細胞外HSP70/HSP70-PCs對人肝癌HepG2細胞上皮-間充質轉化的影響及機制研究*

李航宇， 李 巖， 劉 丹， 孫宏治， 劉金鋼△

(1中國醫科大學附屬盛京醫院普通外科，遼寧 沈陽 110004； 2遼寧醫學院附屬第一醫院普通外科，遼寧 錦州 121001)

細胞外HSP70/HSP70-PCs對人肝癌HepG2細胞上皮-間充質轉化的影響及機制研究*

李航宇1， 李 巖1， 劉 丹1， 孫宏治2， 劉金鋼1△

(1中國醫科大學附屬盛京醫院普通外科，遼寧 沈陽 110004；2遼寧醫學院附屬第一醫院普通外科，遼寧 錦州 121001)

目的探討細胞外熱休克蛋白70(HSP70)/HSP70肽復合物(HSP70-PCs)對肝癌細胞上皮-間充質轉化(EMT)的影響和可能機制。方法將HepG2細胞分為3組：正常對照組、HSP70/HSP70-PCs組(終濃度2 mg/L)和LY294002+HSP70/HSP70-PCs組。應用real-time RT-PCR與Western blotting法檢測上皮細胞表面標志E-cadherin和間質細胞表面標志α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的表達變化，以及磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和缺氧誘導因子1α(HIF1-α)的表達變化。結果細胞外HSP70/HSP70-PCs可以促進HepG2細胞EMT的發生。HepG2細胞的EMT過程伴隨HIF-1α和PI3K表達增加。應用LY294002阻斷PI3K后，HepG2細胞沒有發生EMT，同時細胞外HSP70/HSP70-PCs上調HIF-1α表達的作用消失。結論細胞外HSP70/HSP70-PCs可以通過PI3K/HIF-1α促進肝癌細胞發生EMT。

上皮-間充質轉化； HepG2細胞； 熱休克蛋白70

在肝癌的發生、進展中存在上皮-間充質轉化 (epithelial-mesenchymal transition，EMT) 現象，并且與肝癌的侵襲轉移關系密切[1]。EMT是指上皮細胞向間充質細胞轉化的復雜過程，在此過程中上皮細胞的極性消失、遷移和運動能力增強，同時伴有上皮細胞標志物的丟失和間充質細胞標志物的過度表達。EMT的重要標志是上皮細胞表型穩定物質表達缺失，如上皮型鈣黏蛋白(E-cadherin)，和(或)間充質細胞標志蛋白表達增加，如α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)[2]。熱休克蛋白70(heat-shock protein 70，HSP70)是一組生物體內普遍存在、進化上高度保守的蛋白質家族，腫瘤細胞內誘導表達的熱休克蛋白可以調控腫瘤的多種生物學行為[3]。近年的研究發現，HSP70不僅在細胞內發揮作用，細胞內HSP70及HSP70肽復合物(HSP70-peptide complexes，HSP70-PCs)可以通過多種方式被釋放到細胞外[4]。進入腫瘤微環境的HSP70/HSP70-PCs發揮重要而復雜的作用，一方面可以活化免疫細胞參與腫瘤免疫殺傷，另一方面又可能調控腫瘤細胞的免疫逃逸[5]。更為引人注目的是細胞外HSP70/ HSP70-PCs可以直接作用于腫瘤細胞，調節腫瘤細胞的多種生物學行為[6]。但是目前關于細胞外HSP70/HSP70-PCs參與腫瘤細胞的EMT尚不明確。

