紅景天苷對非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝組織氧化應激的抑制作用

戴 寧， 鄒 原， 王慧芳， 戴木根

(大連醫科大學 1附屬第一醫院消化內科，2消化生理實驗室，遼寧 大連 116011)

紅景天苷對非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝組織氧化應激的抑制作用

戴 寧1△， 鄒 原2， 王慧芳1， 戴木根1

(大連醫科大學1附屬第一醫院消化內科，2消化生理實驗室，遼寧 大連 116011)

目的觀察紅景天苷(salidroside ,SDS)對大鼠非酒精性脂肪性肝炎(NASH)肝組織氧化應激的影響。方法以高脂高膽固醇飲食14周誘導建立大鼠NASH模型，藥物干預組在造模第8周末時給予SDS 300 mg·kg-1·d-1體重灌胃連續6周，在14周末檢測大鼠血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)，以及肝組織TC、TG、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽(GSH)含量的變化，ELISA檢測8-異前列腺素F2α(8-iso-PGF2α)的水平變化， HE染色觀察肝組織病理學變化，免疫組化觀察8-羥基脫氧鳥苷酸(8-OHdG)表達的變化。結果在14 周末， NASH模型組大鼠肝組織病理學檢查顯示肝組織呈中重度脂肪變性并同時伴有炎癥細胞浸潤；與正常對照組相比，NASH模型組大鼠血清ALT、AST、TG和TC，以及肝TG、TC和MDA的含量顯著上升，而肝SOD和GSH的含量顯著下降，8-iso-PGF2α的水平顯著上升，免疫組化顯示8-OHdG表達的陽性細胞數顯著增多。與模型組相比，SDS藥物干預組大鼠ALT、AST、TG、TC、MDA和8-iso-PGF2α的含量均顯著下降，而肝SOD和GSH的含量顯著上升，肝病理學變化得到顯著改善，8-OHdG表達的陽性細胞數明顯減少。結論SDS對高脂高膽固醇飲食誘導的NASH有較好的抑制效果，其機制可能與SDS的抗氧化作用有關。

非酒精性脂肪性肝炎； 紅景天苷； 氧化性應激； 大鼠

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一種無過量飲酒史，以肝細胞彌漫性大泡性脂肪變性和脂質儲積為主要特征的臨床病理綜合征，是肥胖、Ⅱ型糖尿病、高血壓病、高脂血癥等代謝綜合征在肝臟中的病理表現。NAFLD的病理變化隨肝病的進展而表現有單純性脂肪肝、脂肪性肝炎、脂肪性肝纖維化以及肝硬化、終末期肝衰竭。其中，非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis, NASH)是NAFLD進展為肝纖維化、肝硬化乃至終末期肝病的高危因素，積極探索NASH的防治研究對改善NAFLD的病程進展及預后具有重要意義。目前，較多的研究均證實NASH肝組織活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產生過多和抗氧化防御系統的失衡產生的氧化應激(oxidative stress)在NASH的發病機制中起關鍵作用[1]。紅景天苷(salidroside, SDS) 是青藏高原特有植物紅景天的主要藥效成分。以往的研究表明，紅景天苷具有較強的抗氧化及良好的抗肝損傷作用。為此, 我們以高脂高膽固醇飲食誘導NASH大鼠模型，從清除氧自由基這一角度出發探討紅景天苷防治NASH的作用機制。

材 料 和 方 法

1材料

1.1動物 清潔級雄性SD大鼠30只，體質量(140±20)g，由大連醫科大學實驗動物中心提供，合格證號為SCXIC(遼)2008-0002。

1.2實驗用藥 紅景天苷由陜西森弗高科實業有限公司提供(純度﹥98%)。每毫升蒸餾水中加入50 mg紅景天苷粉劑配制成混懸液備用。

1.3主要試劑 丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(aspartate transaminase，AST)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)和丙二醛(malondialdehyde， MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase， SOD)和谷胱甘肽(glutathione, GSH)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。大鼠8-異前列腺素F2α(8-isoprotstaglandin F2α,8-iso-PGF2α)ELISA試劑盒購自R&D。鼠抗8-羥基脫氧鳥苷酸(8-hydroxydeoxyguanosine，8-OHdG)為Abcam。鏈霉抗生物素蛋白-過氧化物酶(streptavidin-peroxidase,SP)染色試劑盒和濃縮型二甲基聯苯胺(diaminobenzidine,DAB)試劑均為福州邁新生物技術公司產品。

