鈣中性蛋白酶2及Bax在肝纖維化大鼠肝組織中的表達變化及意義*

謝汝佳， 韓 冰， 楊 婷， 溫靜靜， 楊 勤

(貴陽醫學院病理生理教研室， 貴州 貴陽 550004)

鈣中性蛋白酶2及Bax在肝纖維化大鼠肝組織中的表達變化及意義*

謝汝佳， 韓 冰， 楊 婷， 溫靜靜， 楊 勤△

(貴陽醫學院病理生理教研室， 貴州 貴陽 550004)

目的探討鈣中性蛋白酶2(calpain 2)及Bcl-2相關X蛋白(Bax)在肝纖維化過程中的表達變化及其在肝纖維化過程中的可能作用。方法雄性Wistar大鼠40只，隨機分為正常對照4周、8周組和肝纖維化模型4周、8周組，每組各10只。肝纖維化組按3 mL/kg體重的劑量皮下注射40% CCl4植物油溶液，每隔3 d注射1次，造模時間分別為4周和8周；對照組大鼠皮下注射等量植物油溶液。采用TUNEL法檢測肝組織中肝細胞凋亡情況；real-time PCR檢測肝組織中calpain 2及bax mRNA的表達變化。免疫組織化學法及Western blotting檢測肝組織中calpain 2及Bax蛋白的表達情況。結果Real-time PCR檢測發現肝纖維化4周和8周組大鼠肝組織中calpain 2及bax mRNA表達較相應的正常對照組顯著增加。免疫組化及Western blotting檢測顯示肝纖維化4周組大鼠肝組織中calpain 2蛋白的表達與正常4周組比較無顯著差異；隨著肝纖維化程度的加重，肝纖維化8周時大鼠肝組織中calpain 2的表達顯著增加；而肝組織中Bax的表達從肝纖維化4周時就顯著增加，肝纖維化8周時達到高峰。此外，通過TUNEL法檢測發現肝纖維化4周和8周組大鼠肝組織中肝細胞凋亡的數目較正常組大鼠顯著增加。結論Calpain 2與Bax可能參與了肝纖維化的發生發展過程。

肝纖維化； 鈣中性蛋白酶2； Bcl-2相關X蛋白

鈣中性蛋白酶(calpain)屬于半胱氨酸蛋白水解酶超家族成員之一，廣泛分布于絕大多數哺乳動物組織中。Calpain家族成員在細胞內發揮多種生理作用,涉及到細胞骨架的重塑、信號轉導、細胞周期調控和凋亡等[1-2]。目前國內外對calpain與肝臟疾病關系的研究主要集中在肝臟的缺血-再灌注損傷和化學藥物所致的急性肝損傷方面，關于calpain與肝纖維化的關系及相關機制研究目前國內外尚無報道。本研究采用CCl4復制肝纖維化動物模型，觀察肝纖維化形成過程中肝組織calpain 2及Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2-associated X protein,Bax)的表達變化，探討它們在肝纖維化發病過程中可能的作用。

材 料 和 方 法

1動物及試劑

清潔級雄性Wistar大鼠40只，體重(160±20)g，購自貴陽醫學院實驗動物中心[許可證號為SCXK-(黔)2002-0001]；calpain 2多克隆抗體購自Cell Signaling Technology；Bax多克隆抗體及原位TUNEL檢測試劑盒購自武漢博士德生物技術有限公司；免疫組化Envision II 抗檢測試劑盒購自上海基因科技有限公司；丙烯酰胺、過硫酸銨、甘氨酸、三羥甲基氨基甲烷、十二烷基硫酸鈉及Bradford蛋白定量試劑盒均購自北京鼎國昌盛生物技術有限公司；聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜及增強化學發光(enhanced chemiluminescent, ECL)試劑盒購自Millipore；Trizol購自Invitrogen；逆轉錄試劑盒購自Fermentas；SYBR Green購自大連寶生物工程有限公司；calpain 2、bax及內參照β-actin的引物委托上海捷瑞生物工程有限公司設計合成。引物序列如下：β-actin上游引物5’-GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3’，下游引物5’-CATCTGCTGGAAGGTGGACA-3’；calpain 2上游引物5’-GGAAGAAGATGAAGATGATGAG-3’，下游引物5’-TTGCTGAGGTGGATGTTG-3’；bax上游引物5’-ACACCTGAGCTGACCTTGGA-3’，下游引物5’-CCGTGTCCACGTCAGCAATC-3’。

