全反式維甲酸預處理對肝血流阻斷大鼠腸道的保護作用*

王鐘興， 黃嬋燕， 方佳峰， 陳圖鋒△

(1中山大學附屬第一醫院麻醉科，廣東 廣州 510080; 2中山大學附屬第三醫院胃腸外科，廣東 廣州 510630)

全反式維甲酸預處理對肝血流阻斷大鼠腸道的保護作用*

王鐘興1， 黃嬋燕1， 方佳峰2， 陳圖鋒2△

(1中山大學附屬第一醫院麻醉科，廣東 廣州 510080;2中山大學附屬第三醫院胃腸外科，廣東 廣州 510630)

目的探討全反式維甲酸(ATRA)對肝血流阻斷所致腸道損傷的影響和機制。方法32只雄性SD大鼠，隨機分為4組：假手術(sham)組、肝血流阻斷(HIO)組、溶媒對照(DMSO+HIO)組和ATRA預處理(ATRA+HIO)組。ATRA預處理組以ATRA 15 mg·kg-1·d-1灌胃, 溶媒對照組以等體積二甲基亞砜(DMSO)灌胃，共10 d。Pringle’s法建立肝血流阻斷模型，持續30 min，解除阻斷再灌注2 h后，采集各組大鼠末端回腸和血清。光鏡下觀察回腸病理改變、行腸黏膜組織Chiu氏評分；比色法檢測血清二胺氧化酶(DAO)水平、回腸組織丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性；ELISA法測定血清白細胞介素(IL)-1β及腫瘤壞死因子(TNF)-α水平；Western blotting檢測組織中胞漿錳超氧化物歧化酶(MnSOD)和胞核NF-κB p65蛋白的表達量。結果相對于HIO組和DMSO+HIO組，ATRA能緩解肝血流阻斷后腸黏膜組織病理損傷，降低Chiu氏評分和血清DAO水平(P<0.05)，減少回腸組織中MDA含量(P<0.05)，提高SOD活性(P<0.05)，增加組織MnSOD的表達(P<0.05)，減少胞核NF-κB p65蛋白含量(P<0.05)，降低血清IL-1β和TNF-α水平(P<0.05)。結論ATRA通過增加組織抗氧化能力，抑制NF-κB通路的激活，減少促炎因子的產生，從而減輕大鼠肝血流阻斷造成的腸道損傷。

全反式維甲酸； 肝血流阻斷； 再灌注損傷； 腸

阻斷入肝血流是肝膽外科手術控制術中出血的常用方法。由于門脈循環的特殊性，肝血流阻斷可造成門脈系統回流障礙，小腸血管血流嚴重瘀滯，組織缺血缺氧，導致腸黏膜屏障受損。因此腸道是肝血流阻斷產生血流動力學障礙和缺血再灌注損傷的重要靶器官[1]。全反式維甲酸(all-transretinoic acid, ATRA)在臨床中被廣泛應用于血液系統腫瘤和皮膚疾病的治療，近年的研究表明，ATRA還具有抗氧化及抑制炎癥反應的作用[2-5]。然而，目前對ATRA在器官缺血再灌注損傷中的作用卻研究甚少。本實驗通過建立大鼠肝門阻斷模型，觀察ATRA在肝血流阻斷后對腸道損傷的影響并探討其可能的機制。

材 料 和 方 法

1材料

健康雄性SD大鼠，體重220～270 g(廣州中醫藥大學動物實驗中心)；ATRA, 二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)購自Sigma-Aldrich；兔抗錳超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase, MnSOD)多克隆抗體購自Abcam；兔抗核轉錄因子κB(nuclear factor kappa B, NF-κB)p65單克隆抗體、兔抗histone H3單克隆抗體、兔抗β-Actin單克隆抗體和山羊抗兔IgG-HRP 購自Cell signaling technology；丙二醛(malonaldehyde, MDA)測試盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)測試盒和二胺氧化酶(diamine oxidase, DAO)測試盒均購自南京建成生物研究所；腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α ELISA檢測試劑盒和白細胞介素(interleukin, IL)-1β ELISA檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

