抗組胺治療對實驗性肝炎大鼠肥大細胞浸潤及c-Kit和SCF表達的影響*

李 紅， 趙龍鳳， 郝彥琴， 尹 鐳, 趙元昌, 韓德五

(山西醫科大學 1第一醫院感染病科， 2肝病研究所， 山西 太原 030001)

抗組胺治療對實驗性肝炎大鼠肥大細胞浸潤及c-Kit和SCF表達的影響*

李 紅1△， 趙龍鳳1， 郝彥琴1， 尹 鐳2, 趙元昌2, 韓德五2

(山西醫科大學1第一醫院感染病科，2肝病研究所， 山西 太原 030001)

目的研究c-Kit和干細胞因子(SCF)在實驗性肝炎大鼠肝臟組織的表達及抗組胺治療后的變化。方法取Wistar大鼠30只，隨機分為3組：正常對照組(NC)、慢性肝炎組(CH)和抗組胺治療組(AH)。CH組采用復合因素造模(用40%四氯化碳油溶液皮下注射，同時輔以低蛋白、低膽堿、高脂肪、高醇飲食)，AH組在CH的基礎上給予抗組胺治療(酮替芬)。4周末處死動物，取血分別檢測血漿類胰蛋白酶(TS)和組胺(HA)水平，同時觀察肝臟組織學變化及肥大細胞形態改變。應用免疫組織化學方法觀察肝臟c-Kit和SCF的表達。用RT-PCR方法觀察肝組織c-Kit和SCF mRNA的表達水平。結果(1)與正常對照組比較，慢性肝炎組TS、血和肝組織HA水平均有明顯升高(P<0.05)，經抗組胺治療后，TS、血和肝組織HA水平均明顯降低(P<0.05)。(2)光鏡下，慢性肝炎組有脂肪變性和纖維化形成，而治療組肝損傷明顯減輕；甲苯胺藍染色可見慢性肝炎組肝臟血管周圍及纖維間隔內大量正在脫顆粒和已經脫顆粒的充滿紫色顆粒的肥大細胞。治療組僅見胞漿中充有少量紫色顆粒。定量統計發現，慢性肝炎組肥大細胞數目較正常對照組明顯升高(P<0.05)，抗組胺治療后，肥大細胞數目明顯減少(P<0.05)。(3)RT-PCR結果顯示抗組胺治療可以下調c-Kit和SCF mRNA表達水平(P<0.05)。免疫組織化學染色顯示慢性肝炎組高表達c-Kit和SCF(均P<0.05)，抗組胺治療可以下調二者的表達(P<0.05)，而且二者的表達均與HA水平呈明顯正相關。結論肥大細胞參與了實驗性肝炎的炎癥過程。酮替芬可以通過下調肥大細胞膜受體c-Kit及其配體SCF的表達使肥大細胞脫顆粒減少，組胺釋放減少，從而減輕肝臟炎癥。

肝炎，慢性； 大鼠； 抗組胺藥； 肥大細胞； c-Kit蛋白； 干細胞因子

干細胞因子(stem cell factor，SCF)又名肥大細胞生長因子(mast cell growth factor，MGF),是c-Kit配體,是一種新型多功能細胞因子[1]。SCF是一種不依賴IgE介導的成熟肥大細胞的激活因子[2],它與肥大細胞的受體c-Kit結合發揮作用,激活肥大細胞釋放多種介質,如組胺、肝素、蛋白激酶、白細胞介素等。局部組織長時間表達SCF可導致肥大細胞大量釋放活性介質,從而引起局部微循環機能障礙和組織損傷。那么在肝病是否如此?我們前期研究[3]結果表明：慢性乙型肝炎患者普遍存在的腸源性內毒素血癥，通過補體激活肥大細胞使之脫顆粒釋放組胺，組胺通過降低Th1細胞因子使慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)患者細胞免疫功能低下。那么有必要進行抗組胺治療以觀察其療效，在此我們擬觀察肝臟肥大細胞浸潤及c-Kit和SCF在肝臟組織的表達，以揭示酮替芬在受體水平上的抗組胺機制。

