軟脈降脂合劑干預動脈搭橋術內皮細胞損傷的研究*

許 平， 彭 輝， 朱 瑩， 賀嵩敏， 馮 兵， 李秀麗， 黃小千， 陳 婷， 張小寧， 鄭廣娟△

(1廣東省心血管病研究所, 2廣東省人民醫院，廣東 廣州 510080； 3 廣東省中醫院, 4廣東省中醫藥科學院，廣東 廣州 510006；5山東中醫藥大學，山東 濟南 250355； 6廣州中醫藥大學，廣東 廣州 510006； 7安徽省立友誼醫院，安徽 合肥 230041)

軟脈降脂合劑干預動脈搭橋術內皮細胞損傷的研究*

許 平1,2， 彭 輝3,4， 朱 瑩3,4， 賀嵩敏3,4， 馮 兵3,4， 李秀麗5， 黃小千5， 陳 婷6， 張小寧7， 鄭廣娟3,4△

(1廣東省心血管病研究所,2廣東省人民醫院，廣東 廣州 510080；3廣東省中醫院,4廣東省中醫藥科學院，廣東 廣州 510006；5山東中醫藥大學，山東 濟南 250355；6廣州中醫藥大學，廣東 廣州 510006；7安徽省立友誼醫院，安徽 合肥 230041)

目的觀察軟脈降脂合劑對兔動脈搭橋術后內皮細胞功能的影響，探討軟脈降脂合劑在動脈搭橋術后再狹窄發生過程中的防治作用，以及中藥治療冠狀動脈搭橋術(CABG)后再狹窄的可能作用機制。方法新西蘭大白兔隨機分為4組：模型組、阿司匹林對照組、軟脈降脂中劑量組和軟脈降脂高劑量組，行右側頸動脈搭橋術。術后給藥灌胃8周后，取抗凝血用流式細胞儀檢測循環內皮細胞(CECs)，取血清用ELISA檢測P-選擇素和細胞間黏附分子1(ICAM-1)水平。結果各給藥組和模型組比較，CECs相對比例、P-選擇素和ICAM-1明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)。軟脈降脂合劑2組與阿司匹林對照組比較差異也有統計學意義(P<0.05)。結論中藥軟脈降脂合劑能夠降低動脈搭橋術后的CECs、P-選擇素和ICAM-1水平，有助于改善CABG術后內皮細胞的功能。

軟脈降脂合劑； 動脈搭橋術； 內皮細胞

動脈粥樣硬化是當今世界威脅人類健康、導致人群發病和死亡的主要疾病之一。冠狀動脈搭橋術(coronary artery bypass grafting，CABG)是晚期冠心病患者主要的治療方法。術后10年，約有50%靜脈橋血管出現嚴重狹窄[1]，而內皮細胞的損傷是靜脈橋病變的始動因素和主要原因[2]。本研究旨在觀察中藥復方軟脈降脂合劑對兔動脈搭橋術后內皮功能的影響，從而為CABG預后的改善提供實驗依據。

材 料 和 方 法

1材料

1.1試劑和儀器 FITC標記CD146抗體(eBioscience)；小鼠抗兔CD45抗體(AbD Serotec MCA808GA)；PE標記山羊抗小鼠IgG(Santa Cruz)；兔可溶性P-選擇素(soluble P-selectin,sP-selectin) 酶聯免疫分析試劑盒(Cusabio)；兔細胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule 1,ICAM-1/CD54)酶聯免疫分析試劑盒(Cusabio)。軟脈降脂合劑，由山東中醫藥大學藥廠提供，產品批號：20l20601；阿司匹林腸溶片購自拜耳醫藥保健有限公司,產品批號：BJ06370。Eppendorf高速臺式冷凍離心機，型號為5430R；貝克曼庫爾特公司產流式細胞儀，型號為FC500；WPI雙目動物手術顯微鏡，型號為PSMT5。

1.2動物 新西蘭大白兔32只，雌、雄不限，體重2.0～2.5 kg，由廣州市花都區花東信華實驗動物養殖場提供，動物實驗許可證號為SYXK(粵)2008-0094，動物質量合格證號為0104377。