缺氧誘導因子1α(hypoxia-inducible factor 1α, HIF-1α)是缺氧條件下存在于哺乳動物或人體內，介導細胞適應于缺氧微環境的轉導調控因子，與多種腫瘤細胞的增殖和凋亡、腫瘤生長和轉移相關[7]。目前關于HSP70與HIF-1α之間關系在肝癌中少有研究。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)信號通路與腫瘤細胞凋亡、增殖、侵襲等密切相關并能調節HIF-1α蛋白介導肝癌的侵襲[8]。我們前期的研究顯示細胞外HSP70-PCs能夠活化肝癌細胞PI3K/Akt通路，那么細胞外HSP70/HSP70-PCs是否是通過PI3K/Akt通路調控HIF-1α蛋白介導肝癌細胞EMT的發生值得研究。本研究應用細胞外HSP70-PCs對肝癌細胞進行體外干預，探討其對EMT機制的影響并為臨床防治肝癌尋找治療的靶點。

材 料 和 方 法

1材料

人肝癌細胞株HepG2來源于American Type Culture Collection (ATCC)。多克隆小鼠抗人E-cadherin抗體和多克隆小鼠抗人α-SMA抗體均購自Abcam;多克隆鼠抗人HIF-1α抗體和多克隆鼠抗人PI3K抗體購自Santa Cruz;HRP標記的羊抗鼠IgG和HRP標記的羊抗兔IgG購于武漢博士德生物有限公司; RNA提取試劑盒購自大連寶生物工程有限公司; RNA PCR Kit購自Promega;PI3K抑制劑LY294002購自Sigma。

2方法

2.1細胞外HSP70/HSP70-PCs的提取純化 采用隋春陽等[6]的方法進行細胞外HSP70/HSP70-PCs的提取純化,並用Western blotting法鑒定。

2.2實驗分組 HepG2細胞在含有10%胎牛血清DMEM培養液中，37℃、5% CO2培養，2～3 d用0.25%胰酶消化傳代。取對數生長期的細胞進行實驗。細胞分3組：正常對照組、細胞外HSP70/HSP70-PCs(終濃度2 mg/L)組和LY294002+細胞外HSP70/HSP70-PCs處理組。各組于培養后的24 h檢測。

2.3E-cadherin、α-SMA、PI3K與HIF-1α mRNA表達的檢測 按說明書提取各組細胞總RNA，測定 RNA 濃度和純度并根據總RNA 濃度按說明書逆轉合成cDNA，共20 μL。引物序列由北京鼎國生物工程有限公司設計并合成，E-cadherin正向引物5’-CCGCCATCGCTTACA- 3’,反向引物5’-GGCACCTGACCCTTGTA-3’；α-SMA正向引物5’-CGGGACATCAAGGAGAAACT-3’；反向引物5’-CCATCAGGCAACTCGTAACTCT-3’；GAPDH正向引物5’-GGATTTGGTCGTATTGGG-3’；反向引物5’-TCGCTCCTGGAAGATGG-3’；HIF-1α正向引物5’-CTTCTGGATGCTGGTG-3’；反向引物5’-TCGGCTAGTTAGGGTAC-3’。反應條件：兩步法，第1步: 95 ℃ 3 min;第2步：95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共40個循環。熔解曲線分析：以0.5 ℃/s變化速度從65 ℃到95 ℃每隔5 s計算1次熒光值。采用相對定量法，測定目的基因、校對基因及GAPDH的PCR產物的Ct值，代入公式 2-ΔΔCt×100%。實驗重復5次。

2.4E-cadherin、α-SMA、PI3K與HIF-1α蛋白表達的檢測 按分子克隆方法提取細胞總蛋白，經 Bradford法測定蛋白濃度；各組取 60～100 g 總蛋白進行 100 g/L SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干法轉膜，麗春紅染色標記，100 g/L脫脂奶粉于室溫封閉2 h，50 g/L脫脂奶粉稀釋I抗，4 ℃孵育過夜。TBST室溫搖洗3次，10～15 min；50 mL/L脫脂奶粉稀釋HRP標記的II抗，于室溫孵育2 h，TBST搖洗3次，每次10～15 min；ECL顯色。

3統計學處理

采用SPSS 13.0統計軟件，數據用均數±標準差(mean±SD)表示，進行t檢驗或方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1細胞外HSP70/HSP70-PCs的純化

