右美托咪啶通過抑制p38和JNK活化減少異氟醚誘導的新生大鼠海馬神經元凋亡*

王 飛， 李玉娟△， 曾敏婷， 韓 雪， 戴 婕

(中山大學孫逸仙紀念醫院1麻醉科，2藥物臨床試驗機構，廣東 廣州 510120)

右美托咪啶通過抑制p38和JNK活化減少異氟醚誘導的新生大鼠海馬神經元凋亡*

王 飛1， 李玉娟1△， 曾敏婷1， 韓 雪1， 戴 婕2

(中山大學孫逸仙紀念醫院1麻醉科，2藥物臨床試驗機構，廣東 廣州 510120)

目的探討右美托咪啶(dexmedetomidine, Dex)對異氟醚(isoflurane, Iso)誘導的新生大鼠海馬神經元凋亡的影響及其與p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38)和c-Jun 氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)蛋白活化的關系。方法48只出生后7 d的SD大鼠隨機分為對照組(Con組)、Dex組、Iso組和Iso+Dex組。前2組吸入空氣，后2組吸入0.75% Iso 6 h。Dex組和Iso+Dex組在麻醉前20 min和麻醉開始后2 h、4 h經腹腔注射25 μg·kg-1Dex；Con組和Iso組則在相同的時點注射150 μL生理鹽水。麻醉結束后使用TUNEL法檢測海馬神經元凋亡； Western blotting檢測海馬組織激活型caspase-3、p38、磷酸化p38(p-p38)、JNK和磷酸化JNK(p-JNK)蛋白表達的變化。結果(1) Iso組海馬CA1區TUNEL陽性細胞數較Con組增加447.57%(P<0.01)，Dex抑制Iso誘導的TUNEL陽性細胞增加達75.18%(P<0.01)。(2) Iso組海馬組織激活型caspase-3的表達比Con組增加126.29% (P<0.01)；Dex顯著抑制了Iso誘導的caspase-3活化(P<0.01)。(3) Iso組海馬p-p38/p38和p-JNK/JNK比值均較Con組明顯增加(P<0.01)；Dex顯著抑制了Iso誘導的p-p38 和p-JNK表達增加(P<0.01)。結論Dex能通過減少海馬神經元凋亡來減輕Iso對新生大鼠的腦毒性。抑制p38和JNK的磷酸化可能是Dex發揮保護作用的機制之一。

異氟醚； 右美托咪啶； 海馬； c-Jun 氨基末端激酶； p38 絲裂原活化蛋白激酶

全身麻醉是兒科麻醉最常用的麻醉方法，而異氟醚(isoflurane, Iso)作為臨床上常用的吸入全身麻醉藥，在兒科手術病人中應用非常廣泛。但近年來，多篇文章報道使用異氟醚可誘導發育期動物腦神經毒性作用并降低成年后的學習記憶功能[1-6]。由于吸入麻醉藥在產科及兒科手術中的使用難以避免，因此，尋找安全有效的減少異氟醚神經毒性的藥物具有非常重要的意義。

右美托咪啶(dexmedetomidine, Dex)是臨床上常用的高選擇性α2-腎上腺素能受體激動劑，具有抑制交感神經、鎮靜、催眠、鎮痛、減少麻醉用藥、減少術后譫妄等作用[7]，并對多種神經損傷模型具有保護作用[8]。Sanders等[9-10]發現Dex能劑量依賴性降低異氟醚誘導的出生后7 d大鼠海馬神經元凋亡和成年后認知功能障礙，但保護機制尚未明確。我們前期的工作發現，出生后7 d的SD大鼠吸入1.1%異氟醚4 h，可導致皮質磷酸化c-Jun 氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)、磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38)以及激活型caspase-3表達的增加，說明異氟醚導致的凋亡可能與JNK和p38的激活相關[4]。Dex是否能通過抑制JNK和p38激活來減輕異氟醚誘導的細胞凋亡？本研究擬采用出生后7 d SD大鼠吸入0.75%異氟醚6 h的實驗模型，同時復合Dex處理，探討異氟醚誘導海馬神經元凋亡和Dex保護作用的機制，為臨床麻醉藥物以及麻醉方案的選擇提供指導。

