Nrf2過表達對乙醇刺激下肝星狀細胞激活與增殖及合成I型膠原的影響*

劉 曼， 何 月， 張吉翔

(南昌大學第二附屬醫院消化內科，江西省分子重點實驗室，江西 南昌 330006)

Nrf2過表達對乙醇刺激下肝星狀細胞激活與增殖及合成I型膠原的影響*

劉 曼， 何 月， 張吉翔△

(南昌大學第二附屬醫院消化內科，江西省分子重點實驗室，江西 南昌 330006)

目的探討核因子E2相關因子2(nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)過表達對乙醇誘導下大鼠肝星狀細胞系HSC-T6激活與增殖及I型膠原mRNA及蛋白表達水平的影響。方法采用脂質體介導法對HSC-T6進行pEGFP-Nrf2重組質粒及pEGFP-N1空載質粒瞬時轉染，將細胞分為正常對照組、乙醇刺激組、乙醇刺激+pEGFP-Nrf2質粒組和乙醇刺激+ pEGFP-N1空載質粒組。采用RT-PCR及Western blotting方法對HSC-T6中Nrf2、I型膠原及α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)mRNA及蛋白表達水平進行檢測，采用MTT法對HSC-T6細胞增殖水平進行檢測，采用流式細胞術對HSC-T6細胞周期分布進行檢測。結果(1) 熒光顯微鏡下觀察顯示pEGFP-Nrf2質粒成功轉染HSC-T6，轉染后48h Nrf2 mRNA及蛋白表達水平較其余組顯著升高(P<0.05)。(2) 乙醇刺激組與乙醇刺激+ pEGFP-N1空載質粒組之間細胞增殖水平、I型膠原、α-SMA mRNA及蛋白表達水平差異無統計學意義(P>0.05)，均明顯高于正常對照組(P<0.05)，細胞周期分布G1期比例下降，S期比例升高(P<0.05)，而乙醇刺激+ pEGFP-Nrf2質粒組細胞增殖水平及I型膠原、α-SMA mRNA及蛋白表達水平與乙醇刺激組及乙醇刺激+ pEGFP-N1空載質粒組相比均顯著下降(P<0.05)，細胞周期分布G1期比例顯著上升，S期比例顯著下降(P<0.05)，呈G1/S期阻滯。結論Nrf2過表達可顯著抑制乙醇對HSC-T6 I型膠原及α-SMA mRNA及蛋白表達的促進作用，使HSC-T6細胞周期發生G1/S期阻滯，抑制乙醇誘導的HSC-T6增殖水平的升高，提示其對乙醇誘導的HSC-T6細胞活化具有負性調控作用。

肝纖維化； 肝星狀細胞； 核因子E2相關因子2； I型膠原； α-平滑肌肌動蛋白

氧化應激致肝星狀細胞(hepatic stellate cells, HSCs)活化是酒精性肝纖維化(alcoholic liver fibrosis，ALF)發生的中心環節[1]。過度攝入的乙醇及其代謝產物是引起肝臟內氧化應激的主要介質，當肝內處于持續氧化應激的環境時，肝星狀細胞被激活，表型向肌成纖維樣細胞(myofibroblast-like cells)轉化，分泌大量細胞外基質(extracellular matrix, ECM)導致肝內基質沉積，最終引起肝纖維化乃至肝硬化[2]。核因子E2相關因子2(nuclear factor E2-related factor 2, Nrf2)作為調節抗氧化應激反應的重要轉錄因子，可增強細胞對氧化應激和親電子化學物質的抗性[3]。而Nrf2對乙醇誘導下HSCs活化水平的影響，目前國內外尚未見報道。為此，本研究應用體外細胞培養技術，以乙醇刺激HSCs增殖活化，在脂質體介導下瞬時轉染Nrf2重組質粒，探討Nrf2對乙醇誘導下HSCs增殖水平、細胞周期分布及活化標志蛋白α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)、 I型膠原(collagen type I, ColⅠ)mRNA和蛋白表達水平的影響。

