-SMA (1∶100)，4 ℃過夜，TBST漂洗3次，每次10 min，孵育II抗(1∶30 000)，37 ℃恒溫振搖1 h；TBST漂洗3次，每次10 min，化學發光，顯影、定影，對膠片圖像掃描，用凝膠圖像處理系統Gel-Pro Analyzer分析目標帶的灰度值。

2.4免疫熒光染色 原代細胞爬片48 h后PBS漂洗，4%多聚甲醛4 ℃固定過夜；PBS漂洗3次后0.1%Triton X-100處理15 min；PBS漂洗，10%山羊血清封片20 min；于4 ℃標記I抗過夜，次日PBS漂洗并室溫標記II抗1 h，然后漂洗、封片，上機觀測。

2.5攜帶Fsp27基因的慢病毒載體的構建及細胞感染 構建的重組體慢病毒(pLV-Fsp27)包含鼠Fsp27基因及GFP基因，該病毒的滴定度測定為2.00×1011TU/L。病毒被儲存在-80 ℃，病毒增殖分離在293T細胞中進行。慢病毒感染后的HSCs進行下游檢測時狀態良好。

根據實驗設計，以下細胞實驗均在細胞株HSC-T6中進行。在不同感染復數(multiplicity of infection, MOI)下進行慢病毒感染。HSCs培養于6孔板中，密度為5×104cells/well，每孔以MOI=0、20和40轉染重組體慢病毒(pLV-Fsp27)或空載病毒(pLV-GFP)。感染72 h后根據GFP的表達情況及Fsp27 mRNA的檢測，測算感染效率。

2.6目標基因轉染后對細胞表型及細胞增殖的影響 根據實驗設計分為空白對照組(無病毒轉染)、陰性對照組(轉染pLV-GFP)及陽性對照組(轉染pLV-Fsp27)，每組設5個復孔。按前述方法將帶目標基因的慢病毒轉染HSCs后繼續培養24 h、48 h和72 h，光學顯微鏡下觀察細胞表型的變化。每孔加入CCK-8溶液80 μL，繼續培養2 h，用自動酶標儀于450 nm處檢測每孔的吸光度(A)，根據公式[增殖抑制率(%)=(1-實驗組A值/空白對照組A值)×100%]計算陰性對照組及陽性對照組的增殖抑制率。

2.7目標基因轉染后對細胞活化的影響 將帶目標基因的慢病毒轉染活化HSCs，觀察HSCs α-SMA表達的變化。慢病毒轉染HSCs后繼續培養72 h，按前述方法提取蛋白，采用Western blotting測定α-SMA的表達情況。

2.8目標基因轉染后對HSCs的纖維化相關蛋白表達的影響 帶目標基因的慢病毒轉染細胞后繼續培養72 h，設計大鼠基質金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2, MMP-2)、金屬蛋白酶組織抑制物1(tissue inhibitor of metalloproteinase 1, TIMP-1)、轉化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)及內參照GAPDH的引物，利用實時熒光定量PCR技術，分別測定各組細胞中上述蛋白的mRNA表達情況。具體如下：MMP-2上游引物5’-CCCCTATCTACACCTACACCAA-3’,下游引物5’-CACCACGGATCTGAGCAAT-3’,擴展片段長192 bp； TIMP-1上游引物5’-CCTCTGGCATCCTCTTGTTG-3’,下游引物5’-CGCTGGTATAAGGTGGTCTC-3’,擴增片段長157 bp；TGF-β1上游引物5’-GAGGCGGTGCTCGCTTTGT-3’,下游引物5’-CGGGTGACTTCTTTGGCGTAG-3’,擴增片段長107 bp；GAPDH上游引物5’-GAGGACCAGGTTGTCTCCTG-3’,下游引物5’-GGATGGAATTGTGAGGGAGA-3’,擴增片段長215 bp。反應條件：94 ℃ 5 min預變性，擴增40個循環，每個循環包括：94 ℃ 30 s，56 ℃(MMP-2和TIMP-1為52.1 ℃)30 s，72 ℃ 45 s。

3統計學處理

采用SPSS 13.0統計軟件處理，數據以均數±標準差(mean±SD)表示，兩樣本均數間比較用t檢驗。多個樣本均數間的比較用方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1HSCs的分離、培養和形態學特點