材 料 和 方 法

1材料

1.1儀器與試劑 麻醉呼吸機和氣體監護儀 (Datex-Ohmeda)，Dex(江蘇恒瑞醫藥股份有限公司)，異氟醚(Abbott)，激活型caspase-3單克隆抗體和磷酸化JNK多克隆抗體、磷酸化p38單克隆抗體(Cell Signaling Technology)，JNK單克隆抗體、p38 MAPK單克隆抗體、β-actin單克隆抗體、羊抗兔Ⅱ抗、羊抗小鼠Ⅱ抗和蘇木素染色液(上海碧云天生物技術公司)，TUNEL試劑盒(Roche)。

1.2動物及分組 48只SPF級出生后7 d SD大鼠，雌雄不限，12～16 g，由中山大學實驗動物中心提供，許可證號為SCXK(粵)2009-011。大鼠隨機分為4組：對照組(Con組)、Dex組、Iso組和Iso+Dex組。前2組吸入空氣，后2組吸入0.75%異氟醚6 h。Dex組和Iso+Dex組在麻醉前20 min和麻醉開始后2 h、4 h經腹腔注射25 μg·kg-1Dex；Con組和Iso組則在相同的時點注射150 μL生理鹽水。麻醉結束后(6 h)立刻取新鮮的海馬組織，Western blotting檢測海馬激活型caspase-3、磷酸化p38、總p38、磷酸化JNK和總JNK蛋白表達變化；另一部分幼鼠灌注取腦，制備石蠟切片，TUNEL法檢測海馬神經細胞凋亡。

2方法

2.1異氟醚吸入麻醉模型的建立 參照我們以前的方法[4-6]，將需要吸入異氟醚組別的大鼠置于自制透明塑料麻醉箱內，該麻醉箱連接于麻醉呼吸機螺紋管回路中，麻醉呼吸機工作狀態為手控模式，調節排氣閥接近最小壓力，以壓縮空氣作為載氣，通過異氟醚揮發罐后進入麻醉箱，出口處接氣體監護儀監測麻醉氣體濃度、氧濃度和二氧化碳濃度。調整揮發罐刻度和空氣流量，維持異氟醚濃度0.75%。其余動物置入另一個麻醉箱中吸入空氣，吸入時間均為6 h。麻醉過程中大鼠保持自主呼吸，持續觀察小鼠的呼吸頻率和膚色，并將兩麻醉箱置于水浴箱中，溫度維持36～37 ℃。在麻醉處理過程中，幼鼠呼吸均勻，膚色紅潤，無明顯呼吸抑制。

2.2組織準備 參照我們以前的方法[4-6]，每組在麻醉結束即刻取6只幼鼠，斷頭取腦，冰上分離腦皮質，液氮速凍后轉移至-80 ℃保存，組織用來做Western blotting分析。在麻醉結束后2 h每組各取6只幼鼠，經心臟灌注4%多聚甲醛0.1 mol/L PB液15 min后取腦。腦組織在同樣的灌注液中4 ℃后固定48 h后梯度乙醇脫水，石蠟包埋，經冠狀平面切取5 μm連續石蠟切片，參照幼鼠腦解剖圖譜，每只幼鼠選擇3個相同的海馬平面的切片(每個切片間隔200 μm)進行TUNEL染色。

2.3TUNEL 檢測海馬神經元凋亡 根據TUNEL試劑盒說明書，石蠟組織切片常規脫蠟至水；滴加20 mg·L-1蛋白酶K溶液室溫反應15 min；滴加TUNEL反應混合液50 μL(TdT 5 μL,熒光素連接的dUTP混合緩沖液 45 μL)后37 ℃濕盒中避光孵育60 min；加含辣根過氧化物酶的抗熒光素抗體37 ℃濕盒中避光孵育 30 min，DAB 顯色5～10 min，蘇木素復染，脫水，透明，中性樹膠封片。參照我們以前的方法[4-6]，使用IP Lab 7.0和Olympus IX70 倒置顯微鏡獲得大腦海馬各區×200圖像，用Image-Pro Plus軟件進行圖像分析，計算單位面積TUNEL陽性細胞數。