2方法

2.1動物分組與模型制備 實驗動物適應性喂養1周后，隨機分成4組，分別為正常對照4周、8周組和肝纖維化模型4周、8周組，每組各10只。肝纖維化組按3 mL/kg體重的劑量皮下注射40% CCl4植物油溶液，每隔3 d注射1次，造模時間分別為4周和8周；對照組大鼠皮下注射等量植物油溶液。分別于相應時點處死各組大鼠。大鼠處死前稱體重，留取血液及全部肝臟，稱肝臟濕重，每只大鼠取相同部位肝臟用4%中性甲醛固定，剩余肝組織-80 ℃低溫冰箱保存；血液1 500 r/min離心10 min后將血清置于-80 ℃低溫冰箱保存。

2.2肝臟指數測定 肝臟指數(%)=肝臟重量/體重×100%。

2.3肝組織病理學檢查 4%中性甲醛固定后的肝組織石蠟包埋，常規組織切片, 蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色及Masson染色后光鏡下觀察肝組織的病理變化，參照肝纖維化分級法[3]進行膠原纖維增生程度半定量分析。

2.4血清生化指標檢測 血清丙氨酸氨基轉移酶 (alanine aminotransferase，ALT)和天冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase，AST)檢測采用Siemens Advil 1650全自動生化分析儀測定。

2.5TUNEL法檢測肝組織中肝細胞凋亡 嚴格按照試劑盒說明書操作。在熒光顯微鏡下觀察凋亡的細胞，以細胞核發綠色熒光的細胞作為凋亡細胞，并計算凋亡指數。凋亡指數(%)=凋亡細胞數/細胞總數×100%。

2.6Real-time PCR檢測肝組織中calpain 2及bax mRNA表達 提取肝組織總RNA并進行定量，逆轉錄合成cDNA，反應體系20 μL：總RNA 1 μg，5×PCR Buffer 4 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，10 μmol/L Oligo(dT) 1 μL，RNase Inhibitor 1 μL，MMLV反轉錄酶 1 μL，DEPC H2O補足體積。反應條件:25 ℃ 10 min,48 ℃ 60 min,95 ℃ 5 min。Real-time PCR 反應體系25 μL：反轉錄產物 2 μL，10 μmol/L上、下游引物各1.0 μL，2×SYBR Green I 12.5 μL，DEPC H2O補足體積。反應條件為50 ℃ 2 min,95 ℃ 10 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min，最后兩步重復40個循環。以β-actin作為內參照，2-ΔΔCt為目的基因的相對表達強度，所有樣本均重復3孔。

2.7免疫組織化學技術檢測肝組織中calpain 2及Bax蛋白表達 切片常規脫蠟水化，3%H2O2處理，加封閉液后，分別滴加兔抗大鼠calpain 2和Bax多克隆抗體 (工作濃度為1∶100)，4 ℃過夜。次日滴加羊抗兔IgG，在37 ℃孵育30 min，二氨基聯苯胺(diaminobenzidine, DAB)顯色，蘇木素復染。陰性對照以磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline，PBS)緩沖液代替Ⅰ抗。每個樣本隨機抽取5個高倍鏡下視野，以胞漿黃染的細胞作為陽性表達的細胞，計算出陽性表達細胞占細胞總數的百分比。陽性細胞百分率(%)=陽性細胞數/細胞總數×100%。