2方法

2.1大鼠NASH模型建立及動物分組 30只大鼠正常喂養1周后，隨機將其分為正常飼料組(n=10)和高脂高膽固醇飼料(87%正常飼料+15%豬油+2%膽固醇)組(n=20)。飼喂8周，將高脂飼料組大鼠再隨機分為NASH模型組(n=10)和藥物干預組(n=10)，在繼續飼喂高脂高膽固醇飼料的同時，藥物干預組給予紅景天苷水溶液300 mg·kg-1·d-1灌胃，每天1次，共6周。大鼠分籠飼養于(24±2)℃室溫、明暗各12 h的動物實驗室內。實驗動物每3 d稱量體重1次，并根據體重調整用藥劑量。在第14周末，大鼠隔夜禁食12 h，3%戊巴比妥鈉麻醉處死所有動物，迅速按常規分離血清，采血后迅速摘取肝臟稱重，-80 ℃ 冷凍保存。測定時將低溫保存的肝組織標本于4 ℃冰箱中解凍, 加10 倍的HEPES 緩沖液勻漿，以3 000 r/ min 離心15 min，-4 ℃保存上清待測。

2.2血清和肝臟生化指標的檢測 血清ALT、AST、TG、TC和肝勻漿TG、TC、MDA、SOD、GSH含量的檢測，嚴格按試劑盒要求規范操作。

2.3肝8-iso-PGF2α含量的測定 使用雙抗體夾心ELISA法檢測肝組織中8-iso-PGF2α含量，主要試劑包括純化的羊抗兔IgG 抗體包被的微孔板、8-iso-PGF2α標準物、抗血清和膽堿酯酶標記的抗原等。定量檢測在酶標儀(Bio-Rad)上進行，嚴格按試劑盒要求規范操作。檢測結果以每克肝組織8-iso-PGF2α的含量(ng/g) 表示。

2.4病理形態學觀察 肝組織10%甲醛固定，常規制備組織石蠟切片，HE 染色。在200 倍光鏡下根據NAFLD 活動度積分(NAFLD activity score，NAS)標準進行評分，肝細胞脂肪變評分：0 分(肝實質內脂變肝細胞占總細胞的比例<5%)；1 分(5%～33%)；2 分(34%～66%)；3 分(>66%)。小葉內炎癥(200 倍鏡計數壞死灶)：0 分(無)；1 分(<2 個)；2 分(2～4 個)；3 分(>4 個)。肝細胞氣球樣變：0 分(無)；1 分(少見)；2 分(多見)。3項積分之和為NAFLD。NAS>4 分則診斷為NASH，3～4 分為可疑NASH[2]。

2.5肝8-OHdG免疫組織化學染色 甲醛固定的肝組織進行常規石蠟包埋、切片脫蠟至水， 95 ℃微波15～20 min組織抗原修復； 3%過氧化氫溶液中室溫孵育5～10 min，阻斷內源性過氧化物酶，用PBS沖洗3次，兔血清封閉，加Ⅰ抗anti-8-OHdG(工作濃度1∶100)，4 ℃過夜，PBS沖洗3次，加生物素標記的Ⅱ抗，37 ℃孵育15 min，PBS沖洗3次，加SP溶液，37 ℃孵育15 min，PBS沖洗3次， DAB顯色，蘇木素復染，脫水，透明，封片。以PBS代替Ⅰ抗作陰性對照。結果判定：以細胞核和細胞漿染成棕黃色為陽性細胞。采用Image-Pro Plus 5.1專業圖像分析軟件分析免疫組化染色結果。所有切片在200倍光鏡下對免疫組化染色的陽性表達進行定量分析，計算陽性染色的平均積分吸光度(MIA)。MIA=積分吸光度(IA)/測量區域面積。上述各組大鼠免疫組化檢測過程均采用盲法進行。

3統計學處理

采用SPSS 13.0 統計軟件進行單因素方差分析，計量資料用均數±標準差(mean±SD)表示，組間比較用LSD檢驗，以P<0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1紅景天苷對大鼠血清ALT和AST活性的影響

在第14周末，NASH模型組大鼠反映肝細胞損傷的ALT和AST顯著高于正常飼料組；與模型組相比，紅景天苷則能顯著降低NASH大鼠升高的ALT和AST,見表1。

2紅景天苷對大鼠血清和肝臟脂質的影響

在第14周末，NASH模型組大鼠血清和肝臟TG和TC的含量顯著高于正常飼料組；與模型組相比，紅景天苷則能顯著降低NASH大鼠升高的TG和TC,見表1、2。

表1 各組大鼠血清ALT、AST、TG和TC含量變化的比較

#P<0.05,##P<0.01vscontrol group；*P<0.05,**P<0.01vsNASH model group.

表2各組大鼠肝臟TG和TC含量變化的比較

Table 2. Effects of SDS (300 mg·kg-1·d-1) on liver levels of TG and TC in NASH rats (mmol/L.Mean±SD.n=10)

GroupTGTCControl1.51±0.090.95±0.12NASHmodel2.43±0.12##1.96±0.07#SDStreatment1.52±0.13**1.01±0.05*

#P<0.05,##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsNASH model group.

