犀角地黃湯合銀翹散對流感病毒感染的小鼠肺組織及大鼠肺微血管內皮細胞ICAM-1和VCAM-1表達的影響*

張晨月， 張 舒， 吳 瑩， 金葉智， 李根茂， 王 謙， 郝 鈺

(北京中醫藥大學基礎醫學院，北京 100029)

犀角地黃湯合銀翹散對流感病毒感染的小鼠肺組織及大鼠肺微血管內皮細胞ICAM-1和VCAM-1表達的影響*

張晨月， 張 舒， 吳 瑩， 金葉智， 李根茂， 王 謙， 郝 鈺△

(北京中醫藥大學基礎醫學院，北京 100029)

目的研究中醫經典合方犀角地黃湯合銀翹散(XDY)對流感病毒性肺炎小鼠肺組織及對流感病毒感染的大鼠肺微血管內皮細胞(RPMVECs)中細胞間黏附分子1(ICAM-1)和血管細胞黏附分子1(VCAM-1)表達的影響，探討其治療病毒性肺炎的機制。方法54只雄性BALB/c小鼠隨機分為正常組、模型組和XDY組，每組18只，后2組以流感病毒滴鼻感染，XDY組灌胃給予XDY；在感染后的2、4和6 d分別取材，免疫組化法觀察肺組織中ICAM-1和VCAM-1表達。從雄性Wistar大鼠中分離并原代培養RPMVECs，設置正常組、病毒組、病毒+XDY含藥血清組、腫瘤壞死因子α(TNF-α)組和TNF-α+XDY含藥血清組；刺激因素作用24 h后，real-time PCR檢測ICAM-1和VCAM-1 mRNA水平，流式細胞術檢測ICAM-1和VCAM-1蛋白表達。結果與正常組比較，模型組肺組織中ICAM-1和VCAM-1表達持續增多(P<0.01)，而XDY組的表達均低于模型組 (P<0.01)；與正常組比較，流感病毒和TNF-α作用的RPMVECs中 ICAM-1和VCAM-1 mRNA及蛋白表達明顯升高(P<0.01)，XDY能下調ICAM-1和VCAM-1 mRNA及蛋白表達 (P<0.01)。結論抑制流感病毒感染導致的RPMVECs黏附分子的表達從而抑制機體的炎癥級聯反應可能是XDY治療流感病毒性肺炎的作用機制之一。

犀角地黃湯合銀翹散； 病毒性肺炎； 流感病毒； 肺微血管內皮細胞； 細胞間黏附分子1； 血管細胞黏附分子1

病毒性肺炎是流感最嚴重的并發癥之一，導致較高的死亡率[1]。因此，病毒性肺炎的防治在流感的治療中尤為重要。犀角地黃湯合銀翹散(Xijiao Dihuang and Yinqiao San decoction, XDY)是源于吳鞠通《溫病條辨·上焦篇》的經典合方，該方以銀翹散清解衛分之毒，以犀角地黃湯解營血之毒，兩方相合，具有清熱解毒、涼血止血、化瘀通絡之功效，臨床上臨證加減用于治療病毒性肺炎[2]。前期研究證實，流感病毒性肺炎小鼠肺組織有大量炎癥細胞浸潤，XDY對流感病毒沒有直接的抗病毒作用，但可減少肺組織中炎癥細胞的浸潤，主要通過抑制病毒所致的炎癥級聯反應起到治療作用[3]。黏附分子在白細胞與血管內皮細胞黏附、穿越血管壁而滲出的過程中發揮重要作用[4]，因此，本研究以流感病毒感染的小鼠為模型，觀察XDY對病毒性肺炎小鼠細胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)和血管細胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)表達的影響；以大鼠肺微血管內皮細胞(rat pulmonary microvascular endothelial cells, RPMVECs)為模型，研究XDY含藥血清對流感病毒感染的RPMVECs中ICAM-1和VCAM-1表達影響，探討XDY治療病毒性肺炎的相關分子機制。