2方法

2.1實驗分組 健康雄性SD大鼠32只，隨機分為4組，每組8只：(1)假手術(sham)組：麻醉后開腹，分離肝門，余不作進一步處理；(2)肝血流阻斷(hepatic inflow occlusion, HIO)組：鉗夾肝十二指腸韌帶，肝門阻斷30 min；(3)溶媒對照(DMSO+HIO)組:每天以等體積溶媒DMSO灌胃，共10 d，術前6 h再給DMSO處理1次，余操作同HIO組；(4)ATRA預處理(ATRA+HIO)組：以ATRA 15 mg·kg-1·d-1灌胃，持續10 d，術前6 h再給ATRA處理1次，余操作同HIO組。

2.2動物模型建立及標本收集 動物實驗前12 h禁食，自由飲水，采用戊巴比妥鈉(45 mg/kg)腹腔內注射麻醉，取上腹部正中切口進入腹腔，暴露肝門部，用無創血管鉗按Pringle’s法阻斷肝十二指腸韌帶并持續30 min[6]，松鉗恢復血流。再灌注2 h后處死大鼠，采集動脈血6 mL，室溫靜置40 min，4 ℃、1 000×g離心10 min，收集血清，-20 ℃保存待測。距離回盲部5cm切取約8cm末端回腸，分成2段，一段置入10%中性甲醛固定，用作病理檢測；另一段以4 ℃生理鹽水沖洗干凈，隨即在液氮中急凍并將其研磨成粉末，-70 ℃保存待測。

2.3組織病理學檢測 固定的回腸組織塊經乙醇梯度脫水后，石蠟包埋，常規切片及HE染色，光鏡下觀察；遵照單盲法，由2位病理科醫生對各標本的腸黏膜進行Chiu氏評分[7]，分值越高，表明損傷越嚴重。

2.4回腸組織MDA含量和SOD活性檢測 將儲存的回腸組織粉末以0.02 mol/L Tris-HCL (pH=7.3)勻漿后，16 000×g離心20 min，取上清液。MDA含量采用硫代巴比妥酸比色法測定；SOD活性采用黃嘌呤氧化酶法測定。具體操作參照各試劑盒說明書進行。

2.5血清DAO、IL-1β和TNF-α水平的測定 將凍存的血清在冰上融解，4 ℃、1 000×g離心15 min, 取上清液。DAO含量采用紫外比色法測定；IL-1β、TNF-α水平采用ELISA方法測定。具體操作參照各試劑盒說明書進行。

2.6回腸組織胞漿MnSOD及胞核NF-κB p65蛋白表達的檢測 取少量儲存的回腸組織粉末先后加入胞漿提取劑和胞核提取劑，離心取上清，獲得胞漿蛋白和胞核蛋白，采用BCA法測定蛋白含量。取等蛋白量的各樣品行聚丙烯酰胺膠電泳，將分離膠蛋白轉印至醋酸纖維素膜上。沖洗膜、封閉、與Ⅰ抗孵育2 h。沖洗膜、與Ⅱ抗孵育1 h。沖洗膜,加入化學發光試劑顯影，最后將膜曝光成像。

3統計學處理

計量資料以均數±標準差(mean±SD)表示，等級資料以中位數(下四分位數，上四分位數)[median (Q1,Q3)]表示，使用SigmaPlot 12.3 軟件進行統計分析；連續性資料的比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，方差不齊采用Kruskal-Wallis非參數檢驗；等級資料的比較采用秩和檢驗；各組間的多重比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1回腸組織病理學改變及Chiu氏評分

光鏡下，sham組黏膜形態正常，HIO組和DMSO+HIO組黏膜結構破壞明顯，ATRA+HIO組黏膜輕、中度損傷，見圖1。HIO和DMSO+HIO兩組的Chiu氏評分均顯著高于sham組(P<0.05)，ATRA+HIO組評分較HIO組和DMSO+HIO組明顯降低(P<0.05)，但仍高于sham組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

Figure 1. Histopathological changes of ileum mucosa under light microscope (×100). In sham group (A), the villi and glands were normal. In HIO group (B) and DMSO+HIO group (C), severe edema of mucosal villi accompanied with intestinal gland injury were observed, numbers of intestinal villi disintegrated, and the gap between epithelium and lamina propria obviously increased, which indicated significant damage to mucosa. In ATRA+HIO group (D), although the villi were edematous, only slight mucosal sloughing could be seen at villi tips, and the gap between epithelium and lamina propria increased mildly.

