甘油和半纖維素水解液共發酵生產1，3-丙二醇

金 平，王領民，張 霖，廖 莎，黃 和

（1. 中國石化 撫順石油化工研究院，遼寧 撫順 113001；2. 南京工業大學 生物與制藥工程學院，江蘇 南京 210009）

當前生物煉制技術的快速發展引起人們的廣泛關注，它是以一種可持續發展的方式解決石油資源匱乏和環境污染問題［1］。以可再生資源為原料，采用生物煉制技術生產大宗化工產品，實現石油基化工產品的生物替代有著重大的現實意義。1，3-丙二醇（1，3-PDO）是用于合成聚酯和聚氨酯的重要單體，目前市場需求量巨大［2］。與化學法相比，甘油發酵法生產1，3-PDO以其環境友好和節能減排等諸多優點展示出良好的發展前景。在甘油發酵工藝中，甘油原料價格對1，3-PDO生產成本有較大影響，因此利用廉價碳源作為發酵輔助碳源，降低甘油消耗，促進1，3-PDO的生物合成成為研究熱點［3］。

半纖維素是自然界中常見的多糖，在木質生物質中占20%～35%（w）。近年來，由于木質纖維素廣泛用于各種農業產品的生產過程，人們也開始關注半纖維素水解液（HH）的生物轉化［4］。利用稀硫酸預處理玉米秸稈是一種常見且較有效的方法。但酸解過程會產生很多單糖和微生物抑制物，主要包括木糖、葡萄糖、甘露糖、醋酸和糠醛等。目前雖然有大量關于HH生物利用制取乙醇的研究，但很少有研究關注HH中各種還原糖分和各種抑制物對以K. pneumoniae為菌種生產1，3-PDO的影響［5］。

本工作以K.pneumoniae為菌種，利用HH作為輔助底物與甘油共發酵，考察了HH對細胞生長和1，3-PDO合成的影響。

1 實驗方法

1.1 菌種

菌種采用K.pneumoniae（FY-5），為中國石化撫順石油化工研究院自主篩選，4 ℃下保存于Luria-Bertani培養基斜面。

1.2 玉米秸稈酸解處理

將玉米秸稈研磨為粒徑小于等于1 mm的粉末。以液固質量比10∶1向粉末中加入2%（φ）的H2SO4溶液，在100 ℃下處理2 h。然后在25 ℃下用Ca（OH）2調節水解液pH至8.0，所得上清液即HH（成分見表1）。將上清液在40 ℃下真空蒸發濃縮至木糖質量濃度達到50 g/L，作為補料分批發酵的原料［6-7］。

表1 HH的成分Table 1 Composition of hemicellulose hydrolysate(HH)

1.3 菌種的培養和發酵

種子培養基組成為：酵母粉3.0 g/L、麥芽粉3.0 g/L、蛋白胨5.0 g/L和NaCl 5.0 g/L。基本發酵培養基組成為：酵母粉5.0 g/L、K2HPO4·3H2O 10.0 g/L、KH2PO42.0 g/L、NH4Cl 1.0 g/L、NaCl 0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.1 g/L、FeCl3·6H2O 30 mg/L、CoCl2·6H2O 5 mg/L、維生素B125 mg/L和甘油30.0 g/L。共發酵培養基在基本發酵培養基的基礎上補充了HH。HH中含有木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖，其中木糖為主要碳源；還含有3種主要抑制物：糠醛、甲酸鹽和乙酸鹽（見表1）。實驗過程中向基本發酵培養基中分別單獨添加一定濃度的4種單糖（葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖）的一種、組合添加單糖以及單獨添加3種抑制物的一種，來檢測它們對細胞生長和1，3-PDO合成的影響。

在含有100 mL種子培養基的搖瓶（250 mL）中接種K. pneumoniae，于37 ℃、140 r/min下在搖床中培養10 h。然后以5%（φ）的接種量接入含有100 mL發酵培養基的搖瓶（250 mL）中。在3 L攪拌罐中進行批次發酵，培養基為基本發酵培養基或共發酵培養基，工作體積為2 L，通氣量為0.25 m3/（m3·min）。初始pH為7.0，發酵過程中不控制pH，發酵溫度37 ℃，攪拌轉速300 r/min。

在7 L攪拌罐中進行補料分批發酵，工作體積為4 L，通氣量為0.25 m3/（m3·min）。在甘油和HH共發酵過程中，添加HH（2 L）使初始木糖質量濃度為11.20 g/L，發酵過程中木糖質量濃度控制在5～8 g/L；甘油初始質量濃度為30 g/L，發酵過程中甘油質量濃度控制在15～20 g/L。通過控制HH流加速率在線調節發酵體系中組分的濃度，采用10 mol/L的NaOH 溶液自動調節pH為7.0。