材 料 和 方 法

1材料

1.1動物及病毒株 BALB/c小鼠(動物合格證號為SGXK20070001)和清潔雄性Wistar大鼠(動物合格證號為SGXK20120001)購自北京維通利華實驗動物中心；流感病毒亞洲甲型鼠肺適應株A/FM/1/34(H1N1)，由中國預防醫學科學院病毒學研究所提供，于9日齡雞胚尿囊腔連續傳代2次后，血凝滴度為1∶512。采用Reed Muench法[5]測定計算其對小鼠的半數致死量(50%lethal dose,LD50)為10-3.877, 半數組織培養感染劑量(50%tissue culture infectious dose,TCID50)為10-4.6/0.1 L。

1.2主要試劑 反轉錄試劑購自Fermentas MBI，PCR試劑購自大連寶生物工程有限公司，ICAM-1抗體和重組大鼠TNF-α購自Proteintech,SABC免疫組化試劑盒和VCAM-1抗體購自博士德。M199和胎牛血清購自HyClone，雙抗和胰蛋白酶-EDTA消化液購自Solarbio，RNeasy Mini Kit 購自Qiagen，Gold View和DNA MarkerⅠ購自北京科宏博恩。內皮細胞生長添加劑(Endothelial Cell Growth Supplement,ECGS)、PE Mouse Anti-Rat CD106和PE Mouse Anti-RatCD54購自BD。Rabbit Anti-PECAM-1購自北京博奧森。Real-time PCR引物：ICAM-1上游引物5’-AGG TATCCA TCC ATC CCA CA-3’，下游引物5’-GCC ACA GTT CTC AAA GCA CA-3’; VCAM-1上游引物5’-TGA CAT CTC CCC TGG ATC TC-3’，下游引物5’-CTC CAG TTT CCT TCG CTG AC-3’，由奧科生物科技有限公司合成。

1.3藥物 XDY復方，由水牛角30 g(代替犀角)、生地黃30 g、芍藥12 g、丹皮9 g、連翹9 g、金銀花9 g、苦桔梗6 g、薄荷6 g、竹葉4 g、生甘草5 g、荊芥穗5 g、淡豆豉5 g和牛蒡子9 g組成1劑，藥材購自北京同仁堂藥店。成人生藥量2.3 g·kg-1·d-1，小鼠的等效劑量為成人的10倍，即23 g·kg-1·d-1。大鼠的等效劑量為成人的6.3倍，即13.8 g·kg-1·d-1。將藥材煎制濃縮為含生藥2.07 kg/L的合劑，4 ℃保存備用。

2方法

2.1動物分組和造模 雄性BALB/c小鼠54只，體重16～18 g，隨機分為正常組、模型組和XDY組，每組18只。小鼠在乙醚輕度麻醉下，除正常組外每只小鼠以25 μL 50 LD50病毒液滴鼻感染，正常組用等量無菌PBS液滴鼻。感染后1 h，正常組和模型組予以雙蒸水灌胃；XDY組給XDY 23 g·kg-1·d-1灌胃；各組均為給藥2次/d，連續給藥5 d。

2.2免疫組化法檢測小鼠肺組織中ICAM-1和VCAM-1表達 感染后第2天、第4天和第6天，每組取6只小鼠處死，摘取肺臟，取全肺做常規固定、石蠟包埋、切片后，按試劑盒說明書操作。每組切片隨機選5張，每張取5個高倍(×400)視野，用高清晰度Olympus BX51光學顯微鏡加制冷攝像頭采集圖像，Image-Pro? Plus 5.1 圖像分析軟件測定肺內ICAM-1和VCAM-1蛋白表達，并計算其陽性表達積分吸光度(integral absorbance,IA)。

2.3XDY含藥血清的制備 Wistar大鼠，體重300 g左右，隨機分為2組，含藥血清組及正常組。含藥血清組給予XDY藥液13.8 g·kg-1·d-1灌胃，正常組給予等體積的生理鹽水，每日2次，連續3 d，于末次灌藥前12 h禁食。第4天早晨末次灌藥后1 h，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動脈采血，室溫靜置4 h后，3 000 r/min離心15 min，分離血清，經56 ℃、30 min滅活處理后，-70 ℃冰箱保存備用。