2.8Western blotting 檢測肝組織中calpain 2及Bax表達 提取肝組織總蛋白并進行蛋白定量，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)分離蛋白質后，采用全濕電轉移裝置將蛋白質分子轉移到PVDF膜上，電轉移結束后PVDF膜用Tris緩沖鹽溶液(Tris-buffered saline，TBS)洗滌1次(每次5 min)，封閉緩沖液(5%脫脂奶粉)在室溫下封閉1 h。封閉完成后TBS-吐溫20(TBS-Tween 20，TBST)洗膜3次(每次5 min)，然后將PVDF膜與Ⅰ抗稀釋液(calpain 2稀釋濃度為1∶1 000，Bax稀釋濃度為1∶200)4 ℃封閉過夜。次日早上用TBST洗膜3次(每次5 min)后，PVDF膜與Ⅱ抗稀釋液(1∶4 000)在室溫下孵育1 h, TBST洗膜3次(每次5 min)，加入ECL化學發光試劑A、B液各0.5 mL，混勻，潤透PVDF膜后室溫作用1 min。暗室中將PVDF膜迅速封入保鮮膜中，Kodak X-ray film壓片，放射自顯影1 min。X-ray film置于顯影液中2～3 min，定影液中1.5 min，清水沖洗晾干。

3統計學處理

計量資料以均數±標準差(mean±SD)表示,用SPSS 統計軟件(13.0 版)進行組間方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1各組大鼠肝臟指數與血清ALT、AST活性比較

由表1可見，肝纖維化模型4周和8周組大鼠肝臟指數均高于相應的正常對照組(P<0.01)；肝纖維化模型4周和8周組大鼠血清AST和ALT活性也較相應的正常組大鼠顯著增加(P<0.01)。上述結果提示肝纖維化大鼠出現明顯的肝臟腫大及肝功能異常。

表1 各組大鼠肝臟指數、血清ALT活性、血清AST活性和肝細胞凋亡指數

**P<0.01vscorresponding control groups；△△P<0.01vs4-week liver fibrosis group.

2肝組織病理學變化

各組大鼠肝組織經HE染色和Masson染色，光鏡下可見正常4周和8周組大鼠肝細胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，無膠原纖維增生；模型4周組大鼠肝細胞脂肪樣變明顯，可見部分空泡樣變，Masson染色可見少量被染成藍綠色的膠原纖維；模型8周組大鼠肝細胞脂肪樣變嚴重，肝小葉結構破壞，可見假小葉形成。Masson染色可見肝組織內有大量被染成藍綠色的膠原纖維，見圖1、表2。

Figure 1. HE (A～D,×400) and Masson (E～H,×100) staining of rat hepatic tissues in each group. A,E: 4-week control group; B,F:8-week control group; C,G: 4-week liver fibrosis group; D,H: 8-week liver fibrosis group.

圖1各組大鼠肝組織HE及Masson染色結果

表2 各組大鼠肝纖維化程度分級

**P<0.01vscorresponding control groups.

3TUNEL法檢測肝組織中肝細胞凋亡情況

TUNEL法檢測肝細胞凋亡情況顯示，正常4周和8周組大鼠肝組織中僅有少量肝細胞發生凋亡；而肝纖維化4周和8周組大鼠肝組織中凋亡肝細胞的數目明顯增加,與正常對照組比較有顯著差異，見圖2、表1。

Figure 2. The apoptosis of hepatocytes in each group detected by TUNEL (×400). A: 4-week control group; B:8-week control group; C: 4-week liver fibrosis group; D: 8-week liver fibrosis group.