材 料 和 方 法

1材料

大鼠肝星狀細胞系HSC-T6購自湘雅細胞庫，系SV40轉染SD大鼠HSCs而成，具有活化HSCs的表型[4]。pEGFP-Nrf2重組質粒及空載質粒pEGFP-N1合成于Invitrogen(項目編號：KL120712001)。轉染試劑LipofectamineTM2000購自Invitrogen。培養基DMEM購自HyClone。胰蛋白酶和胎牛血清購自Solarbio。TRIzol RNA提取試劑盒和DMSO購自北京全式金生物技術公司。逆轉錄試劑盒購自TaKaRa。各目的基因引物由上海生工生物工程公司合成。2×Taq PCR SuperMix購自北京全式金生物技術公司。總蛋白提取試劑盒購自北京普利萊基因技術有限公司。兔抗Nrf2多克隆抗體、兔抗α-SMA多克隆抗體、兔抗Col I多克隆抗體和鼠抗β-肌動蛋白單克隆抗體購自Proteintech。辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔Ⅱ抗及山羊抗鼠Ⅱ抗購自北京中杉金橋公司。FACSCalibar流式細胞儀為Beckton Dickinson產品。

2方法

2.1HSC-T6細胞的培養及傳代 HSC-T6復蘇后采用含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的高糖DMEM培養,置于5% CO2、37 ℃孵箱培養。細胞復蘇培養至80%～90%融合度左右進行傳代。將濃度為1×108cells/L HSC-T6細胞懸液接種于6孔培養板中，每孔2 mL，37 ℃、5% CO2孵箱培養24 h后隨機分為4組：(1)正常對照組；(2)乙醇刺激組；(3)乙醇刺激+pEGFP-Nrf2質粒組；(4)乙醇刺激+ pEGFP-N1空質粒組。(2)～(4)組中乙醇終濃度均為100 mmol/L[5]，每組設3復孔。

2.2pEGFP-Nrf2質粒瞬時轉染 轉染前24 h在不含抗生素的培養基中接種適量細胞使轉染時細胞的匯合度達到50%左右。以LipofectamineTM2000作為轉染介質，參考LipofectamineTM2000試劑盒說明書，混合轉染試劑及質粒再按組加入繼續培養4～6 h后棄培養基，更換新鮮無雙抗培養基繼續培養至48h后收集細胞。

2.3RT-PCR檢測pEGFP-Nrf2質粒轉染對HSC-T6中Nrf2、α-SMA和Col I mRNA表達的影響 HSC-T6分組處理完成收集細胞后,采用TRIzol試劑進行細胞總RNA提取，紫外分光光度計檢測濃度。逆轉錄為cDNA，以此為模板進行PCR擴增。目的基因引物序列見表1。參照Two-Step RT-PCR試劑盒操作說明書進行RT-PCR，總反應體積50.0 μL，其中2× TransTaqTMHiFi PCR SuperMixⅡ 25.0 μL，ddH2O 21.0 μL，上游引物 1 μL(10.0 μmol/L)，下游引物 1 μL (10.0 μmol/L)，cDNA 2 μL。擴增條件：Nrf2：94 ℃ 5 min；94 ℃ 35 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 35 s，35個循環；72 ℃ 7 min。α-SMA：94 ℃ 5 min；94 ℃ 35 s，63 ℃ 35 s，72 ℃ 35 s，35個循環；72 ℃ 7 min。Col I：94 ℃ 5 min；94 ℃ 35 s，62 ℃ 35 s，72 ℃ 35 s，35個循環；72 ℃ 7 min。β-actin ：94 ℃ 5 min；94 ℃ 35 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 35 s，35個循環；72 ℃ 7 min。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，用暗箱式紫外投射儀觀察電泳結果并照相。結果用BANDLEAD 3.00軟件計算基因相對表達值。實驗均重復3次。目的基因相對表達值以目的基因條帶/β-actin基因條帶的吸光度值進行分析。

表1 引物序列

2.4Western blotting檢測pEGFP-Nrf2質粒轉染對HSC-T6中Nrf2、α-SMA和ColⅠ蛋白表達水平的影響 HSC-T6細胞分組處理完成收集細胞后進行細胞總蛋白提取和測定：棄培養基，用無菌磷酸鹽緩沖溶液洗滌后消化收集細胞；按照蛋白抽提試劑盒說明書，分別加入蛋白裂解液及抽提試劑，4 ℃離心機離心收集蛋白，BCA法測定各組蛋白濃度后，取20～40 μg細胞總蛋白經5×上樣緩沖液和3%SDS配平蛋白至同體積后進行10%SDS-PAGE電泳，轉移至PVDF膜上，以5%脫脂奶粉封閉后，分別與Nrf2Ⅰ抗(1∶1 000)、α-SMAⅠ抗(1∶800)、ColⅠⅠ抗(1∶800)和β-actinⅠ抗(1∶1 000)孵育過夜，洗滌后加入相應Ⅱ抗，加入底物化學發光試劑后X膠片曝光，曝光顯影的目的條帶用Quantity One 4.62處理軟件進行半定量分析，以內參照為參考標準計算出目的條帶標準化后的吸光度值，以此判斷蛋白相對表達量。實驗均重復3次。