2.4RPMVECs原代培養及鑒定 根據姜明等[6]的方法,原代培養RPMVECs并進行鑒定。

2.5熒光定量PCR檢測RPMVECs中ICAM-1和VCAM-1 mRNA水平 原代培養RPMVECs，設置正常組、病毒組、病毒加XDY含藥血清組、TNF-α組和TNF-α加XDY含藥血清組(上述各組病毒最終滴度為100 TCID50，TNF-α終濃度為100 μg/L，含藥血清終濃度為15%)。干預因素作用24 h后，收集各組細胞，按RNeasy Mini Kit試劑盒操作說明書提取各組細胞總RNA，用TE綬沖液10倍稀釋。PCR擴增按One Step SYBR Prime Script PT-PCR kitⅡ試劑盒說明書進行。擴增條件為：Pattern 1：42 ℃ 5 min；95 ℃10 s；Pattern 2：循環40，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，測得Ct值。結果以目的基因與內參基因的比值表示。

2.6流式細胞術檢測ICAM-1和VCAM-1蛋白的表達 原代培養RPMVECs，分組同2.5。干預因素作用24 h，消化細胞，4 ℃、1 000 r/min離心5 min，棄上清，PBS溶液洗滌3次后,PE標記的ICAM-1和VCAM-1孵育30 min，4 ℃、1 000 r/min離心5 min，棄上清，再用PBS溶液洗滌3次后，4%多聚甲醛固定，流式細胞術檢測平均熒光強度。

3統計學處理

數據采用SPSS 16.0軟件分析。數據以均數±標準差(mean±SD)表示。多組間差異采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，組間兩兩比較用LSD法，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1XDY對肺組織中ICAM-1和VCAM-1表達的影響

感染后第6天各組肺組織ICAM-1和VCAM-1的免疫組化染色見圖1。流感病毒感染小鼠后第2天、第4天和第6天，模型組肺組織中ICAM-1和VCAM-1表達明顯增多，與正常組相比差異顯著(P<0.01)。XDY組黏附分子的表達在各個時點均低于模型組，差異顯著(P<0.01)，見圖2。

2Real-timePCR檢測流感病毒感染的RPMVECs中ICAM-1和VCAM-1mRNA水平

流感病毒感染RPMVECs 24 h后，病毒組ICAM-1和VCAM-1 mRNA表達明顯增多，與正常組相比有顯著差異(P<0.01)，病毒加XDY含藥血清組黏附分子mRNA的表達低于模型組，差異顯著(P<0.01)；TNF-α組ICAM-1和VCAM-1 mRNA表達明顯增多，與正常組相比差異顯著(P<0.01)，TNF-α加XDY含藥血清組黏附分子mRNA的表達低于TNF-α組，差異顯著(P<0.01)，見圖3。

Figure 1. Effect of XDY prescription on ICAM-1 and VCAM-1 expression in the lungs of mice with viral pneumonia on the 6th day after infection. A: control; B: mice were infected with influenza virus; C: mice were infected with influenza virus then treated with XDY.

圖1感染后第6天小鼠肺組織ICAM-1和VCAM-1的表達

Figure 2. Effects of XDY prescription on ICAM-1 (A) and VCAM-1(B) expression in the lungs of mice with viral pneumonia. Mean±SD．n=6．**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsmodel group.

圖2XDY對病毒性肺炎小鼠肺組織中ICAM-1和VCAM-1表達的影響

Figure 3. Effects of XDY prescription on ICAM-1 and VCAM-1 mRNA expression in RPMVECs exposed to virus or TNF-α. Mean±SD.n=3．△△P<0.01vscontrol group;**P<0.01vsvirus group;##P<0.01vsTNF-α group.