2.4Western blotting檢測蛋白表達 參照我們以前的方法[4-6]，麻醉結束后立即斷頭處死幼鼠，冰上快速分離海馬，加入適量裂解液勻漿后提取蛋白，BCA蛋白定量法測定蛋白濃度并調平各組蛋白濃度。各樣本等量蛋白進行SDS-PAGE電泳、轉膜、封閉，1∶2 000激活型caspase-3單克隆抗體、1∶1 000磷酸化p38單克隆抗體、1∶2 000磷酸化JNK多克隆抗體、1∶1 000 p38單克隆抗體以及1∶1 000 JNK單克隆抗體4 ℃孵育過夜，1∶1 000 Ⅱ抗室溫孵育2 h，使用ECL發光液進行膠片顯影。膠片掃描后用Image J軟件測量蛋白條帶的灰度值，以激活型caspase-3/β-actin、p-p38/p38和p-JNK/JNK比值行半定量分析，其中JNK兩條帶的分子量分別為54和46 kD，分別以p-p54/p54和p-p46/p46比值進行統計。

3統計學處理

用SPSS 13.0統計軟件分析。數據用均數±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1新生鼠海馬CA1區TUNEL陽性細胞的變化

如圖1所示，TUNEL法檢測凋亡細胞發現Iso組海馬CA1區TUNEL陽性細胞數為(94.70±11.82)個/mm2，較Con組[(17.30±4.98)個/mm2] 增加447.57%(P<0.01)；Iso+Dex組TUNEL陽性細胞數為(36.51±11.71)個/mm2，Dex抑制異氟醚誘導的TUNEL陽性細胞增加達75.18%(P<0.01)，但仍與Con組有顯著差異(P<0.05)，提示Dex可以顯著抑制異氟醚誘導的幼鼠海馬神經元凋亡；而Dex組與Con組比較差異無統計學意義，提示Dex不會誘導海馬神經元凋亡。

Figure 1. Apoptosis in hippocampal CA1 area of neonatal rats at the end of isoflurane (Iso) or air exposure with or without dexmedetomidine (Dex) treatment was detected by TUNEL staining.A: hippocampal structure (×40); B: control group (×200); C: Dex group (×200); D: Iso group (×200); E: Iso+Dex group (×200). Arrows indicate TUNEL positive cells. Scale bar: 50 μm.Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsB;##P<0.01vsD.

圖1TUNEL法檢測新生大鼠海馬CA1區神經元凋亡

2新生鼠海馬激活型caspase-3表達的變化

Western blotting檢測發現Iso組激活型caspase-3比Con組增加126.29% (P<0.01)； Dex完全抑制了異氟醚誘導的caspase-3表達增加，Iso+Dex組與Iso組比較差異有統計學意義(P<0.01)，與Con組比較差異無統計學意義，而Dex單獨使用不會顯著增加caspase-3的表達，見圖2。

Figure 2. Expression of cleaved caspase-3 protein in the hippocampus of neonatal rats at the end of isoflurane (Iso) or air exposure with or without dexmedetomidine (Dex) treatment.Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol (Con) group;##P<0.01vsIso group.

圖2Westernblotting檢測右美托咪啶對異氟醚誘導的激活型caspase-3表達的影響

3新生鼠海馬磷酸化p38表達的變化

Western blotting檢測發現Iso組p-p38/p38比值比Con組增加227.83% (P<0.01)，Iso+Dex組p-p38/p38比值較Iso組降低了86.48%(P<0.01)，Iso+Dex組和Con組差異無統計學意義，提示Dex完全抑制了異氟醚誘導的磷酸化p38表達增加；而Dex組與Con組比較差異無統計學意義，提示Dex單獨使用對p-p38的表達影響不大，見圖3。

4新生鼠海馬磷酸化JNK表達的變化

Western blotting檢測發現Iso組p-p54/p54比值比Con組增加314.25% (P<0.01)，Iso+Dex組p-p54/p54比值較Iso組減少89.75% (P<0.01)；Iso組p-p46/p46比值比Con組增加71.59% (P<0.01)，Iso+Dex組p-p46/p46比值較Iso組減少72.26% (P<0.05)；Iso+Dex組與Con組相比，p-p54/p54和p-p46/p46比值差異均無統計學意義，提示Dex完全抑制了異氟醚誘導的磷酸化JNK表達增加；而Dex組與Con組比較差異無統計學意義，提示Dex單獨使用對p-JNK的表達影響不大，見圖4。