圖1各組回腸黏膜病理學改變

表1各組回腸黏膜Chiu氏評分及血清DAO的變化

Table 1. The changes of Chiu’s score of mucosa and DAO content in serum [median (Q1,Q3).Mean±SD.n=8]

△P<0.05vssham group;*P<0.05vsHIO group or DMSO+HIO group.

2血清DAO水平

再灌注后，HIO組和DMSO+HIO組血清DAO水平較sham組顯著升高(P<0.05)；而ATRA+HIO組則較HIO組及DMSO+HIO組明顯降低(P<0.05)，與sham組比較，ATRA+HIO組DAO水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

3回腸組織MDA含量及SOD活性

再灌注后，MDA含量在HIO組和DMSO+HIO組明顯高于sham組(P<0.05)，ATRA+HIO組則較HIO組及DMSO+HIO組顯著降低(P<0.05)，但高于sham組(P<0.05)；與MDA相應，SOD活性在HIO組及DMSO+HIO組均明顯低于sham組和ATRA+HIO組(P<0.05)，ATRA+HIO組與sham組比較，SOD活性降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2各組回腸組織MDA和SOD的變化

Table 2. The changes of MDA level and SOD activity in ileum tissues (Mean±SD.n=8)

GroupMDA[μmol/(gprotein)]SOD[103U/(gprotein)]Sham1.33±0.28268.90±28.56HIO4.83±1.08△150.28±34.65△DMSO+HIO4.90±1.15△146.34±33.53△ATRA+HIO2.83±0.73△*223.76±31.33△*

△P<0.05vssham group;*P<0.05vsHIO group or DMSO+HIO group.

4血清IL-1β和TNF-α水平

再灌注后，HIO組和DMSO+HIO組的血清IL-1β和TNF-α水平均較sham組明顯升高(P<0.05)；而ATRA+HIO組則較HIO組及DMSO+HIO組顯著下降(P<0.05)；ATRA+HIO組與sham組比較，其血清IL-1β和TNF-α水平高于后者，差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3各組血清IL-1β及TNF-α的變化

Table 3. The changes of IL-1β and TNF-α levels in serum (ng/L.Mean±SD.n=8)

GroupIL-1βTNF-αSham32.94±4.8213.25±3.07HIO314.37±60.66△116.68±24.03△DMSO+HIO309.50±54.86△108.02±26.42△ATRA+HIO168.73±39.05△*52.97±15.60△*

△P<0.05vssham group;*P<0.05vsHIO group or DMSO+HIO group.

5回腸組織MnSOD和NF-κBp65蛋白的表達

再灌注后，胞漿MnSOD蛋白表達在HIO組和DMSO+HIO組顯著低于sham組(P<0.05)，ATRA+HIO組則較HIO組及DMSO+HIO組明顯增加(P<0.05)，ATRA+HIO組與sham組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見圖2；胞核NF-κB p65蛋白表達在HIO、DMSO+HIO及ATRA+HIO組中，均較sham組顯著升高(P<0.05)，但與HIO或DMSO+HIO組比較，ATRA+HIO組的核內NF-κB p65蛋白水平明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3。

Figure 2. The expression of cytoplasmic MnSOD protein in ileum tissues analyzed by Western blotting.Mean±SD.n=8.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsHIO group or DMSO+HIO group.

圖2各組回腸組織中胞漿MnSOD蛋白的表達

Figure 3. The expression of nuclear NF-κB p65 protein in ileum tissues analyzed by Western blotting.Mean±SD.n=8.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsHIO group or DMSO+HIO group.