圖3XDY對流感病毒感染的RPMVECs中ICAM-1和VCAM-1mRNA表達的影響

3流式細胞術檢測流感病毒感染的RPMVECs中ICAM-1和VCAM-1蛋白的表達

干預因素作用24 h，與正常組比較，病毒組和TNF-α組RPMVECs的ICAM-1和VCAM-1表達升高，均有顯著差異(P<0.01)；與病毒組相比，病毒加含藥血清組ICAM-1和VCAM-1表達降低，且均有顯著差異(P<0.01)；與TNF-α組相比，TNF-α加XDY含藥血清組ICAM-1和VCAM-1表達降低，且均有顯著差異(P<0.01)，見圖4、5和表1。

討 論

XDY是治療病毒性肺炎的經典合方。前期研究已經證明該方可降低病毒性肺炎小鼠的死亡率,延長生存時間；體外研究表明XDY含藥血清可明顯抑制流感病毒感染后肺泡巨噬細胞炎癥細胞因子、炎癥介質及自由基的產生，具有抗炎作用[7]。本研究探討了XDY對流感病毒感染的小鼠肺組織及體外RPMVECs中黏附分子ICAM-1和VCAM-1表達的影響，以進一步闡述該方治療流感病毒性肺炎的作用機制。

病毒性肺炎是流感的常見并發癥，是導致流感較高死亡率的重要原因。前期研究表明，流感病毒在感染肺組織中的滴度與肺的病理改變并不同步，肺部炎性病變的發生不僅與病毒對細胞的直接作用有關，還與病毒感染后機體發生的炎癥級聯反應密切相關，過度的炎癥反應似乎在病毒性肺炎的發病過程中更為重要[3]。流感病毒感染后，體內單核巨噬細胞在肺組織周圍聚集并被激活，巨噬細胞釋放大量的前炎癥因子如TNF-α、趨化性細胞因子MCP-1及自由基等，在炎癥因子作用下，肺泡上皮細胞和微血管內皮細胞被激活，高表達ICAM-1、VCAM-1等黏附分子，吸引更多炎癥細胞聚集和過度活化，形成瀑布效應，導致嚴重病理損傷[4]。因此，ICAM-1和VCAM-1在病毒性肺炎的發病過程中尤為重要。有研究報道TNF-α通過與TNF-α受體作用導致磷脂酶C的激活，繼而水解PC-PLC產生DAG，從而激活PKC；上述通路參與調節TNF-α誘導NF-κB的激活，并與ICAM-1基因啟動子中的共識序列結合導致了ICAM-1表達升高[8]。又有研究證實內皮細胞上ICAM-1表達升高還會通過NF-κB之外的其它信號通路導致VCAM-1的升高[9]。

ICAM-1和VCAM-1是目前發現的介導內皮細胞與白細胞之間相互黏附的免疫球蛋白超家族黏附分子中最重要的兩種，分別通過與整合素家族的αLβ2和α4相結合發揮作用[10]。ICAM-1主要表達于內皮細胞、上皮細胞及淋巴細胞等的細胞膜表面，正常情況下表達量較低，炎癥因子刺激后，表達量迅速增加[11]。ICAM-1分子與αLβ2相互作用導致白細胞跨內皮遷徙最終積聚于炎癥部位[4、12]。研究發現，炎癥細胞黏附是腺病毒和呼吸道合胞病毒肺炎中肺部感染的重要環節，ICAM-1和其受體的相互作用又是炎癥細胞黏附、聚集的關鍵[13]。

Figure 4. The ICAM-1 expression detected by flow cytometry in RPMVECs exposed to virus or TNF-α. A:control group;B:virus group; C:virus+XDY group; D:TNF-α group; E:TNF-α+XDY group.

圖4流感病毒感染的RPMVECs中ICAM-1的表達

Figure 5. The VCAM-1 expression detected by flow cytometry in RPMVECs exposed to virus or TNF-α. A:control group;B:virus group; C:virus+XDY group; D:TNF-α group; E:TNF-α+XDY group.