圖2TUNEL法檢測各組大鼠肝細胞凋亡情況

4Real-timePCR檢測肝組織中calpain2及baxmRNA的表達

Real-time PCR 結果顯示，肝纖維化4周和8周組大鼠肝組織中calpain 2及bax mRNA 的表達較相應的正常對照組明顯增高(P<0.01)，見表3。

表3Real-timePCR檢測大鼠肝組織中calpain2和baxmRNA的表達

Table 3. The expression of calpain 2 and bax mRNA in liver tissues detected by real-time PCR(Mean±SD.n=5)

Groupcalpain2bax4-weekcontrol93.97±34.7364.61±16.588-weekcontrol82.94±26.5855.39±8.414-weekliverfibrosis173.63±28.60**231.21±20.30**8-weekliverfibrosis167.93±50.39**148.99±25.75**△△

**P<0.01vscorresponding control groups；△△P<0.01vs4-week liver fibrosis group.

5免疫組織化學法檢測肝組織中calpain2及Bax蛋白的表達

免疫組織化學染色顯示，正常4周和8周組大鼠肝組織中calpain 2及Bax蛋白表達量較少，僅在匯管區有少量表達；肝纖維化4周時，大鼠肝組織中calpain 2表達有所增加，但與正常4周組比較無顯著差異，而肝組織中Bax的表達則較正常4周組顯著增加；肝纖維化8周時，肝組織中calpain 2及Bax的表達均較正常8周組明顯增多。肝纖維化大鼠肝組織中calpain 2及Bax陽性表達主要位于肝細胞胞漿內,見圖3、表4。

6Westernblotting檢測肝組織中calpain2及Bax蛋白的表達

Western blotting結果顯示，正常肝組織內有少量calpain 2和Bax的表達；肝纖維化4周時，大鼠肝組織中calpain 2的表達與正常4周組比較無顯著差異，而Bax的表達則顯著增加；到肝纖維化8周時，肝組織中calpain 2和Bax的表達均較正常8周組明顯增多,見圖4。

Figure 3. The expression of calpain 2 (A～D) and Bax (E～H) in liver tissues detected by immunohistochemistry (×400). A,E: 4-week control group; B,F:8-week control group; C,G: 4-week liver fibrosis group; D,H: 8-week liver fibrosis group.

圖3免疫組化檢測各組大鼠肝組織calpain2及Bax的表達

表4免疫組化檢測大鼠肝組織中calpain2及Bax蛋白的表達

Table 4. The expression of calpain 2 and Bax proteins in liver tissues detected by immunohistochemistry (%.Mean±SD.n=5)

Groupcalpain2Bax4-weekcontrol8.28±0.532.58±0.258-weekcontrol9.88±1.593.44±0.384-weekliverfibrosis11.16±1.4525.46±1.68**8-weekliverfibrosis23.10±3.77**△△18.06±1.89**△△

**P<0.01vscorresponding control groups；△△P<0.01vs4-week liver fibrosis group.

Figure 4. The expression of calpain 2 and Bax in liver tissues analyzed by Western blotting. A: 4-week control group; B:8-week control group; C: 4-week liver fibrosis group; D: 8-week liver fibrosis group.Mean±SD.n=5.*P<0.05,**P<0.01vscorresponding control groups；△△P<0.01vs4-week liver fibrosis group.

圖4Westernblotting檢測各組大鼠肝組織calpain2及Bax的表達

討 論

Calpain屬于半胱氨酸蛋白水解酶超家族成員之一。迄今為止,已經在哺乳動物細胞內先后發現了14種calpain家族蛋白酶[4]。目前，研究最多的是calpain1和calpain 2。研究發現，calpain1只需微摩爾濃度Ca2+就可激活，而calpain 2則需要毫摩爾濃度Ca2+才能激活[5-6]，由于細胞內Ca2+濃度波動在微摩爾水平以下，所以calpain 2可能在病理情況下才能激活[7]。因此，在某些病理環境下尤其是高鈣環境下, 當calpain 2被激活后就可介導一系列的病理變化，包括細胞肥大、細胞凋亡等。體外實驗發現，calpain能切割Bcl-2家族促凋亡成員Bax，產生18 kD活性片段，后者能促進線粒體細胞色素C(cytochrome C, Cyt C)的釋放，從而介導細胞凋亡的發生[8-9]。而應用鈣蛋白酶抑制劑，則可阻斷Bax的激活及其繼發的Cyt C的釋放，從而抑制細胞凋亡的過程[10]。這說明Bax可能介導了calpain在內源性凋亡途徑中的作用。