圖3各組回腸組織中胞核NF-κBp65蛋白的表達

討 論

為減少肝膽外科手術中出血，肝門阻斷控制入肝血流是簡單而有效的常用方法。動物實驗研究表明[1,8]，肝血流阻斷可對多個器官的功能造成損害，腸道損傷是僅次于呼吸循環衰竭的主要并發癥和致死原因。肝血流阻斷后門脈壓力急劇升高、血流淤滯，引起腸黏膜缺血缺氧、水腫脫落；再灌注后，氧自由基及各種促炎因子的產生又可進一步加劇腸道的損傷。DAO是具有高度活性的細胞內酶，主要由胃腸黏膜上皮細胞合成，當黏膜細胞出現損傷或壞死時，DAO即從腸道組織中釋放入血液，因此血清DAO是反應腸黏膜機械屏障完整性和損傷程度的敏感指標[9]。我們的結果顯示，肝血流阻斷30 min、再灌注2 h后，大鼠血清DAO水平顯著高于假手術組，而給予ATRA預處理，可使血清DAO水平明顯降低，結合病理學改變及Chiu氏評分結果分析，我們發現長時間的肝血流阻斷破壞了腸黏膜機械屏障功能，ATRA能有效緩解肝血流阻斷造成的黏膜損傷。此外，在本研究中，溶媒對照組與肝血流阻斷組的各實驗結果均無統計學差異，表明DMSO作為ATRA的溶媒，并未對動物模型產生明顯的生物學作用。

氧自由基通過脂質過氧化對細胞產生損害，是導致組織器官缺血再灌注損傷的關鍵環節。MDA是脂質過氧化的最終產物，其含量可以間接反映機體氧自由基的水平。本研究結果提示，肝血流阻斷組的回腸MDA含量較假手術組明顯增加，使用ATRA作預處理，可使組織中的MDA含量明顯減少。這說明ATRA能有效降低腸道在肝門阻斷再灌注后的氧自由基水平。細胞內外有多種抗氧化酶參與調節機體氧自由基水平及脂質過氧化，SOD是其中一種最重要的抗氧化酶，其活性代表了組織清除氧自由基的能力。我們在實驗中測定了組織的總SOD活性，結果顯示，肝血流阻斷組的回腸SOD活性較假手術組明顯下降，表明腸道在肝門阻斷和再灌注過程中，由于SOD的大量消耗，導致了組織清除氧自由基能力的顯著降低；然而，SOD活性在ATRA預處理組卻顯著高于肝血流阻斷組，這證實了ATRA能上調肝門阻斷后腸道組織的SOD活性。在真核生物中, SOD包括銅/鋅超氧化物歧化酶(Cu/ZnSOD)和MnSOD，MnSOD存在于線粒體中，是機體主要的氧自由基清除劑。研究表明，增加MnSOD表達可以提高機體的抗氧化能力，對組織器官的氧化應激損傷具有保護作用[10]。ATRA是維生素A的活性代謝產物，它在細胞增殖分化、胚胎發育等方面發揮重要的生物學作用。近年的研究還發現，ATRA能夠誘導MnSOD的合成而具有強烈的抗氧化作用[2-3]。本實驗結果顯示，肝血流阻斷組的MnSOD蛋白表達水平較假手術組明顯下降，而ATRA預處理組則較肝血流阻斷組明顯升高，說明肝門阻斷再灌注使回腸組織中氧自由基清除劑MnSOD的產生明顯減少，使用ATRA作預處理可以增加MnSOD的表達，提高腸道組織的抗氧化能力。ATRA促進MnSOD表達的確切機制尚未闡明，有學者提出，這與ATRA激活p38MAPK/Akt信號通路有關[11]，其它的可能機制還有待進一步研究。