1.4 分析方法

利用Yan等［8］報道的方法檢測HH的成分。采用Dionex公司UltiMate 3000型高效液相色譜儀。甲酸和乙酸用Bio-Rad Aminex HPX-87H柱檢測，示差檢測器，流動相為0.005 mol/L的H2SO4溶液，流量0.6 mL/min，柱溫60 ℃；糖用Bio-RAD Aminex HPX-87P柱檢測，示差檢測器，流動相為水，流量0.6 mL/min，柱溫85 ℃；甘油、1，3-PDO、2，3-丁二醇（2，3-BDO）、乳酸、乙醇、琥珀酸和木糖用Bio-Rad Aminex HPX-87H柱檢測，示差檢測器，流動相為0.005 mol/L的H2SO4溶液，流量0.8 mL/min，柱溫65 ℃。

生物量的測定采用世諾公司752型紫外-可見分光光度計。通過測定菌體在600 nm處的吸光度（OD600），再根據標準方程（見式（1））將OD600轉化成細胞干重（CDW）。

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2 結果與討論

2.1 以HH為輔助底物批次發酵生產1，3-PDO

以HH為輔助底物在3 L攪拌罐中批次發酵與甘油單獨發酵的比較見表2。

表2 以HH為輔助底物在3 L發酵罐中批次發酵與甘油單獨發酵的比較Table 2 Comparison between batch fermentation with HH as cosubstrate in a 3 L reactor and fermention with AG as alone substrate

由表2可看出，通過添加HH，發酵效率明顯提高。發酵20 h后，1，3-PDO的質量濃度、甘油的轉化率和生產力比甘油單獨發酵分別提高了18.2%，24.4%，18.0%。共發酵的副產物，除乙酸外，2，3-BDO、乙醇、琥珀酸和乳酸的質量濃度也有不同程度的提高，特別是2，3-BDO的質量濃度是甘油單獨發酵的2倍以上。菌體生物量（以OD600計）也從5.48提高到7.13。

盡管前期研究［9-10］已采用甘油和木糖共發酵，但由于采用純木糖作為輔助底物，仍存在高成本問題。上述實驗結果表明，添加HH是一種用于提高1，3-PDO發酵效率的經濟可行的方法。HH雖不能直接轉化成1，3-PDO，但可用于生物量的積累和還原力的再生，進而使更多的甘油和還原力流向1，3-PDO的合成途徑。

早期的研究［11］表明，生物量和1，3-PDO的生物合成呈正相關，即生物量越大，生產力越高。本實驗得到類似的結果，但2，3-BDO的生成量偏大，原因可能如下：1）2，3-BDO適宜的發酵pH為6.5，尤其適合沒有pH控制的條件［8-9］；而本實驗批次發酵過程中不進行pH控制，由于副產物酸的生成，使體系大部分時間都處于低pH；2）更多的底物（甘油和HH）和提供H的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸流向2，3-BDO的合成途徑；3）在HH中木糖含量最大，K. pneumoniae菌種可直接利用木糖和葡萄糖發酵合成2，3-BDO。

2.2 HH中各種糖組分對細胞生長和1，3-PDO合成的影響

在一定濃度下，HH中的各種糖組分對細胞生長和1，3-PDO合成的影響見圖1。

圖1 HH中的各種糖組分對細胞生長和1，3-PDO合成的影響Fig.1 Effects of every sugars in HH on the cell growth and 1，3-PDO biosynthesis.

由圖1可看出，在搖瓶中發酵29 h后，以木糖（11.20 g/L）為輔助底物共發酵，1，3-PDO的質量濃度（10.35 g/L）和生物量（OD600=4.17）均達到最大。添加甘露糖（0.65 g/L）也能顯著提高1，3-PDO的質量濃度（9.79 g/L）和生物量（OD600=3.90）。這可能是由于在K. pneumoniae菌種中，甘露糖的代謝可以更有效地積累還原力。因此，盡管在HH中甘露糖的含量很低，但對細胞生長和1，3-PDO合成有較顯著的影響。半乳糖（1.03 g/L）和阿拉伯糖（1.72 g/L）對細胞生長和1，3-PDO合成沒有影響。與甘油單獨發酵相比，葡萄糖（1.45 g/L）對1，3-PDO合成產生負面影響：生物量提高了6.5%，而1，3-PDO的質量濃度下降了20.5%。葡萄糖抑制了1，3-PDO的合成可能是由于“葡萄糖效應”造成的，細菌培養過程中在葡萄糖沒有被利用完之前，甘油不能被利用［12］。

利用混合糖模擬HH（其中含有葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、乳糖和木糖，其質量濃度分別控制在1.45，0.65，1.72，1.03，11.20 g/L），研究各種糖的組合對批次發酵的影響，實驗結果見圖2和圖3。

圖2 混合糖對細胞生長和1，3-PDO合成的影響Fig.2 Effects of mixed sugars(MS) on the cell growth and 1，3-PDO biosynthesis.

圖3 混合糖中各組分在1，3-PDO合成中的消耗情況Fig.3 Consumption of the every components in the MS in 1，3-PDO biosynthesis.