材 料 和 方 法

1材料

1.1動物 Wistar大鼠 30只，雌雄各半，體重230～290 g，山西醫科大學實驗動物中心提供。

1.2主要試劑 兔抗c-Kit和SCF多克隆抗體、正常羊血清、SABC免疫組化染色試劑盒和二氨基聯苯胺(diaminobenzidine,DAB)顯色試劑盒均購自武漢博士德公司；c-Kit和SCF mRNA引物由上海生工合成。

1.3動物處理及分組 肝炎模型的復制依據本室已建立的方法進行[4]。大體方法：除對照組動物以正常飲食外，其余22只動物以單純玉米面作為飼料(前2周為80%玉米面，20%豬油)，并混入0.5%膽固醇。10%乙醇為其唯一飲料。實驗組動物按上述條件飼養，每周測定其體重。實驗第1天，開始皮下注射40%四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4) 5 mL/kg，以后每3 d皮下注射3 mL/kg CCl4。實驗第4周末處死動物。

動物分3組：(1)正常對照組(normal control，NC)：8只正常動物，用無熱原生理鹽水灌胃，劑量同下; (2)慢性肝炎組(chronic hepatitis，CH)：11只肝炎動物，用無熱原生理鹽水灌胃，劑量同下，實驗過程中死亡1只，結束時剩10只動物;(3)抗組胺治療組(antihistamine，AH)：9只肝炎動物，同時灌胃：酮替芬1.25 mg/kg體重[5]。

2方法

2.1類胰蛋白酶(tryptase，TS)活力測定方法 采用專性底物(Nα-benzoyl-L-arginine-p-nitroanilide hydrochloride，BAPNA；購自Sigma),在405 nm測吸光度值。

2.2組胺測定

2.2.1血漿組胺測定 微量熒光測定法測定血中組胺含量。

2.2.2肝組織組胺測定 取10%三氯乙酸5 mL置于勻漿器內，再加入500 mg肝組織，用攪拌器將肝組織研成勻漿將勻漿離心15 min(3 000 r/min)，取1.6 mL上清液，置低溫冰箱待測。熒光法步驟同前。

2.3組織病理學和肥大細胞定量觀察 取大鼠肝左葉于10%中性甲醛固定，石蠟包埋，5 μm切片，用于HE及甲苯胺藍(toluidine blue，TB)染色。后者在每一切片任取10個視野(×200倍)，取其平均值，為該例組織的肥大細胞數。

2.4RT-PCR 總RNA的抽提：稱取100 mg肝組織，在液氮中將組織研磨成粉末，將粉末轉移到離心管中，加1.0 mL Trizol。加入200 μL氯仿/異戊醇(24∶1)，劇烈振蕩混勻30 s。12 000 r/min室溫離心5 min。將上清液小心轉移到RNase-free離心管中，加入等體積的異丙醇，室溫下放置5 min。12 000 r/min室溫離心5 min。小心移去上清液，防止RNA沉淀丟失。用70%乙醇洗滌2次，每次700 μL，12 000 r/min室溫離心2 min。盡可能徹底地吸走上清，在室溫下使乙醇完全揮發。沉淀用50 μL DEPC-H2O溶解(68 ℃10 min)，-20 ℃保存備用。

引物及擴增條件見表1。

用1.5%瓊脂糖凝膠，電泳電壓122 V，將 10 μL PCR 擴增產物和2 μL溴酚藍混勻后上樣。結果觀察：JDS7500紫外凝膠成像系統觀察電泳結果。圖像分析軟件分析其條帶相對強度，再除以β-actin 的灰度值為最終結果。