討 論

異氟醚是NMDA受體拮抗劑與GABA受體激動劑，目前的研究發現其對發育動物的大腦具有誘導神經元凋亡的作用，而產生的神經毒性作用最為敏感的時期是腦突觸形成期(嚙齒類約相當于出生后0～14 d)[11-12]。在嚙齒動物中使用異氟醚或聯合使用N2O和咪唑安定，在出生后1～3 d可觀察到多個腦區神經元出現凋亡，這種神經元凋亡現象在出生后7 d使用麻醉藥的幼鼠大腦中達到高峰，而出生后10～14 d使用麻醉藥的幼鼠凋亡程度明顯下降[2]。因此，本實驗選取了出生后7 d的SD大鼠來作為研究異氟醚發育神經毒性的實驗動物，同時用Dex來干預和試圖闡明其保護機制。

Figure 3. Expression of p-p38,p38 and β-actin proteins in the hippocampus of neonatal rats at the end of isoflurane (Iso) or air exposure with or without dexmedetomidine (Dex) treatment.Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol (Con) group;##P<0.01vsIso group.

圖3Westernblotting檢測右美托咪啶對異氟醚誘導的磷酸化p38表達的影響

Figure 4. Expression of p-JNK，JNK and β-actin proteins in the hippocampus of neonatal rats at the end of isoflurane (Iso) or air exposure with or without dexmedetomidine (Dex) treatment.Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol (Con) group;#P<0.05,##P<0.01vsIso group.

圖4Westernblotting檢測右美托咪啶對異氟醚誘導的磷酸化JNK表達的影響

我們[4]前期研究發現，1.1%異氟醚誘導新生鼠腦皮質神經元凋亡增加。本研究選用更低濃度的0.75%異氟醚麻醉幼鼠6 h，在海馬組織中同樣也發現凋亡細胞增加以及凋亡蛋白caspase-3的表達增加。而且，異氟醚誘導的海馬神經元凋亡可以被Dex 重復給藥所抑制。由于Dex的半衰期為2 h，本研究選擇Dex 每隔2 h間斷給藥以維持Dex的作用效果。結果發現Dex (25 μg·kg-1)，每隔2 h間斷給藥能顯著減少TUNEL陽性細胞數的增加，使激活型caspase-3的蛋白表達水平顯著降低，這與Sanders等[9]結論相一致。

MAPK級聯信號通路是介導信號從細胞表面向核內傳遞的重要信號系統，參與細胞生長、增殖、分化、凋亡及細胞間的功能同步等多種生理過程。MAPK信號通路主要包括細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)1/2、JNK和p38信號通路。Dex保護作用的機制與MAPK信號通路之間的關系目前研究較少。Sanders等[10]發現Dex能增加ERK的表達，認為Dex降低異氟醚誘導的出生后7 d大鼠海馬神經元凋亡和成年后認知功能障礙的保護機制可能與ERK信號通路有關。我們前期研究發現1.1%異氟醚可以增加新生鼠皮質磷酸化JNK和p38的表達，本研究也證實0.75%的異氟醚也可以增加新生鼠海馬磷酸化JNK和p38的表達，說明異氟醚導致的凋亡可能與JNK和p38的激活相關。Dex保護作用與JNK和p38的表達有何關系呢？本研究發現Dex能完全抑制異氟醚誘導的p38和JNK磷酸化，提示抑制p38和JNK的活性可能是Dex抑制異氟醚誘導的海馬神經元凋亡的機制之一。

JNK和p38同屬應激激活蛋白，在很多神經損傷與細胞凋亡模型中能被激活[13-15]。JNK活化后可以進入線粒體，切割Bid蛋白，促進其向線粒體轉移，激活Bax，促細胞色素C的釋放； JNK還可以磷酸化Bim 和Bmf，進而激活Bax和/或 Bak 并促進凋亡，而磷酸化的Bim還可以抑制Bcl-2和Bcl-xL； JNK可以磷酸化Bad絲氨酸128位點來加強Bad的促凋亡作用；激活的JNK還可以磷酸化Bcl-2和Bcl-xl，抑制其抗凋亡的活性[16]。而p38活化后激活HIF-1和上調Noxa蛋白，下調抗凋亡蛋白Mcl-1，促進Bax從胞質向線粒體轉移，引起細胞色素C的釋放[17-18]；促進Bid的切割[19]，進而激活線粒體途徑導致凋亡。由此可見，JNK和p38可以通過影響線粒體功能來促進凋亡。已有文獻報道異氟醚可能通過下調神經元Bcl-2/Bax[20]或Bcl-xL/Bad[5]比值的線粒途徑促細胞凋亡，導致細胞核染色質固縮、斷裂，caspase-3和caspase-9的增加。而Dex可以通過調控Bax和Bcl-2的平衡而起到神經保護作用[21]。故我們猜測線粒體功能狀態的變化可能是異氟醚促凋亡、Dex抑凋亡的中心環節，而JNK和p38的激活起到橋梁的作用。異氟醚可能通過激活JNK和p38來激活促凋亡蛋白的轉錄和線粒體凋亡途徑，而Dex則可以通過抑制JNK和p38的活性來抑制促凋亡蛋白的轉錄和線粒體凋亡途徑。以上假設將在以后的研究中逐步完善。