2方法

2.1動脈搭橋術動物模型建立 按文獻[3-4]建立動物模型。兔稱取體重后，按1 mL/kg腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉，給予2 500 U肝素抗凝。外科無菌操作技術下，取右側頸靜脈約2 cm作為自體血管橋備用，斷端用8/0號線縫合。分離暴露右側頸動脈，在手術顯微鏡下以10/0 prolene線將截取的頸靜脈與該段頸動脈行端側吻合。鏡下觀察吻合端血流通暢，無漏血滲血。遂切口分層縫合，創面滴青霉素數滴以防感染。術后常規給予青霉素肌注3d以預防感染。手術后至處死前均給予肝素2 500 U/d。手術過程中死亡1只，考慮該只動物手術時間過長，循環衰竭死亡。

2.2分組及給藥 32只新西蘭大白兔，隨機分為4組：模型組、阿司匹林對照組、軟脈降脂中劑量組、軟脈降脂高劑量組，每組8只。行右側頸總動脈搭橋術后，各組均飼以正常飲食，模型組給予生理鹽水10 mL/d灌胃，阿司匹林對照組給予阿司匹林每只2.2 mg/d灌胃，軟脈中、高劑量組分別給予每只0.11 g/d、0.22 g/d灌胃。給藥時間為8周。灌胃過程中模型組死亡2只，解剖發現吻合段血管栓塞，且感染嚴重，考慮術后并發癥死亡。

3指標檢測

3.1流式細胞術檢測循環內皮細胞(circulating endothelial cells，CECs)比例 以含 EDTA-K2抗凝的血常規管采血2 mL，血液采集后2 h內處理。取2支流式管，其中第1管加入5 μL CD146-FITC，檢測單種CD146標記的CECs；第2管先加入5 μL CD146-FITC，然后每管加入EDTA-K2 抗凝的全血50 μL。洗脫后第2管再加入共同孵育過的5 μL CD45和5 μL IgG-PE，檢測2種標記的CECs。混勻后室溫下避光孵育20 min ，加入10 mL 溶血素，37 ℃水浴箱內放置10 min，待完全溶血后，立刻上流式細胞儀檢測。

3.2ELISA檢測P-選擇素表達 分離膠促凝采血管取血，離心后取血清。酶聯板標準孔中加入相應標準品50 μL，檢測孔分別加入已稀釋血清50 μL，并立即加入酶結合物工作液50 μL，輕輕晃動混勻。37 ℃反應30 min。洗板5次，每次浸泡1～2 min，200 μL/well，甩干。依序每孔加底物溶液90 μL，37 ℃避光顯色10 min。依序每孔加終止溶液50 μL，終止反應。15 min內用酶標儀在450 nm波長依序測量各孔的吸光度(A)。用專業軟件Curve Exert 1.3制作標準曲線，根據標準曲線的直線回歸方程式計算出樣品濃度。

3.3ELISA檢測ICAM-1表達 分離膠促凝采血管取血，離心后取血清。酶聯板空白孔中加樣品稀釋液100 μL，余孔分別加標準品或待測樣品100 μL，輕輕晃動混勻。37 ℃反應120 min。棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加生物素標記抗體工作液100 μL，37 ℃，60 min。溫育60 min后，棄去孔內液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1～2 min，200 μL/well，甩干。依序每孔加底物溶液90 μL，37 ℃避光顯色5 min。依序每孔加終止溶液50 μL，終止反應。15 min內用酶標儀在450 nm波長依序測量各孔的A值。用專業軟件Curve Exert 1.3制作標準曲線，根據標準曲線的直線回歸方程式計算出樣品濃度。

4統計學處理

采用SPSS 17.0統計軟件分析，計量資料以均數±標準差(mean±SD)表示，多組之間比較采用方差分析。

結 果

1CECs檢測結果

單標CD146+CECs絕對計數及相對比例分析，各給藥組與模型組比較均減低，差異有統計學意義(P<0.05)，軟脈降脂合劑中、高劑量2組與阿司匹林對照組比較也有降低，差異有統計學意義(P<0.05)；雙標CD146+/CD45-CECs絕對計數及相對比例分析，各給藥組與模型組比較均降低，差異有統計學意義(P<0.05)，軟脈降脂合劑高劑量組與阿司匹林對照組比較也有降低，差異有統計學意義(P<0.05)；軟脈降脂合劑2組組間未見顯著差異，但是表現出一定的量效正相關,見圖1。