2.5免疫組化 用免疫組織化學 SABC 染色法。以 c-Kit和SCF陽性的肝組織切片作為陽性對照，用 PBS 和正常羊血清代替多克隆抗體作陰性對照。主要步驟：取大鼠左側肝組織，10%中性甲醛固定 48 h，經脫水、透明、浸蠟、包埋后切片，常規脫蠟至水化，3% H2O2滅活內源性過氧化物酶，熱抗原修復，封閉，加Ⅰ抗(c-Kit 為 1∶200，SCF 為1∶150), 4 ℃過夜；加生物素標記羊抗兔抗體；加 SABC 復合物,顯色,樹膠封片。光學顯微鏡觀察結果判定： 陽性染色為分布于細胞胞漿的棕黃色顆粒，陽性細胞記數方法為隨機記錄10個中倍(×200)視野陽性細胞數，求其平均值。

表1 引物及擴增條件

3統計學處理

數據以均數±標準差(mean±SD)表示，組間比較采用SPSS統計學軟件進行單因素方差分析，進一步兩兩比較用SNK法，兩變量的相關性用Pearson積矩相關分析法，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1血和肝組織中組胺濃度的變化

由表2可見，各組動物血漿和肝組織中組胺濃度具有相同的變化趨勢，慢性肝炎組明顯高于正常對照組，經抗組胺治療后濃度明顯降低(P<0.05)。

2肝臟病理改變

正常組動物肝組織HE染色見圖1A。4周末慢性肝炎組HE染色可見肝細胞脂肪變性，有大量炎癥

細胞浸潤及纖維組織增生，增生的纖維組織沿匯管區呈星狀分布，在遠端吻合有形成假小葉趨勢，但尚未形成假小葉，見圖1B?？菇M胺治療組肝細胞脂肪變性，僅有少量纖維組織增生，伴炎癥細胞浸潤，見圖1C。

表2各組大鼠血漿和肝勻漿組胺濃度變化

Table 2. The changes of plasma and liver homogenate HA content(Mean±SD)

GroupnPlasma(μg/L)Liverhomogenate(ng/100mg)NC878.09±38.5551.58±20.45CH10145.14±52.54*#106.59±43.15*#AH779.57±36.0160.71±26.51

NC:normal control;CH:chronic hepatitis;AH:antihistamine.*P<0.05vsNC；#P<0.05vsAH.

Figure 1. Pathological changes of hepatic tissues in rats (HE staining,×100).A: NC group; B: CH group; C: AH group.

圖1大鼠肝組織病理改變

3肥大細胞定量觀察結果和TS的變化

正常肝組織中肥大細胞數量極少，部分肝組織匯管區偶見3～5個，見圖2A。肥大細胞多分布在血管旁，呈彌散分布。肥大細胞胞漿內可見紅紫色顆粒，胞核呈藍色或無色。慢性肝炎組肝臟血管周圍及纖維間隔內可見正在脫顆粒和已經脫顆粒的充滿紫色顆粒的肥大細胞，見圖2B。治療組僅見胞漿中有少量紫色顆粒，見圖2C。由表3可見，慢性肝炎組肥大細胞數目較正常對照組明顯升高，抗組胺治療后，肥大細胞數目明顯減少，但仍較正常對照組增多(P<0.05)。TS水平在治療組明顯低于慢肝組(P<0.05)。

Figure 2. Mast cells in rat liver tissues (toluidine blue staining×200). A: NC group; B: CH group; C: AH group.

圖2大鼠肝臟肥大細胞

表3肥大細胞定量觀察結果和類胰蛋白酶的變化

Table 3. The results of mast cell quantitative observation and the changes of tryptase level(Mean±SD)

GroupnToluidineblueintensityTryptase(g/L)NC82.167±0.9240.476±0.143CH1010.920±1.575*#0.753±0.210*#AH76.525±1.534*0.551±0.196

*P<0.05vsNC；#P<0.05vsAH.