2.5MTT檢測細胞增殖能力 轉染前24 h用胰蛋白酶消化收集細胞，以1×104cells/well濃度接種于96孔板中，每組分別接種6個復孔，空白調零孔只加不含細胞的培養基。實驗處理后，每孔加入5 g/L MTT溶液20 μL，繼續培養4 h后棄上清，加入150 μL DMSO，置搖床上避光低速振蕩15 min，酶標儀測定492 nm處各孔的吸光度(A)，計算各組平均值。

2.6流式細胞術檢測細胞周期分布 取對數生長期細胞，調整細胞密度并將細胞接種于培養皿中，24 h待細胞貼壁后進行細胞處理。處理完成后消化收集各組細胞，用PBS洗滌細胞1次，再用700 mL/L冷乙醇4 ℃固定過夜。染色前用PBS洗去固定液，按照Cell Cycle Detection Kit 提供的方法加入RNase A 37 ℃水浴30 min，再加入碘化丙啶4 ℃避光30 min，應用FACSCalibar流式細胞儀分析細胞周期，得出細胞各周期的百分率。

3統計學處理

用SPSS 13.0統計軟件分析。數據用均數±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1pEGFP-Nrf2/N1質粒轉染結果

通過LipofectamineTM2000脂質體轉染方式將Nrf2重組質粒pEGFP-Nrf2和空質粒pEGFP-N1轉染入HSC-T6細胞24 h后，熒光顯微鏡下可見pEGFP-Nrf2組和pEGFP-N1組均有綠色熒光蛋白表達，見圖1。pEGFP-Nrf2質粒轉染后HSC-T6細胞內Nrf2蛋白表達水平與對照組相比均顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

Figure 1. The green fluorescent protein expression of pEGFP-Nrf2 and pEGFP-N1 under fluorescence microscope(×100).

圖1熒光顯微鏡下觀察重組質粒pEGFP-Nrf2及空質粒pEGFP-N1綠色熒光蛋白的表達

Figure 2. Western blotting analysis of Nrf2 protein expression in HSC-T6 cells after plasmid transfection. A：control group; B: pEGFP-Nrf2 group; C: pEGFP-N1(control vector) group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖2Westernblotting檢測質粒轉染后HSC-T6細胞內Nrf2蛋白的表達

2各組細胞內α-SMA和ColⅠmRNA的表達

與空白對照組相比，乙醇刺激組和pEGFP-N1空載質粒+乙醇刺激組α-SMA和ColⅠmRNA表達水平均顯著升高(P<0.01)，兩組之間相比差異無統計學意義(P>0.05)，而轉染pEGFP-Nrf2質粒+乙醇刺激組α-SMA和ColⅠmRNA表達水平較乙醇刺激組、pEGFP-N1空載質粒+乙醇刺激組顯著下降，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3。

3各組細胞內α-SMA和ColⅠ蛋白的表達

與空白對照組相比，乙醇刺激組和pEGFP-N1空載質粒+乙醇刺激組α-SMA和ColⅠ蛋白表達水平均顯著升高(P<0.05)，兩組之間相比差異無統計學意義(P>0.05)，而轉染pEGFP-Nrf2質粒+乙醇刺激組α-SMA和ColⅠ蛋白表達水平較乙醇刺激組和pEGFP-N1空載質粒+乙醇刺激組顯著下降，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖4。

4各組細胞增殖水平比較

乙醇刺激組和乙醇刺激+空載質粒組所測得A值與空白組相比顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)，而這兩組之間相比差異無統計學意義(P>0.05)；乙醇刺激+pEGFP-Nrf2組所測得A值與乙醇刺激組和乙醇刺激+空載質粒組相比顯著下降，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

Figure 3. Expression levels of Nrf2,α-SMA and ColⅠ mRNA in HSC-T6 cells detected by RT-PCR. M: marker；A：control group; B: ethanol group; C: ethanol + pEGFP-Nrf2 group; D: ethanol + pEGFP-N1(control vector) group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsA;#P<0.05vsB or D.