我們的實驗結果顯示，肝纖維化4周時，calpain 2 mRNA的表達水平已較正常4周組顯著增加, 但calpain 2在蛋白水平的表達與正常4周組比較無顯著變化；隨著肝纖維化的進展，到肝纖維化8周時，calpain 2在mRNA及蛋白水平的表達均明顯增高。此外，我們還發現肝組織中Bax mRNA及蛋白的表達在肝纖維化4周和8周組均較相應的正常對照組明顯增加，同時肝纖維化大鼠肝組織中凋亡肝細胞的數目也顯著增加。通過上述實驗結果我們推測，calpain 2的表達變化可能參與了肝纖維化過程中肝細胞凋亡的發生，其機制可能是calpain 2激活肝組織中的促凋亡蛋白Bax，產生活性的促凋亡片段Bax/p18。與完整的Bax不同，Bax/p18的活性在線粒體中不被抗凋亡蛋白Bcl-2所抑制[11]，因此可促進肝細胞凋亡的發生。有研究表明肝細胞凋亡不僅是肝臟疾病早期損傷的重要病理改變, 也是肝硬化等晚期病變形成的基本條件[12]。Takehara等[13]敲除抗凋亡因子bcl-xL后, 可引發小鼠體內肝細胞自發凋亡并引起肝纖維化, 提示肝細胞凋亡能夠獨立導致肝纖維化的發生。由于肝細胞是肝臟唯一的實質細胞，肝細胞凋亡的增加勢必會促進肝纖維化的發生和發展。

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Expressionofcalpain2andBaxinratfibroticlivertissues

XIE Ru-jia, HAN Bing, YANG Ting, WEN Jing-jing, YANG Qin

(DepartmentofPathophysiology,GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,China.E-mail:qinyang@gmc.edu.cn)

AIM: To observe the expression of calpain 2 and Bcl-2-associated X protein (Bax) in rat fibrotic liver tissues and to explore their effects on hepatic fibrosis.METHODSForty male Wistar rats were randomly divided into four groups (eachn=10): 4-week control group, 8-week control group, 4-week liver fibrosis group and 8-week liver fibrosis group. Liver fibrosis model was induced by subcutaneous injection of 40% CCl4(3 mL/kg) every 3 days for 4 or 8 weeks. The apoptosis of hepatocytes was detected by TUNEL. Additionally, the mRNA expression of calpain 2 and bax was determined by real-time PCR, and the protein expression of calpain 2 and Bax was determined by immunohistochemistry and Western blotting.RESULTSReal-time PCR showed that the mRNA expression of calpain 2 and bax in liver tissues was elevated in 4-week and 8-week liver fibrosis groups. The results of immunohistochemistry and Western blotting revealed that there was no difference of calpain 2 protein expression in liver tissues between 4-week liver fibrosis group and control group, but that in 8-week liver fibrosis group was obviously increased. The protein expression of Bax in 4-week and 8-week liver fibrosis groups was higher than that in control groups. Additionally, the numbers of apoptotic hepatocytes in 4-week and 8-week liver fibrosis groups were obviously increased compared with control groups.CONCLUSIONCalpain 2 and Bax may play important roles in the process of liver fibrosis.

Liver fibrosis; Calpain 2; Bcl-2-associated X protein

R363

A

1000- 4718(2013)09- 1603- 06

2013- 01- 14

2013- 07- 02

貴州省科技廳國際科技合作項目(No.黔科合外G字[2010]7016號)

△通訊作者 Tel:0851-6908578; E-mail:qinyang@gmc.edu.cn

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.09.011