由圖3可看出，與甘油單獨發酵相比，添加混合糖發酵時，甘油吸收速率在前4 h相對較低；4～8 h超過甘油單獨發酵過程，此時1，3-PDO快速積累。發酵過程中木糖、葡萄糖和甘露糖同時以一定的速率消耗，半乳糖和阿拉伯糖在整個發酵過程中濃度基本不變化，表明K. pneumoniae菌種不能利用半乳糖和阿拉伯糖發酵合成1，3-PDO。

2.3 HH中主要抑制物對細胞生長和1，3-PDO合成的影響

HH中的主要抑制物有糠醛、甲酸鹽和乙酸鹽，這些抑制物對細胞生長和1，3-PDO合成的影響見圖4。由圖4可看出，與不添加抑制物相比，添加0.28 g/L糠醛時，生物量提高了12%，同時1，3-PDO質量濃度也略有提高。產生這種現象的原因一方面可能是低濃度糠醛不會對菌種生長產生抑制，另一方面可能是低濃度糠醛在代謝過程中被轉化成低抑制的物質［13］。添加0.61 g/L甲酸鹽時，對細胞生長和1，3-PDO的合成產生輕微抑制，生物量和1，3-PDO質量濃度分別降低了9.8%和1.1%。而添加1.46 g/L乙酸鹽時，生物量略有提高，1，3-PDO質量濃度從8.77 g/L增至11.73 g/L。

圖4 HH中主要抑制物對細胞生長和1，3-PDO合成的影響Fig.4 Effects of main inhibitors in HH on the cell growth and 1，3-PDO biosynthesis.

關于高濃度乙酸鹽對發酵過程的影響有很多報道。Xue等［14］的研究表明，有機酸鹽（檸檬酸鹽、延胡索酸鹽和琥珀酸鹽）的添加可提高1，3-PDO的產量，乳酸和乙醇等副產物的產量會明顯降低；而添加10 g/L乙酸時會抑制1，3-PDO的生產。Lü等［15］研究了乙酸鹽對富含多糖的有機污水發酵過程的影響。他們發現在體系pH為6時添加一定量的乙酸鹽會產生乙醇，同時產生甲醇和甲酸鹽。He等［16］也報道了提高乙酸鹽的濃度對發酵生產乙醇的影響，這種促進作用使Thermonanaerobacter ethanolicus菌種發酵生產乙醇的產量提高394%。同樣，利用乙酸鹽還可由Clostridium acetobutylicum菌種發酵生產丁醇和由Kelbsiella aerogenes菌種發酵生產丁二醇［17］。而本實驗結果表明，低濃度的乙酸鹽可有效促進K.pneumoniae菌種發酵合成1，3-PDO。

2.4 以HH為輔助底物補料分批發酵生產1，3-PDO

以HH為輔助底物在7 L攪拌罐中補料分批發酵與甘油單獨發酵的比較見表3。

表3 以HH為輔助底物在7 L攪拌罐中補料分批發酵與甘油單獨發酵的比較Table 3 Comparison between fed-batch fermentation with HH as cosubstrate in a 7 L reactor and fermention with glycerol as alone substrate

由表3可看出，以HH為輔助底物進行補料分批發酵，終點生物量（OD600）達到15.09，高于甘油單獨發酵的結果（10.45）。HH的添加提高了1，3-PDO的質量濃度、甘油的轉化率和生產力，使其分別從60.78 g/L提高到71.58 g/L、從52%提高到65%以及從1.64 g/（L·h）提高到1.93 g/（L·h），比甘油單獨發酵分別提高了17.8%，25.0%，17.7%。比較表2和表3可看出，相對于1，3-PDO，除2，3-BDO和乳酸鹽外，其他副產物的產出情況類似于批次發酵。由于pH控制在7.0不利于形成2，3-BDO，因此補料分批發酵2，3-BDO的產量比批次發酵低；而乳酸鹽適合在pH為7.0條件下形成，而且有更多的還原力和底物（甘油和HH）流向乳酸鹽的合成途徑，因此乳酸鹽的產量比批次發酵高。

3 結論

1）以HH為輔助底物與甘油共發酵，在3 L攪拌罐中進行批次發酵，1，3-PDO的質量濃度、甘油的轉化率和生產力比甘油單獨發酵分別提高了18.2%，24.4%，18.0%；在7 L攪拌罐中進行補料分批發酵，1，3-PDO的質量濃度、甘油的轉化率和生產力比甘油單獨發酵分別提高了17.8%，25.0%，17.7%。表明添加HH是提高發酵效率的經濟可行的方法。

2）HH中的木糖和甘露糖能顯著提高1，3-PDO的產量和生物量，葡萄糖對1，3-PDO的合成產生抑制，而半乳糖和阿拉伯糖沒有影響。利用混合糖模擬HH，1，3-PDO的質量濃度和生物量比甘油單獨發酵分別提高了17.8%和20.6%。

3）HH中的抑制物對發酵合成1，3-PDO有不同的影響。添加甲酸鹽時，對細胞生長和1，3-PDO的合成產生輕微抑制；而添加糠醛和乙酸鹽時，細胞生長和1，3-PDO質量濃度均有不同程度的提高。

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