圖3RT-PCR檢測HCS-T6細胞Nrf2、α-SMA和Col1mRNA的表達

5各組細胞周期分布情況

與空白對照組細胞相比，乙醇刺激組和乙醇刺激+空載質粒組G1期細胞比例下降，S期細胞比例上升，差異有統計學意義(P<0.05)，而這兩組之間各期細胞比例差異無統計學意義(P>0.05)；pEGFP-Nrf2轉染+乙醇刺激組所測得細胞G1期比例較乙醇刺激組和乙醇刺激+空載質粒組顯著升高，而S期細胞比例顯著下降，差異有統計學意義(P<0.05)，提示Nrf2過表達可使乙醇刺激下的HSC-T6細胞發生G1/S期阻滯。各組G2期細胞比例相比差異無統計學意義(P>0.05)，見圖5。

Figure 4. The expression of Nrf2,α-SMA and Col I proteins. A：control group; B: ethanol group; C: ethanol + pEGFP-Nrf2 group; D: ethanol + pEGFP-N1(control vector) group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsA;#P<0.05vsB or D.

圖4Nrf2、α-SMA及ColI蛋白的表達

表2各組細胞增殖水平比較

Table 2. Comparison of the cell proliferation among the four groups(Mean±SD.n=6)

GroupAvalueControl0.533±0.128Ethanol1.219±0.157*Ethanol+pEGFP-Nrf20.828±0.124#Ethanol+pEGFP-N11.241±0.143*

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsethanol group or ethanol+pEGFP-N1 group.

討 論

酒精性肝纖維化是長期過量飲酒導致的一種慢性肝臟疾病，最初表現為酒精性脂肪肝，進而發展為酒精性肝炎、肝纖維化乃至肝硬化[6]。酒精性肝病是歐美國家人群中慢性肝病的主要原因[7]，近年來在我國發病率也呈現上升趨勢[8]，嚴重威脅國民健康。目前認為，肝纖維化是酒精性肝病發病過程中的轉折點，在此階段如能及時去除導致肝纖維化的不利因素有可能中止肝纖維化的進程甚至使病變向良性方面轉歸[9]。因此，對酒精性肝纖維化的發病機制及治療靶點的研究勢在必行。

過度攝入的乙醇及其代謝產物攻擊細胞膜產生大量活性氧促發脂質過氧化酶鏈式反應并導致過氧化產物大量堆積，由此引起肝臟內持續氧化應激狀態，可直接攻擊HSCs促其活化，也可通過誘導NF-κB、AP-1和MAPK等炎癥信號通路活化，導致肝Kupffer細胞激活并進一步分泌大量細胞因子如轉化生長因子 β(transforming growth factor β,TGF-β)、血小板源性生長因子(platelet-derived growth factor,PDGF) 等進而激活HSCs[1]。HSCs活化后表型向肌成纖維樣細胞轉化，細胞增殖水平升高，表達其活化標志蛋白α-SMA,分泌大量細胞因子及以Col I為主的細胞外基質導致肝內基質沉積，最終引起肝纖維化乃至肝硬化[10]。因此，抑制乙醇及其代謝產物導致的肝內氧化應激水平對于逆轉乙醇誘導的HSCs活化及肝纖維化進展具有重要意義。

Nrf2屬于堿性亮氨酸拉鏈蛋白家族(basic leucine-zipper,bZIP)中調節抗氧化應激反應的重要轉錄因子[11]。通常情況下，Nrf2與其特異性受體Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白 1(Kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1)偶聯結合于胞漿而使Nrf2活性處于相對抑制狀態。Keap1是一個富含巰基的蛋白，在接受細胞外信號如氧化應激等刺激后，Keap1巰基交聯并發生構型轉變，導致Nrf2與Keap1解偶聯因此活化并發生核轉移。Nrf2進入核內與抗氧化反應元件(antioxidant response element,ARE)結合，啟動Ⅱ相解毒酶及抗氧化酶基因的表達，包括血紅素氧合酶1、NAD(P)H:醌氧化還原酶1、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽等，增強細胞對氧化應激和親電子化學物質的抗性。Nrf2 -Keap1抗氧化系統與疾病的關系是近幾年的研究熱點，在預防肺纖維化、糖尿病、神經系統疾病等方面均有報道[12-14]，近年研究認為Nrf2對各類肝臟疾病也具有重要保護作用[15]。Wu等[3]提出，Nrf2活化對乙醇誘導的肝內氧化應激及肝臟損傷具有重要保護作用，然而該研究并未在細胞水平研究Nrf2對HSCs活化的影響。此外，Oh等[16]研究發現，蘿卜硫素可通過活化Nrf2而抑制促纖維化信號通路TGF-β/Smad活性，提示Nrf2在抑制肝纖維化進展中發揮重要作用。然而，上述研究均未靶向HSCs研究Nrf2過表達對乙醇誘導下HSCs活化情況的影響。本研究通過脂質體瞬時轉染Nrf2重組質粒上調Nrf2表達，觀察Nrf2過表達對乙醇誘導下HSC-T6細胞增殖水平及α-SMA、Col I表達的影響。實驗結果表明，pEGFP-Nrf2成功轉染HSC-T6細胞，可有效過表達Nrf2；與空白對照組相比，乙醇刺激可顯著升高HSC-T6細胞增殖水平并促進α-SMA、ColⅠmRNA及蛋白表達，而在乙醇刺激的基礎上轉染pEGFP-Nrf2使Nrf2過表達，可顯著抑制乙醇刺激引起的HSC-T6細胞增殖水平及α-SMA、ColⅠ表達的升高。