在缺血再灌注過程中，TNF-α、IL-1β等促炎因子誘導的過度炎癥反應是造成組織損傷的另一關鍵因素。這些因子不僅可通過增加中性粒細胞對缺氧組織的趨化性和粘附性而加重局部損傷，而且還是全身炎癥反應綜合征及多器官功能不全綜合征的重要啟動因素。ATRA除了具有誘導分化和抗腫瘤的藥理特性外，近年研究還發現，ATRA能夠抑制單核巨噬細胞及樹狀突細胞表達多種促炎因子[12]，在組織器官中具有抗炎和免疫調節的作用[4-5]。本研究結果顯示，肝血流阻斷可使大鼠血清TNF-α、IL-1β顯著升高；經ATRA預處理，兩者的水平均出現明顯下降，表明ATRA在肝門阻斷再灌注中可以抑制TNF-α、IL-1β的產生。目前認為，大多數促炎因子的表達都與NF-κB的激活有關[13]。正常情況下，NF-κB在細胞漿與其抑制蛋白IκB結合處于靜止狀態，當受到缺氧、炎癥、損傷等因素的刺激時，IκB迅速發生磷酸化及降解，活化的NF-κB進入細胞核與相關的DNA序列結合，誘導眾多靶基因包括TNF-α、IL-1β等多種促炎因子的表達，因此細胞核中NF-κB的水平可以反映NF-κB通路的激活程度[14]。我們采用Western blotting半定量檢測胞核中NF-κB p65的水平，結果發現它在肝血流阻斷組顯著高于假手術組，使用ATRA作預處理可使胞核的NF-κB p65蛋白表達水平明顯降低，這說明ATRA可抑制肝門阻斷再灌注后NF-κB通路的激活，其機制可能與ATRA抑制IκB蛋白的磷酸化及降解有關[15]。

綜上所述，ATRA可以增加腸道組織MnSOD表達、提高總SOD活性、減輕脂質過氧化，同時還可以抑制NF-κB通路的激活、減少促炎因子的產生，從而減輕大鼠肝血流阻斷所造成的腸道損傷。

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Protectiveeffectofall-transretinoicacidpretreatmentagainstratintestinalinjuryinducedbyhepaticinflowocclusion

WANG Zhong-xing1, HUANG Chan-yan1, FANG Jia-feng2, CHEN Tu-feng2

(1DepartmentofAnesthesiology,theFirstAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China;2DepartmentofGastrointestinalSurgery,theThirdAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China.E-mail:dr_ctf@126.com)

AIM: To investigate the effect of all-trans retinoic acid (ATRA) on the intestinal injury induced by hepatic inflow occlusion (HIO) and its mechanisms.METHODSThirty-two male Sprague-Dawley rats were randomly divided into four groups: sham group, HIO group, dimethyl sulfoxide (DMSO) + HIO group and ATRA (15 mg·kg-1·d-1) + HIO group. The hepatoduodenal ligament of the rats in the latter three groups was occluded (Pringle manoeuvre) by clamp for 30 min. After reperfusion for 2 h by release of the clamp, samples of distal ileum and serum were collected. Histological changes and Chiu’s scores of the ileac mucosa were evaluated under light microscope. Serum content of diamine oxidase (DAO), and ileac tissue levels of malonaldehyde (MDA) and superoxide dismutase (SOD) were analyzed by colorimetry. Serum concentrations of interleukin (IL)-1β and tumor necrosis factor (TNF)-α were evaluated by enzyme-linked immunosorbent assay method. Expression of manganese superoxide dismutase (MnSOD) in cytoplasm and nuclear factor kappa B (NF-κB) p65 in nucleus was assessed by Western blotting.RESULTSCompared with sham group and DMSO+HIO group, ATRA significantly reduced the mucosal Chiu’s scores, the serum content of DAO and the tissue level of MDA, enhanced the serum activity of SOD and the protein expression of MnSOD, and decreased the content of NF-κB p65 in nucleus (allP<0.05). Subsequently, ATRA significantly reduced the levels of TNF-α and IL-1β in serum (P<0.05).CONCLUSIONATRA can attenuate rat intestinal injury induced by HIO through improving the antioxidant capacity of tissue, inhibiting the activation of NF-κB and suppressing the overexpression of pro-inflammatory factors.

All-transretinoic acid; Hepatic inflow occlusion; Reperfusion injury; Intestines

R656.7

A

1000- 4718(2013)09- 1620- 05

2013- 06- 18

2013- 08- 21

廣東省科技計劃(No. 2010B060900030；No. 2010B031600206)

△通訊作者 Tel: 020-85252228; E-mail: dr_ctf@126.com

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.09.014