細胞裂解液經伴刀豆球蛋白A(concanavalin A,Con A)-Sepharpse 4B層析后，分為Con A結合部分和不結合部分，不結合部分經電泳后在70 kD處有一淡染條帶(圖1A)。將Con A不結合部分進一步用DEAE柱進行分離，梯度鹽洗脫，收集不同洗脫峰的蛋白，將收集的蛋白用特異性Western blotting法鑒定，證實該蛋白確實為HSP70(圖1B)。

Figure 1. Purification and identification of extracellular HSP70/HSP70-PCs. A: SDS-PAGE analysis of the purified extracellular HSP70/HSP70-PCs. M:marker; 1:total protein; 2:after Con A separation; 3:after DEAE separation. B: HSP70 was confirmed by Western blotting.

圖1Westernblotting檢測細胞外HSP70/HSP70-PCs的表達

2細胞外HSP70/HSP70-PCs可以促進HepG2細胞EMT的發生

Real-time RT-PCR結果顯示,HSP70-PCs處理組E-cadherin mRNA的表達顯著降低，而間充質細胞的標志物α-SMA mRNA的表達顯著升高,見圖2。Western blotting結果顯示，與對照組細胞相比，經過2 mg/L HSP70-PCs處理的HepG2細胞中上皮標志物 E-cadherin蛋白的表達顯著降低，而間充質細胞的標志物α-SMA蛋白的表達顯著升高,見圖3。以上結果提示,經過HSP70-PCs處理后，HepG2細胞中上皮細胞標志物表達逐漸消失，而間充質細胞標志物表達逐漸增加，HepG2細胞已經發生 EMT。

3HepG2細胞的EMT過程伴隨HIF-1α和PI3K表達增加

Real-time RT-PCR結果顯示，經細胞外HSP70/HSP70-PCs處理發生EMT的HepG2細胞中HIF-1α與PI3K的mRNA 表達增加，顯著高于對照組(P<0.05),見圖4。Western blotting結果顯示，經細胞外HSP70/HSP70-PCs處理發生EMT的HepG2細胞中HIF-1α與PI3K蛋白表達顯著增加，顯著高于對照組(P<0.05),見圖5。

Figure 2. Effects of extracellular HSP70/HSP70-PCs on E-cadherin (A) and α-SMA (B) mRNA expression in HepG2 cells detected by real-time RT-PCR.Mean±SD.n=3．*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖2細胞外HSP70/HSP70-PCs處理后HepG2細胞中E-cadherin及α-SMAmRNA的表達

4細胞外HSP70/HSP70-PCs通過PI3K調控HIF-1α表達影響HepG2細胞EMT過程

經過PI3K抑制劑LY294002預處理后的HepG2細胞，在細胞外HSP70/HSP70-PCs的作用下沒有發生EMT。HSP70/HSP70-PCs下調E-cadherin蛋白表達和上調SMA蛋白表達的作用消失,與對照組相比，E-cadherin蛋白和SMA蛋白的表達均無明顯變化。同時，應用LY294002特異性阻斷PI3K后，HIF-1α蛋白的上調表達亦消失,見圖6。此結果說明，細胞外HSP70/HSP70-PCs促進HepG2 EMT是通過PI3K和HIF-1α來實現的。而且，HIF-1α位于PI3K的下游，可以通過阻斷PI3K抑制細胞外HSP70/HSP70-PCs對HIF-1α表達的影響。

Figure 3. Effects of extracellular HSP70/HSP70-PCs on E-cadherin and α-SMA protein expression in HepG2 cells detected by Western blotting.Mean±SD．n=3．**P<0.01vscontrol group．

圖3細胞外HSP70/HSP70-PCs處理后HepG2細胞中E-cadherin及α-SMA蛋白的表達

Figure 4. Effects of extracellular HSP70/HSP70-PCs on HIF-1α (A) and PI3K (B) mRNA expression in HepG2 cells.Mean±SD.n=3．**P<0.01vscontrol group.