Figure 5. Flow cytometric analysis of cell cycle. A：control group; B: ethanol group; C: ethanol + pEGFP-Nrf2 group; D: ethanol + pEGFP-N1(control vector) group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsA;#P<0.05vsB or D.

圖5流式細胞術檢測細胞周期

既往研究表明，Nrf2在細胞周期調控中發揮重要作用[17-18]，然而針對HSCs研究Nrf2對乙醇刺激下HSCs細胞周期分布的影響目前尚無人研究。為探討Nrf2是否通過影響HSCs細胞周期分布進而調控HSCs增殖活化，本實驗采用流式細胞術檢測，發現pEGFP-Nrf2轉染+乙醇刺激組細胞G1期比例較乙醇刺激組與乙醇刺激+空載質粒組顯著升高，而S期細胞比例顯著下降，細胞周期分布呈現G1/S期阻滯現象。推測其原因，Nrf2可能通過抑制乙醇刺激下HSCs的氧化應激水平進而影響細胞周期分布，也可能直接參與細胞周期蛋白的調控，因此進一步探究Nrf2對HSCs中細胞周期調控蛋白的影響也許能為Nrf2調控乙醇誘導的HSCs活化的研究領域提供新思路。

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EffectsofNrf2overexpressiononproliferation,activationandcollagentypeIsynthesisinculturedhepaticstellatecellsstimulatedbyethanol

LIU Man, HE Yue, ZHANG Ji-xiang

(DepartmentofGastroenterology,theSecondAffiliatedHospital,JiangxiProvincialKeyLaboratoryofMolecularMedicine,NanchangUniversity,Nanchang330006,China.E-mail:jixiangz@tom.com)

AIM: To investigate the effects of nuclear factor E2-related factor 2 (Nrf2) overexpression on the proliferation, cell cycle distribution, collagen type I (Col I) synthesis and alpha-smooth muscle actin (α-SMA) expression in cultured hepatic stellate cell line HSC-T6 stimulated by ethanol.METHODSCultured HSC-T6 cells were transfected with pEGFP-Nrf2 or pEGFP-N1 (empty vector) plasmid by liposome transient transfection. The cells were divided into control group, ethanol group, ethanol+pEGFP-Nrf2 group and ethanol+pEGFP-N1 group. The mRNA expression of Nrf2, α-SMA and Col I was determined by RT-PCR, and their protein expression was detected by Western blotting. Cell proliferation was assessed by MTT assay, and cell cycle was detected by flow cytometry.RESULTSThe pEGFP-Nrf2 plasmid was successfully transfected into HSC-T6 cells, and the mRNA and protein expression of Nrf2 was higher than other three groups 48 h after transfection (P<0.05). Compared with control group, the cell proliferation and the mRNA and protein expression of α-SMA and Col I in ethanol group and ethanol+pEGFP-N1 group were significantly increased (P<0.05), and the numbers of HSC-T6 cells were decreased in G1phase and increased in S phase (P<0.05), without significant differences between the two groups (P>0.05). Meanwhile, the cells in ethanol+pEGFP-Nrf2 group showed significantly decreased proliferation level, down-regulated mRNA and protein expression of α-SMA and Col I, higher numbers in G1phase and lower numbers in S phase compared with ethanol group and ethanol+pEGFP-N1 group (P<0.05).CONCLUSIONNrf2 overexpression could significantly down-regulate the expression of α-SMA and Col I and cause G1/S phase arrest in HSC-T6 cells cultured with ethanol, thus inhibiting the proliferation and activation of the cells.

Liver fibrosis; Hepatic stellate cells; Nuclear factor E2-related factor 2; Collagen type I; Alpha-smooth muscle actin

R365; R575.2

A

1000- 4718(2013)09- 1590- 07

2013- 04- 01

2013- 07- 18

國家自然科學基金資助項目(No.30360037)

△通訊作者 Tel: 0791-86261633; E-mail: jixiangz@tom.com

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.09.009