3紅景天苷對大鼠肝臟氧化和抗氧化狀態的影響

在第14周末，NASH模型組大鼠肝臟MDA的含量顯著升高， 抗氧化劑SOD和GSH的含量顯著低于正常飼料組；與模型組相比，紅景天苷則能顯著抑制NASH大鼠肝MDA的升高，同時明顯提高肝SOD和GSH的含量，見表3。

4紅景天苷對大鼠肝臟8-iso-PGF2α含量的影響

在第14周末，NASH模型組大鼠肝臟8-iso-PGF2α的含量顯著升高；與模型組相比，紅景天苷則能顯著抑制NASH大鼠肝8-iso-PGF2α的升高，見表3。

表3各組大鼠肝臟MDA、SOD、GSH和8-iso-PGF2α含量變化的比較

Table 3. Effects of SDS (300 mg·kg-1·d-1) on liver levels of MDA, SOD, GSH and 8-iso-PGF2αin NASH rats (Mean±SD.n=10)

GroupMDA[μmol/(gprotein)]SOD[103U/(gprotein)]GSH[mg/(gprotein)]8-iso-PGF2α(ng/g)Control0.61±0.22101.51±2.5813.15±2.6576.61±29.21NASHmodel1.71±0.23##46.42±9.31##6.48±1.25##197.51±98.66#SDStreatment0.67±0.18**97.21±3.52**12.23±1.32**90.76±74.52*

#P<0.05,##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsNASH model group.

5紅景天苷對大鼠肝組織病理學變化的影響

光鏡下HE染色顯示，在第14周末， NASH模型組大鼠肝臟呈現中、重度肝細胞脂肪變性，同時伴有小葉內炎癥細胞浸潤及點狀壞死，但未見明顯的肝纖維化改變；而紅景天苷則能顯著逆轉NASH肝病理學的改變，光鏡下可見有少量的脂滴，浸潤的炎癥細胞消失，見圖1。NASH模型組大鼠NAS明顯高于正常組，與模型組比，紅景天苷組NAS顯著降低，見表4。

6紅景天苷對大鼠肝組織8-OHdG免疫組化的影響

正常飼料組大鼠肝組織偶見散在微弱的8-OHdG 陽性表達細胞，NASH模型組大鼠肝組織可見大量的8-OHdG陽性表達細胞，胞核胞漿均有表達，而紅景天苷組8-OHdG陽性表達細胞數顯著減少，見圖2。NASH模型組大鼠MOD值顯著高于正常組，與模型組比，紅景天苷組MOD值顯著降低，見表4。

Figure 1. Pathological changes in rat hepatic tissues from different groups (HE staining, ×200).A:control;B:NASH model;C:SDS (300 mg·kg-1·d-1) treatment.

圖1各組大鼠肝臟組織病理學變化

Figure 2. Expression of 8-OHdG in rat hepatic tissues from different groups (immunohistochemical staining,×200).A:control;B:NASH model;C:SDS (300 mg·kg-1·d-1) treatment.

圖2各組大鼠肝臟組織8-OHdG表達的變化

表4各組大鼠肝組織病理NAS和8-OHdG免疫組化MOD變化的比較

Table 4. Effects of SDS (300 mg·kg-1·d-1) on liver tissue NAFLD activity score (NAS) and 8-OHdG immunohistochemical mean integral absorbance (MIA) in NASH rats (Mean±SD.n=10)

GroupNASMIAControl0.00±0.000.175±0.036NASHmodel5.75±0.61##0.315±0.743#SDStreatment1.09±0.27**0.201±0.315*

#P<0.05,##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsNASH model group.

討 論

本研究中，我們通過高脂高膽固醇飲食持續喂養SD大鼠14 周，成功建立了NASH大鼠模型。NASH大鼠血清ALT、AST、TG、TC及肝臟TG、TC的含量均顯著升高，病理顯示肝臟組織出現中重度彌漫性肝細胞脂肪變性，伴有炎癥細胞浸潤和壞死等特征，符合NASH的病理學改變[2]。