本研究有一定的局限性，如沒有設置多個時點來觀察JNK和p38的變化，沒有用JNK和p38特異性的抑制劑來直接證明其在異氟醚促凋亡和Dex抑凋亡中的作用，沒有通過相關行為學實驗來驗證異氟醚和Dex對大鼠成年后學習記憶和認知的影響，這些實驗將在以后的研究中逐步完善。

綜上所述，本研究通過給出生后7 d新生大鼠吸入0.75%異氟醚6 h，并聯合使用Dex，發現Dex可能通過抑制p38和JNK的激活來減少異氟醚致新生大鼠海馬神經元的凋亡，為臨床麻醉藥物以及麻醉方案的選擇提供指導。

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Dexmedetomidinereducedisoflurane-inducedneuroapoptosisbyinhibitingactivationofp38andJNKproteinsinhippocampusofneonatalrats

WANG Fei1, LI Yu-juan1, ZENG Min-ting1, HAN Xue1, DAI Jie2

(1DepartmentofAnesthesiology,2DepartmentofDrugClinicalTrialInstitute,SunYat-senMemorialHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510120,China.E-mail:yujuan_04@hotmail.com)

AIM: To investigate the effect of dexmedetomidine (Dex) on neuronal apoptosis induced by isoflurane (Iso) and its relationship with the expression of p38 mitogen-activated protein kinase (p38) and c-Jun N-terminal kinase (JNK) proteins in the hippocampus of neonatal rats.METHODSForty-eight neonatal SD rats at postnatal day 7 were randomly divided into control group (Con), Dex group, Iso group and Iso combined with Dex (Iso+Dex) group. Rats in Iso and Iso+Dex groups were exposed to 0.75% Iso for 6 h, while rats in Con and Dex groups were exposed to air for 6 h. Rats were intraperitoneally injected with 25 μg·kg-1Dex (Dex and Iso+Dex groups) or 150 μL saline (Con and Iso groups) 20 min before exposure and 2 and 4 h after exposure. After the termination of anesthesia, the neuronal apoptosis in hippocampal CA1 region was detected by TUNEL staining, and the protein expression of cleaved caspase-3, phospho-p38 (p-p38), p38, phospho-JNK (p-JNK) and JNK in hippocampal tissues was detected by Western blotting.RESULTSThe number of TUNEL positive cells in hippocampal CA1 region of the rats in Iso group was increased by 447.57% (P<0.01) compared with Con group, while Dex significantly inhibited the increased TUNEL positive cells in Iso group by 75.18% (P<0.01). The expression of cleaved caspase-3 protein in Iso group was increased by 126.29% (P<0.01) compared with Con group, while Dex reversed the increased cleaved caspase-3 protein expression (P<0.01). Iso significantly increased the phosphorylation of p38 and JNK proteins (P<0.01), while Dex reversed the increased p-p38 and p-JNK proteins (P<0.01).CONCLUSIONDex attenuates Iso-induced neuroapoptosis in the hippocampus of neonatal rats through inhibiting the phosphorylation of p38 and JNK proteins.

Isoflurane; Dexmedetomidine; Hippocampus; c-Jun N-terminal kinase; p38 mitogen-activated protein kinases

R965

A

1000- 4718(2013)09- 1651- 06

2013- 04- 15

2013- 07- 09

國家青年自然科學基金資助項目(No. 30700787/C03030301)；廣東省自然科學基金資助項目 (No. S2011010004558)；廣東省科技社會發展項目(No. 2012B031800374)

△通訊作者 Tel: 020-81332060； E-mail: yujuan_04@hotmail.com

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.09.020