每只大鼠HSCs的獲得率約為(1～2)×107，臺盼藍染色存活細胞>95%。相差顯微鏡下，剛分離出來的HSCs呈圓球形，胞漿內含較多脂肪小滴，在328 nm波長的激發光下，熒光顯微鏡可觀察到藍綠色熒光的脂滴。培養2～3 d后，細胞貼壁；5～8 d后，細胞伸展呈星形。10 d后HSCs幾乎全部活化(胞漿內可見棕色的α-SMA),見圖1。

Figure 1. Identification of hepatic stellate cells (HSCs). A: primary HSCs at 2 d (×1 000); B: primary HSCs at 3 d (×100); C: activated HSCs (α-SMA immunocytochemical staining，×300).

圖1肝星狀細胞的鑒定

2Fsp27在原代及活化HSCs中的表達

Fsp27蛋白主要表達于細胞胞漿脂滴包膜，在原代HSCs中無論mRNA水平還是蛋白質水平均為顯著表達，而在活化的HSCs中Fsp27則幾乎不表達，兩者差異顯著(P<0.01),見圖2。

3攜帶Fsp27基因的慢病毒轉染HSCs結果

成功構建攜帶Fsp27基因的慢病毒(pLV-Fsp27)。HSCs經慢病毒感染后，在顯微鏡下可見綠色熒光，顯微鏡下熒光觀察感染效率達到80%以上。pLV-Fsp27組中該Fsp27 mRNA強表達，而在空白對照組和pLV-GFP組中幾乎不表達(P<0.01),見圖3。

Figure 2. Expression of Fsp27 mRNA and protein in primary HSCs and activated HSCs. A: expression of Fsp27 protein in HSCs (immunofluorescence staining, ×200);B: Fsp27 mRNA expression in HSCs detected by real-time fluorescence quantitative PCR; C: expression of Fsp27 protein in HSCs detected by Western blotting. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsactivated HSCs.

圖2原代及活化HSCs中Fsp27的表達

4Fsp27抑制HSCs增殖并引起HSCs表型的變化

光學顯微鏡下觀察，與空白對照組和pLV-GFP組比較，pLV-Fsp27組細胞形態變小，胞漿變少，樹突狀胞突變短，形態更接近于原代HSCs。與pLV-GFP組相比，病毒轉染48 h和72 h后，pLV-Fsp27組HSCs增殖活性受抑制明顯，且與病毒劑量相關(P<0.05)。在MOI=40時，隨著時間推移，與pLV-GFP組相比，pLV-Fsp27組HSCs的增殖抑制率顯著增大(P<0.05),見圖4。

Figure 3. Infection efficiency and Fsp27 mRNA expression in activated HSCs after lentivirus infection. A: cell morphology and GFP expression observed under phase-contrast microscope and fluorescence microscope, respectively (×200); B: expression of Fsp27 mRNA detected by real-time fluorescence quantitative PCR. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsblank control or pLV-GFP.

圖3活化HSCs感染慢病毒后的感染效率和Fsp27mRNA表達

5Fsp27抑制HSCsα-SMA的表達

與空白對照組和pLV-GFP組比較，pLV-Fsp27組HSCs內α-SMA表達水平明顯下降(P<0.05)。而pLV-GFP組與空白對照組中HSCs的α-SMA的表達則無顯著差異(P>0.05),見圖5。

6Fsp27調節了肝纖維化相關蛋白的mRNA表達

與空白對照組和pLV-GFP組比較，pLV-Fsp27組中抗纖維化的MMP-2 mRNA表達升高，促纖維化的TIMP-1及TGF-β1mRNA表達降低，差異均有統計學意義(P<0.05),見圖6。

討 論

我國是肝炎高發國家，肝炎繼續發展形成肝硬化，由肝硬化導致的肝功能衰竭或肝癌是導致患者死亡的主要原因，現已成為影響人民健康的重要因素。因此，阻斷或延緩肝纖維化的發展是目前治療肝硬化的關鍵。有研究顯示肝纖維化是一個可逆轉的疾病，是治療肝硬化的一個重要靶點[1-4，6]。