圖5流感病毒感染的RPMVECs中VCAM-1的表達

表1XDY對流感病毒感染的RPMVECs中ICAM-1和VCAM-1蛋白表達的影響

Table 1. Effects of XDY on the protein expression of ICAM-1 and VCAM-1 in RPMVECs exposed to virus or TNF-α (IA．Mean±SD.n=3)

GroupICAM-1VCAM-1Control1221.50±115.161514.40±111.90Virus2367.70±142.29△△2970.40±113.06△△Virus+XDY2066.50±113.13**2385.60±111.28**TNF-α4156.60±124.94△△2431.10±111.87△△TNF-α+XDY1163.20±114.93##2140.80±113.03##

△△P<0.01vscontrol group;**P<0.01vsvirus group;##P<0.01vsTNF-α group

VCAM-1又名可誘導性細胞黏附分子，不僅可以在IL-1、TNF-α、IFN-γ等炎癥細胞因子的誘導下表達增加，其表達也能誘導細胞因子以及一些趨化因子的產生[14]。VCAM-1的表達也是非組成性的，在正常狀態下表達很少或不表達。在細胞因子(如TNF-α、IL-1β等)或內毒素的刺激下表達于內皮細胞、上皮細胞以及樹突狀細胞的表面，同時可介導白細胞與內皮細胞的黏附，介導炎癥反應由急性期轉向慢性期的過度階段中單核細胞的聚集[15]。

本研究發現XDY組黏附分子的表達在各個時點均低于模型組，證實了XDY能下調流感病毒引起的黏附分子的升高。前期研究證實XDY能抑制流感病毒感染肺組織中TNF-α的產生，而TNF-α又可誘導ICAM-1和VCAM-1的高表達。那么XDY降低ICAM-1和VCAM-1表達的作用是否與其對TNF-α的抑制有關呢？為此，本研究進一步觀察了XDY對TNF-α刺激RPMVECs后ICAM-1、VCAM-1表達的影響，結果表明XDY能降低TNF-α所致黏附分子表達的升高。這說明不論對病毒還是炎癥因子誘導的ICAM-1、VCAM-1高表達，XDY均有直接的抑制作用，從而證實了該方可作用于病毒感染后炎癥級聯反應中多個環節發揮治療作用。該方抗炎作用中的具體環節及作用的分子機制，我們將在今后的研究中進一步探討。

[1] Wang J, Oberley-Deegan R, Wang S, et al. Differentiated human alveolar type II cells secrete antiviral IL-29 (IFN-λ1) in response to influenza A infection[J]. J Immunol, 2009, 182(3):1296-1304.

[2] 吳 瑭. 溫病條辨[M]. 第1版.北京：人民衛生出版社, 2005：63.

[3] 郝 鈺, 李季倩, 吳 瑩, 等. 犀角地黃湯合銀翹散對流感病毒性肺炎小鼠肺病毒滴度和肺組織病理改變的影響[J]. 北京中醫藥大學學報, 2010, 33(11):739-744.

[4] Hayashi T, Hasegawa K, Ichinohe N. ICAM-1 expression on endothelium and systemic cytokine production in cutaneous neutrophilic leukocytoclastic vasculitis in NZBxNZWF1mice[J]. Histol Histopathol, 2005, 20(1):45-47.

[5] 黃幀祥. 醫學病毒學基礎及實驗技術[M]. 第1版.北京:科學出版社, 1990：152．

[6] 姜 明, 金 巖, 劉 源, 等. 大鼠肺微血管內皮細胞培養方法的研究[J]. 實用口腔醫學雜志, 2004, 20(1):24-26

[7] 吳 瑩, 金葉智, 孟 建, 等. 犀角地黃湯合銀翹散含藥血清抑制流感病毒感染大鼠肺泡巨噬細胞致炎物質的研究[J]. 中華中醫藥雜志, 2010, 25(12):1974-1978.

[8] Krunkosky TM, Fischer BM, Martin LD, et al. Effects of TNF-α on expression of ICAM-1 in human airway epithelial cellsinvitro[J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 2000, 22(6):685-692.

[9] Lawson C, Ainsworth M, Yacoub M, et al. Ligation of ICAM-1 on endothelial cells leads to expression of VCAM-1 via a nuclear factor-κB-independent mechanism[J]. J Immunol, 1999, 162(5):2990-2996.