4肝組織中c-Kit和SCFmRNA表達水平

c-Kit mRNA(圖3)與SCF mRNA(圖4)的表達有相同的趨勢。在NC 肝組織中有少量表達，在CH 組表達上調，抗組胺治療可以下調二者的表達。

5肝組織c-Kit和SCF蛋白的表達

在正常肝臟門管區有少量c-Kit陽性細胞表達(胞漿著棕色顆粒)(圖5A)，而在慢性肝炎組(圖5B)，除了門管區有大量陽性細胞外，膽管細胞也有部分表達，經抗組胺治療后，表達量明顯減少(圖5C)。正常肝臟中幾乎不表達SCF(圖6A)，在慢肝組，管腔周圍和纖維浸潤區有SCF高表達(圖6B)，治療后表達明顯減少(圖6C)。經定量分析，二者有相同的變化趨勢，與正常對照組比較，慢肝組的陽性細胞明顯增多(P<0.05)，抗組胺治療后，陽性細胞數均明顯減少(P<0.05)，見表4。

6相關性分析

相關性分析可見，肝勻漿HA分別與c-Kit和SCF的表達呈正相關(r值分別為0.458和0.520，P<0.05)。結果表明，酮替芬通過下調c-Kit和SCF水平起到抗組胺作用。

Figure 3. The expression of c-Kit mRNA.Mean±SD.*P<0.05vsNC.

圖3c-KitmRNA的表達

Figure 4. The expression of SCF mRNA.Mean±SD.*P<0.05vsNC.

圖4SCFmRNA的表達

Figure 5. Expression of c-Kit in rat liver tissues (SABC,×200). A:NC group; B:CH group;C:AH group.

圖5大鼠肝組織c-Kit蛋白的表達

Figure 6. Expression of SCF in rat liver tissues (SABC,×200).A:NC group; B:CH group;C:AH group.

圖6大鼠肝組織SCF蛋白的表達

表4 肝組織中 c-Kit和SCF蛋白表達

*P<0.05vsNC；#P<0.05vsAH.

討 論

本實驗結果顯示，慢性肝炎組HE染色可見肝細胞脂肪變性，有大量炎癥細胞浸潤及纖維組織增生，但尚未形成假小葉；TB染色顯示肥大細胞數目增加；生化結果顯示組胺、類胰蛋白酶水平及肝臟組胺水平明顯升高，說明慢性肝炎時肥大細胞釋放組胺增多而形成高組胺血癥,與Ishii等[6]的研究結果相同。Shen[7]也發現盡管單純肝炎病毒感染與肝臟中肥大細胞數量無直接關聯，但肝臟炎癥時肥大細胞及其它免疫細胞聚集可導致肝臟炎癥更易朝慢性化發展。因此我們設想抗組胺治療不失為一種病毒性肝炎的輔助治療。

在抗組胺藥物選擇中，我們著重選擇能降低組胺水平的藥物。酮替芬為一新的抗變態反應藥物。其特點是兼具有很強的組胺H受體拮抗作用和肥大細胞膜穩定作用，能阻抑肥大細胞和嗜堿性粒細胞釋放組胺、慢反應物質等反應介質，口服有效，作用持續時間較長[8]。故我們選用酮替芬來進行抗組胺治療。實驗證明，抗組胺治療后，組織學觀察發現肥大細胞數目和脫顆粒均減少，血液和肝臟組胺濃度均明顯降低，類胰蛋白酶水平降低，再次證明前述關于慢肝時高組胺血癥的發生機制假說。抗組胺治療組肝細胞脂肪變性，僅有少量纖維組織增生，伴炎癥細胞浸潤，說明抗組胺治療后肝臟炎癥有所改善，纖維化程度減輕。Sanchez-Patan等[9]研究發現門脈高壓時肥大細胞數目及脫顆粒增多，預防性使用酮替芬后可以減輕炎癥、降低門靜脈壓力。與我們的結果類似，那么機制如何呢？