圖4細胞外HSP70/HSP70-PCs處理后HepG2細胞中HIF-1α和PI3KmRNA的表達

Figure 5. Effects of extracellular HSP70/HSP70-PCs on HIF-1α and PI3K protein expression in HepG2 cells detected by Western blotting.Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖5細胞外HSP70/HSP70-PCs處理后HepG2細胞中HIF-1α和PI3K蛋白的表達

Figure 6. Effects of LY294002 on extracellular HSP70/HSP70-PCs-induced E-cadherin,α-SMA,HIF-1α and PI3K protein expression in HepG2 cells detected by Western blotting.Mean±SD.n=3.#P<0.05vscontrol (without treatment);*P<0.05vsHSP70/HSP70-PCs alone.

圖6HSP70/HSP70-PCs處理與PI3K阻斷后的HepG2細胞E-cadherin、α-SMA、HIF-1α和PI3K的表達

討 論

惡性腫瘤的侵襲、轉移和復發過程極其復雜，包括細胞黏附、細胞運動、細胞增生、細胞外基質降解、腫瘤血管生成、機體免疫等多個環節[9]。EMT系指上皮細胞在特定的生理和病理情況下向間充質細胞轉化的現象，是腫瘤細胞獲得侵襲和轉移能力的分子基礎[10]。腫瘤細胞經EMT 轉化后，上皮表型E-cadherin表達下調或缺失是其重要標志，同時可引起間充質表型α-SMA表達的上調[11]。因此可以依靠檢測這兩類細胞表面特異性標記物來鑒定EMT的發生。

HSP70是在生物體內普遍存在的蛋白質家族。腫瘤組織中的HSP70/HSP70-PCs不僅存在于腫瘤細胞內，還可以通過胞吐、分泌和腫瘤細胞壞死裂解等方式釋放到細胞外[12]。體外研究發現細胞外HSP70/HSP70-PCs在腫瘤進展的不同階段發揮復雜而矛盾的作用。在腫瘤的早期階段，細胞外HSP70/HSP70-PCs可以通過活化免疫抑制腫瘤的生長；在腫瘤的晚期，存在于腫瘤微環境中的HSP70/HSP70-PCs通過免疫抑制促進腫瘤的生長[13]。Walsh等[14]的研究發現細胞外HSP70/HSP70-PCs還能直接作用于腫瘤細胞調控其侵襲等生物學行為。目前尚未有文獻明確報道細胞外HSP70/HSP70-PCs對腫瘤細胞的EMT有影響。為此，我們在肝癌細胞系HepG2的體外培養過程中加入從人肝癌組織標本中提取并純化的HSP70/HSP70-PCs，觀察HepG2細胞是否發生EMT。我們的實驗發現,在細胞外HSP70/HSP70-PCs的刺激下， HepG2細胞的上皮細胞標志E-cadherin消失，間充質細胞標志α-SMA表達增加，使其獲得間充質化表型。也就說肝癌細胞HepG2在細胞外HSP70/HSP70-PCs的誘導下會發生EMT。