[10] Osborn L, Hession C, Tizard R, et al. Direct expression cloning of vascular cell adhesion molecule 1, a cytokine induced endothelial protein that binds to lymphocytes[J]. Cell, 1989, 59(6):1203-1211.

[11] 楊 紅, 斯 琴, 孫仁宇. 肺血管內皮細胞在大鼠急性肺損傷發生中的作用[J].中國病理生理雜志, 2000, 16(9):831-834.

[12] Zhou Z, Liu Y, Miao AD, et al. Protocatechuic aldehyde suppresses TNF-α-induced ICAM-1 and VCAM-1 expression in human umbilical vein endothelial cells[J]. Eur J Pharmacol, 2005, 513(1-2):1-8.

[13] Wang SZ, Smith PK, Lovejoy M, et al. Shedding of L-selectin and PECAM-1 and upregulation of Mac-1 and ICAM-1 on neutrophils in RSV bronchiolitis[J]. Am J Physiol, 1998, 275(5 Pt 1): L983-L989.

[14] 黃建林, 林灼鋒, 羅敏琪，等. 青藤堿抑制TNF-α誘導人臍靜脈內皮細胞VCAM-1表達[J].中國病理生理雜志, 2007, 23(4):634-638.

[15] Alevriadou BR. CAMs and Rho small GTPases:gatekeepers for leukocyte transendothelial migration.Focus on“VCAM-1-mediated Rac signaling controls endothelial cell-cell contacts and leukocyte transmigration”[J]. Am J Physiol Cell Physiol, 2003, 285(2):C250-C252.

EffectsofXijiaoDihuangandYinqiaoSandecoctiononICAM-1andVCAM-1expressioninmouselungtissuesandratpulmonarymicrovascularendothelialcellsinfectedwithinfluenzavirus

ZHANG Chen-yue, ZHANG Shu, WU Ying, KIM Ye-ji, LI Gen-mao, WANG Qian, HAO Yu

(SchoolofBasicMedicalSciences,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China.E-mail:yuhao64@sina.com)

AIM: To investigate the effects of Xijiao Dihuang and Yinqiao San decoction (XDY) on the expression of intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) and vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) in mouse lung tissues and rat pulmonary microvascular endothelial cells (RPMVECs) infected with influenza virus, and to explore its mechanism for treatment of viral pneumonia.METHODSFifty-four male BALB/c mice were randomly divided into normal group, model group and XDY group (n=18 in each group). The viral pneumonia model was established by intranasally dripping influenza A (H1N1) virus into the mice. The mice in XDY group were treated with XDY 1 h after dripping the virus. The expression of ICAM-1 and VCAM-1 in lung tissues was examined by immunohistochemical staining 2, 4 and 6 d after infection. On the other hand, RPMVECs were obtained from male Wistar rats and primarily cultured. The cells were randomly divided into control group, virus group, virus+XDY group, tumor necrosis factor α (TNF-α) group and TNF-α+XDY group. The mRNA and protein expression of ICAM-1 and VCAM-1 was evaluated by real-time PCR and flow cytometry 24 h after infection.RESULTSVirus exposure increased ICAM-1 and VCAM-1 expression in mouse lung tissues (P<0.01), and XDY treatment attenuated this effect (P<0.01). Virus and TNF-α both led to the increases in mRNA and protein expression of ICAM-1 and VCAM-1 in RPMVECs (P<0.01), which were also reduced by treatment with XDY (P<0.01).CONCLUSIONTreatment with XDY decreases virus-induced ICAM-1 and VCAM-1 expression, suggesting an important role of XDY in treatment of viral pneumonia.

Xijiao Dihuang and Yinqiao San decoction; Viral pneumonia; Influenza virus; Pulmonary microvascular endothelial cells; Intercellular adhesion molecule-1; Vascular cell adhesion molecule-1

R364.5

A

1000- 4718(2013)09- 1685- 06

2013- 05- 10

2013- 07- 17

國家自然科學基金資助項目(No.30772871)

△通訊作者 Tel: 010-64286973; E-mail: yuhao64@sina.com

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.09.026