目前，NASH的發病機制尚不十分清楚。大量研究認為，NASH的發病過程經歷“二次打擊”。其中，各種因素引起的肝細胞脂肪積聚和脂肪變性作為“初次打擊”，而脂肪肝的形成則降低了肝細胞的解毒功能，使肝細胞對額外打擊(如活性氧自由基等)的敏感性上升，更易產生嚴重的肝組織損傷；第二次打擊則以氧化應激/脂質過氧化損傷為中心，高脂高膽固醇飲食可使NASH肝組織的氧化應激增強，導致單純性脂肪肝進一步發展為脂肪性肝炎、肝纖維化甚至肝硬化,而抑制NASH的氧化應激，則能有效防治NASH及其肝纖維化的發生發展[3]。肝細胞含有豐富的線粒體，NAFLD時，肝細胞線粒體的形態、功能均發生了變化，是肝組織ROS的重要來源[4]。其次，NASH時肝細胞色素P450 2E1的表達上調則是ROS的另一重要來源[5]。過多的ROS攻擊生物膜而發生脂質過氧化反應，使其主要產物MDA的含量增加；同時耗竭SOD、GSH等肝細胞內重要的抗氧化酶，促使氧化物與抗氧化物之間的動態平衡失調，出現氧化應激，氧應激可進一步刺激肝星狀細胞分泌細胞外基質而導致肝纖維化的發生[6]。8-iso-PGF2α是細胞膜上花生四烯酸發生脂質過氧化作用后的產物。由于這一過程不需要酶催化, 在體內含量非常穩定, 故被認為是判斷活體內自由基氧化強度和臨床上作為評價抗氧化劑療效的最理想的生化指標。8-iso-PGF2α的增多, 可使細胞的完整性受到破壞、膜的流動性發生改變, 從而導致細胞的結構、功能受損, 甚至導致細胞凋亡。臨床研究表明，NASH患者尿8-iso-PGF2α的含量顯著增多，并與肝組織炎癥和線粒體異常呈現顯著的相關性[7]。8-OHdG是細胞DNA氧化損傷的標志，過多的ROS攻擊DNA，導致DNA鏈斷裂、堿基修飾等氧化性DNA損傷，形成DNA加合物8-OHdG。8-OHdG累積最終引起細胞基因突變和癌發生，是原發性肝癌發生的獨立危險因素[8]。NASH患者肝組織8-OHdG的表達顯著高于單純性脂肪肝[9]。抗氧化劑抑制8-OHdG的表達上調能有效治療NASH及伴隨的肝臟腫瘤的發生[10]。

我們的實驗結果表明，紅景天苷能顯著降低高脂高膽固醇飲食誘導的NASH大鼠升高的血清ALT、AST、TG、TC及肝臟TG、TC的含量，有效逆轉NASH的肝臟脂肪變性和炎癥改變，同時能顯著降低NASH肝組織的ROS,抑制8-iso-PGF2α的上升,拮抗肝細胞DNA的氧化損傷，并提高肝組織抗氧化酶的含量，表明紅景天苷對NASH大鼠良好的防治作用可能與其較強的抗氧化作用有關。

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Inhibitoryeffectofsalidrosideonliveroxidativestressinratswithnon-alcoholicsteatohepatitis

DAI Ning1, ZOU Yuan2, WANG Hui-fang1, DAI Mu-gen1

(1DepartmentofGastroenterology,theFirstAffiliatedHospital,2LaboratoryofDigestivePhysiology,DalianMedicalUniversity,Dalian116011,China.E-mail:dainingdn@163.com)

AIM: To explore the effects of salidroside (SDS) on the oxidative stress in liver tissues from rats with non-alcoholic steatohepatitis (NASH).METHODSThe experimental animal model of NASH was established in SD rats fed on high-fat and high-cholesterol diet (HFHCD) for 14 weeks. SDS (300 mg·kg-1·d-1) was administered via gavage daily from the 8th week after HFHCD feeding. At the end of the 14th week, serum samples were taken for detection of alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), triglyceride (TG) and total cholesterol (TC). Liver tissues were taken for TG, TC, malondialdehyde (MDA), superoxide dismutase (SOD) and glutathione (GSH) detection. The content of 8-isoprostaglandin F2α(8-iso-PGF2α) in liver tissues was determined by ELISA. The liver histopathological changes were observed under microscope with HE staining. The expression of 8-hydroxydeoxyguanosine (8-OHdG) in liver tissues was determined by immunohistochemical staining.RESULTSAt the end of the 14th week, ALT, AST, TG and TC in serum, and TG, TC, MDA and 8-iso-PGF2αin liver homogenate in NASH model group were significantly increased compared with control group, while SOD and GSH in liver tissues were significantly decreased. The liver expression of 8-OHdG in NASH model group was higher than that in control group. Compared with NASH model group, SDS significantly inhibited the elevation of serum ALT, AST, TG and TC, and liver TG, TC, MDA and 8-iso-PGF2α, but increased the levels of SOD and GSH in liver tissues. Meanwhile, the liver histopathological score and 8-OHdG expression were decreased in SDS treatment group.CONCLUSIONSalidroside can effectively inhibit steatohepatitis induced by HFHCD, and its antioxidant effect may be one of the mechanisms.

Non-alcoholic steatohepatitis; Salidroside; Oxidative stress; Rats

R575.5

A

1000- 4718(2013)09- 1704- 05

2013- 04- 23

2013- 07- 11

△通訊作者 Tel:0411-83635963-2173; E-mail: dainingdn@163.com

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.09.030