細胞外HSP70/HSP70-PCs是通過何種方式調控肝癌細胞EMT發生的呢？通過檢索文獻，我們發現PI3K/AKT信號轉導及其下游的HIF-1α可能參與其中。 PI3K/AKT信號轉導通路廣泛存在于細胞中，參與調節細胞生長、增殖、分化的信號轉導通路[15]。PI3K/Akt信號通路可以感受腫瘤微環境中多種因素的刺激，調控腫瘤細胞生物學行為的變化，促進其增殖及侵襲力[8]。腫瘤病灶的一個主要特征是腫瘤細胞快速生長并伴缺氧微環境的形成[16]。在缺氧條件下，腫瘤細胞啟動一系列缺氧適應性反應，其中就包括HIF-1相關的基因誘導[7]。HIF-1由α和β亞基組成，其中HIF-1α是受氧分子調節的主要功能亞基。人體腫瘤組織中HIF-1α高水平表達，表達程度與腫瘤的進展程度、轉移和放/化療抵抗力呈正相關。研究表明，HIF-1α高表達能引起卵巢癌、前列腺癌、膽囊癌、肝細胞癌等多種腫瘤細胞發生EMT特征的轉變，提高其侵襲轉移能力[17]。Krishnamachary 等[17]發現HIF-1α是腫瘤細胞EMT 的一個重要信號，HIF-1α高表達導致細胞發生E-cadherin等上皮標志丟失和α-SMA等充間質標志獲得的EMT 改變。我們通過real-time RT-PCR與Western blotting證實，在細胞外HSP70/HSP70-PCs誘導HepG2 EMT的同時，PI3K與HIF-1α在mRNA和蛋白水平的表達明顯上調，說明二者可能參與了細胞外HSP70/HSP70-PCs誘導HepG2 EMT的過程。進一步的阻斷實驗發現，PI3K抑制劑能有效阻斷細胞外HSP70/HSP70-PCs誘導的HIF-1α蛋白的表達，并且EMT標志性蛋白分子變化發生逆轉。該結果提示細胞外HSP70/HSP70-PCs誘導肝癌細胞EMT改變可能是通過PI3K調控HIF-1α發揮作用。

綜上所述，細胞外HSP70/HSP70-PCs對肝癌的EMT起著重要作用，這種作用是通過PI3K/HIF-1α途徑來實現的。本研究結果為肝癌侵襲的發病機制和防治研究提供了新的理論和實驗依據。

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EffectofextracellularHSP70/HSP70-PCsonepithelial-mesenchymaltransitionofhumanhepatocellularcarcinomaHepG2cells

LI Hang-yu1, LI Yan1, LIU Dan1, SUN Hong-zhi2, LIU Jin-gang1

(1DepartmentofGeneralSurgery,ShengjingHospitalAffiliatedtoChinaMedicalUniversity,Shenyang110004,China;2DepartmentofGeneralSurgery,theFirstHospitalAffiliatedtoLiaoningMedicalCollege,Jinzhou121001,China.E-mail:liujg@sj-hospital.org)

AIM: To investigate the effect of extracellular heat-shock protein 70 (HSP70)/HSP70-peptide complexes (HSP70-PCs) on epithelial-mesenchymal transition (EMT) of human hepatocellular carcinoma HepG2 cells and its probable mechanism.METHODSHepG2 cells were divided into 3 groups: control group, HSP70/HSP70-PCs (2 mg/L) group and LY294002+HSP70/HSP70-PCs group. The mRNA and protein expression of epithelial cell surface marker E-cadherin, mesenchymal cell surface marker α-smooth muscle actin (α-SMA), phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) and hypoxia-inducible factor 1α (HIF-1α) was examined by real-time RT-PCR and Western blotting.RESULTSExtracellular HSP70/HSP70-PCs promoted the initiation of EMT of HepG2 cells. The expression of HIF-1α and PI3K significantly increased in the process of EMT of HepG2 cells. After PI3K was blocked by LY294002, EMT did not occur and HIF-1α was not up-regulated in HepG2 cells.CONCLUSIONExtracellular HSP70/HSP70-PCs may promote EMT of hepatocellular carcinoma cells via PI3K/HIF-1α signaling pathway.

Epithelial-mesenchymal transition; HepG2 cells; Heat-shock protein 70

R735.7

A

1000- 4718(2013)09- 1631- 06

2013- 03- 27

2013- 06- 26

國家自然科學基金資助項目(No.81071955)；遼寧省教育廳科技項目計劃(No.L2010634)

△通訊作者Tel： 024-96615-31611; E-mail: liujg@sj-hospital.org

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.09.016