HSCs屬于肝臟的間質細胞，它在肝臟中的生理功能主要為參與維生素A 的代謝，儲存脂肪，為肝細胞提供能源。在病理條件下如肝臟受到外源性刺激時，HSCs增殖并激活，激活的HSCs一方面通過增生和分泌細胞外基質參與肝纖維化的形成和肝內結構的重建，對肝纖維化的形成起著至關重要的作用，另一方面通過細胞收縮使肝竇內升高，門靜脈血液回流受阻，肝臟缺血缺氧加重，又進一步促進肝損傷和肝硬化的發展。由此可見，HSCs的持續激活是肝纖維化發生發展過程中的關鍵環節[1-4]。

Figure 4. Changes of the morphology and proliferation of activated HSCs after pLV-Fsp27 infection. A: cell morpho-logy observed under phase-contrast microscope (×200); B～D: cell viability detected by CCK-8 assay, including 48 h after infection at different MOI (B), 72 h after infection at different MOI (C) and different time after infection at MOI=40 (D). Mean±SD.n=6.*P<0.05vspLV-GFP.

圖4活化HSCs感染pLV-Fsp27后形態與增殖的變化

Figure 5. Effect of Fsp27 on α-SMA expression in activated HSCs. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank control or pLV-GFP.

圖5活化HSCs感染pLV-Fsp27后α-SMA表達的變化

Figure 6. Effects of Fsp27 on MMP-2,TGF-β1and TIMP-1 mRMA expression in activated HSCs. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsblank control or pLV-GFP.

圖6活化HSCs感染pLV-Fsp27后MMP-2、TGF-β1和TIMP-1mRMA表達的變化

PPARγ是維持HSCs靜息狀態的重要細胞因子，在原代HSCs中高表達，而在活化的HSCs中低表達，甚至不表達。通過外源性增加HSCs中PPARγ的激動劑或病毒轉染外源基因使PPARγ高表達，發現PPARγ不僅能顯著抑制活化HSCs的活化與增殖，而且能有效抑制活化后HSCs的致炎因子及膠原纖維的分泌，從而能逆轉活體肝纖維化進程[6-11]。

雖然HSCs中PPARγ的功能研究報道較多，但其具體作用機制尚不十分明晰。誘導細胞死亡的DFF45樣效應因子(cell death-inducing DFF45-like effectors，CIDE)家族是近幾年發現的與細胞凋亡相關的一組新蛋白，在細胞凋亡、脂肪和能量代謝方面具有明顯的作用[12]。Fsp27是CIDE家族蛋白中的一員，在成熟脂肪細胞特異表達，其在脂肪組織的分化和形成過程中可能具有重要的作用。Fsp27是一種脂肪液滴結合蛋白，并且會促進脂肪細胞中脂類物質的堆積，其基因是PPARγ的直接靶基因[5-6]。HSCs是肝臟中的儲脂細胞，本研究發現Fsp27在原代HSCs高表達，而在活化HSCs中幾乎不表達。通過Fsp27特異性抗體免疫熒光染色還發現，該蛋白特異性表達于脂肪滴包膜，對HSCs胞漿中脂滴的形成與維持可能具有重要作用。

我們通過慢病毒載體感染技術，使Fsp27在活化HSCs中得以表達。與對照組比較，Fsp27明顯抑制HSCs增殖，同時也抑制了HSCs的活化，還促進了抗纖維化蛋白MMP-2的mRNA表達，降低了促纖維化蛋白TIMP-1及TGF-β1的mRNA表達。由此可見，Fsp27可能也是維持HSCs靜息狀態細胞表型及生物活性的重要調控因子之一，有望成為抗肝纖維化治療的靶點之一。

總之，目前初步的研究成果顯示，Fsp27可抑制HSCs活化、增殖，促進了抗纖維化蛋白 MMP-2的表達。但是Fsp27在HSCs中的具體作用通路及PPARγ對HSCs的作用是否是通過Fsp27途徑等問題目前國內外研究報道甚少，有待進一步深入研究。

[1] Friedman SL. Hepatic stellate cells: protean, multifunctional and enigmatic cells of the liver[J]. Physiol Rev, 2008, 88(1): 125-172.

[2] Roderfeld M, Weiskirchen R, Wagner S, et al．Inhibition of hepatic fibrogenesis by matrix metalloproteinase-9 mutants in mice[J]．FASEB J, 2006, 20(3): 444-454.

[3] 高俊茶, 王 妍, 姜慧卿. 索拉非尼抑制人肝星狀細胞膠原合成[J]. 中國病理生理雜志, 2012, 28(1) :85-89.