肥大細胞是功能活躍的先天和繼發免疫的效應細胞[10]，分別由MC表面的2種受體，即c-Kit受體(c-Kit原癌基因的產物)和IgE高親和力的FcεRI激活[11]。其中c-Kit受體對肥大細胞生物功能影響較大。在所有被檢測過的器官組織(如肝、肺、心臟、皮膚、子宮、消化道黏膜及腎) 中的肥大細胞表面均有c-Kit 的表達。c-Kit及其配體SCF 相互作用,在MC的成熟、增殖、分化[12-13]和介質釋放[14-15]過程中起重要作用,其分子機制可能與早期應答基因激活有關。Koyama等[16]研究發現，酮替芬可以抑制培養的鼻上皮細胞產生SCF。本實驗用免疫組化和RT-PCR兩種方法分別觀察了肝臟c-Kit和SCF的表達水平，結果顯示，經抗組胺治療后，肝組織c-Kit和SCF陽性細胞數目明顯減少，相應的mRNA水平降低，并且與肝勻漿組胺水平呈明顯正相關，可見酮替芬是通過下調肥大細胞膜表面受體c-Kit及其配體SCF水平來抑制肥大細胞脫顆粒，使得組胺釋放減少。

綜上所述，肥大細胞參與了實驗性肝炎的炎癥過程。酮替芬可以通過下調肥大細胞膜受體c-Kit及其配體SCF的表達使肥大細胞脫顆粒減少，組胺釋放減少，從而減輕肝臟炎癥，阻止肝纖維化發生。

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Effectsofantihistaminetreatmentonmastcellinfiltrationandc-KitandSCFexpressioninlivertissuesofratswithexperimentalhepatitis

LI Hong1, ZHAO Long-feng1, HAO Yan-qin1, YIN Lei2, ZHAO Yuan-chang2, HAN De-wu2

(1DepartmentofInfectiousDiseases,FirstHospital,2InstituteofHepaticDiseases,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China.E-mail:lihong6403@126.com)

AIM: To study the infiltration of mast cells and the expression of c-Kit and stem cell factor (SCF) in liver tissues of rats with experimental hepatitis and their changes after antihistamine (AH) treatment.METHODSThirty Wistar rats were divided into 3 groups at random: normal control (NC) group, chronic hepatitis (CH) group and AH group. The rat model of CH was established by composite factors (subcutaneous injection of carbon tetrachloride, accompanied by a diet containing high cholesterol, high alcohol, low protein and low choline). The rats in AH group were treated with ketotifen based on CH. At the end of the 4th week, blood samples were taken to determine plasma tryptase (TS) and histamine (HA) levels. Liver tissues were taken to detect HA content, observe the histological changes with HE staining and count the number of mast cells with toluidine blue (TB) staining. The mRNA and protein expression of c-Kit and SCF in liver tissues was detected by RT-PCR and immunohistochemistry.RESULTS(1) The plasma TS and HA levels and liver HA content in CH group were significantly increased compared with NC group (P<0.05), while those in AH group were obviously decreased compared with CH group (P<0.05). (2) Fatty degeneration and fibrosis were observed in CH group under light microscope, but the hepatic injury was obviously attenuated in AH group. TB staining showed there were many degranulating and degranulated mast cells filled with purple granules around liver blood vessels and in fiber interval in CH group, and there were few purple granules in the cytoplasm of mast cells in AH group. The number of mast cells in CH group was increased compared with NC group (P<0.05), and that in AH group was reduced compared with CH group (P<0.05). (3) The results of RT-PCR showed that AH down-regulated the expression of c-Kit and SCF mRNA (P<0.05). The expression of c-Kit and SCF proteins in liver tissues increased in CH rats (P<0.05vsNC group), decreased after AH treatment (P<0.05vsCH group) and was positively correlated with liver HA content (P<0.05).CONCLUSIONThese data suggest that an inflammatory pathway mediated by mast cell activation is involved in experimental hepatitis. Ketotifen can reduce mast cell degranulation by down-regulating the expression of mast cell membrane receptor c-Kit and its ligand SCF, thereby attenuating the liver inflammation.

Hepatitis,chronic; Rats; Antihistamines; Mast cells; c-Kit protein; Stem cell factor

R363

A

1000- 4718(2013)09- 1609- 06

2013- 03- 29

2013- 07- 30

山西省高校科技開發項目(No.20091174);山西醫科大學細胞生理學省部共建教育部重點實驗室主任基金資助項目(No.2010-03)

△通訊作者 Tel: 0351-4639767; E-mail: lihong6403@126.com

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.09.012