[4] 郭 劍, 劉小娟, 張國尊, 等. 腺病毒介導的 shRNA 下調 PTEN 表達對體外活化肝星狀細胞增殖與凋亡的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2012, 28(9):1627-1632.

[5] Matsusue K, Kusakabe T,Noguchi T, et al. Hepatic steatosis in leptin-deficient mice is promoted by the PPARγ target geneFsp27[J]. Cell Metab, 2008, 7(4): 302-311.

[6] Yu J,Zhang S,Chu ES, et al. Peroxisome proliferator-activated receptors gamma reverses hepatic nutritional fibrosis in mice and suppresses activation of hepatic stellate cellsinvitro[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2010, 42(6): 948-957.

[7] Galli A, Crabb D, Ceni E, et al. Peroxisome proliferator-activated receptor γ transcriptional regulation is involved in platelet-derived growth factor-induced proliferation in human hepatic stellate cells[J]. Hepatology, 2000, 31(1): 101-108

[8] Hazra S, Miyahara T, Rippe RA, et al. PPAR gamma and hepatic stellate cells[J]. Comp Hepatol, 2004, 3(Suppl 1): S7.

[9] 郭晏同, 趙景明, 冷希圣, 等. 羅格列酮抑制體外大鼠肝星狀細胞活化[J]. 基礎醫學與臨床, 2008, 28(11): 1129-1133.

[10] Nakajima A, Wada K, Miki H, et al. Endogenous PPAR gamma mediates anti-inflammatory activity in murine ischemia-reperfusion injury[J]. Gastroenterology, 2001, 120(2): 460-469.

[11] Lee JI,Paik YH,Lee KS, et al. A peroxisome-proliferator activated receptor-γ ligand could regulate the expression of leptin receptor on human hepatic stellate cells[J]. Histochem Cell Biol, 2007, 127(5): 495-502.

[12] Zhou Z, Toh SY, Chen Z, et al. Cidea-deficient mice have lean phenotype and are resistant to obesity[J]. Nat Genet, 2003, 35(1): 49-56.

Effectoffat-specificprotein27onactivationofrathepaticstellatecellsinvitro

YU Fu-xiang, SONG Cai-xin, WU Zhi-wei, ZHANG Qi-yu

(DepartmentofHepatobiliaryandPancreaticSurgery,theFirstAffiliatedHospital,WenzhouMedicalCollege,Wenzhou325000,China.E-mail:yfxbmu@163.com)

AIM: To investigate the effects of fat-specific protein 27 (Fsp27) on the proliferation and activation of hepatic stellate cells (HSCs)invitro.METHODSHSCs were isolated from the liver of SD rats. The mRNA and protein expression of Fsp27 in primary HSCs and activated HSCs was detected by real-time fluorescence quantitative PCR, immunofluorescence staining and Western blotting. After 72 h of transfection withFsp27-carrying lentivirus (pLV-Fsp27), the proliferation of HSCs was tested by CCK-8 assay, the protein expression of α-smooth muscle actin (α-SMA) in HSCs was detected by Western blotting, and the mRNA expression of fibrosis-related proteins, including matrix metalloproteinase 2 (MMP-2), tissue inhibitor of metalloproteinase 1 (TIMP-1) and transforming growth factor beta 1 (TGF-β1), was determined by real-time fluorescence quantitative PCR.RESULTSRat HSCs were successfully isolated and cultured. The difference of Fsp27 expression between primary HSCs and activated HSCs was significant (P<0.01). The proliferation and activation of HSCs was inhibited 72 h after pLV-Fsp27 transfection (P<0.05). Fsp27 enhanced the mRNA expression of MMP-2 and down-regulate the mRNA expression of TIMP-1 and TGF-β1in activated HSCs (P<0.05).CONCLUSIONFsp27 inhibits the proliferation and activation of HSCs and regulates the expression of fibrosis-related proteins. Fsp27 may play an important role in maintenance of the quiescent phenotype of HSCs.

Fat-specific protein 27; Hepatic stellate cells; Activation

R363

A

1000- 4718(2013)09- 1597- 06

2013- 03- 13

2013- 07- 02

溫州市科技計劃項目(No.Y20120191)；浙江省重中之重外科學組資助(No.浙教高科2008-255)

△通訊作者 Tel: 0577-55579453; E-mail： yfxbmu@163.com

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.09.010