Figure 1. The comparison of the absolute number and relative proportion of CECs detected by two methods. A: absolute number of CD146+CECs; B: relative proportion of CD146+CECs; C: absolute number of CD146+/CD45-CECs; D: relative proportion of CD146+/CD45-CECs.Mean±SD.n=6 in model group;n=8 in other groups.*P<0.05vsmodel group;▲P<0.05vsaspirin group.

圖12種方法標記CECs的絕對數量和相對比例比較

2P-選擇素ELISA檢測結果

軟脈降脂合劑中、高劑量組和阿司匹林對照組P-選擇素含量與模型組相比均降低，差異有統計學意義(P<0.05)，軟脈降脂合劑高劑量組與阿司匹林對照組比較也有降低，差異有統計學意義(P<0.05),見圖2。

3ICAM-1ELISA檢測結果

軟脈降脂合劑中、高劑量組和阿司匹林對照組ICAM-1水平與模型組相比均降低，差異有統計學意義(P<0.05)，軟脈降脂合劑中、高劑量組ICAM-1水平與阿司匹林對照組比較也有降低，差異有統計學意義(P<0.05),見圖3。

討 論

CABG術后再狹窄是一個復雜的生物學過程，血管內皮細胞(vascular endothelial cells，VECs)損傷是導致術后再狹窄的關鍵因素。CECs是指外周血中測得的血管內皮細胞。目前的研究表明，CECs數量可以表明血管損傷的程度或和其相關，而且CECs的決定因素比較單一。外周血中增多的循環內皮細胞有效反映血管的損傷和機能障礙。因此，CECs可以作為檢測抗血管損傷治療藥物療效的標志物之一，在血管損傷治療中具有很大的研究前景[5]。由于現在對定義CECs的最好CD分子組合缺乏統一性，并且兔的抗體不易獲得，我們選擇了最被大家廣泛應用的CD146和CD45。通過CD45-來排除造血細胞及活化的T淋巴細胞。CD146是重要的標志物，雖然CD146在滋養母細胞、骨髓成纖維細胞、周細胞和一些腫瘤細胞上都有表達，但是它是能從CD45-細胞群中分辨出CECs的特異性標志物。

Figure 2. Concentration of P-selectin detected by ELISA.Mean±SD.n=6 in model group;n=8 in other groups.*P<0.05vsmodel group;▲P<0.05vsaspirin group.

圖2P-選擇素ELISA檢測結果分析

Figure 3. Concentration of ICAM-1 measured by ELISA.Mean±SD.n=6 in model group;n=8 in other groups*P<0.05vsmodel group；▲P<0.05vsaspirin group.

圖3ICAM-1ELISA檢測結果分析

隨著對再狹窄分子機制的深入研究，人們發現參與再狹窄過程中的多種粘附分子都參與其中。P-選擇素是細胞粘附分子中的選擇素家族的主要成員之一。血管受損后，P-選擇素暴露于血小板質膜表面，通過與單核細胞、中性粒細胞和T淋巴細胞表面的配體結合，在血小板和白細胞相互作用的過程中，啟動血栓形成的凝血反應[6]，并且導致血管內膜的增生[7]。從而，在與CABG術后再狹窄的炎癥反應和血栓形成中起重要作用。

ICAM-1是細胞表面上的一種跨膜蛋白抗原，在CABG中，不僅造成白細胞浸潤、活化、炎癥因子釋放，加劇了組織的損傷，而且導致損傷的組織修復延滯；同時位于白細胞表面的粘附分子——β2整合素，即血管內皮細胞表面的ICAM-1(CD54)介導的級聯反應可以進一步增強白細胞的上述變化以及淋巴細胞的活化。有研究顯示，通心絡超微粉可能通過抗氧化、抑制NF-κB核轉位進而降低ICAM-1蛋白表達保護血管內皮功能，有效阻止動脈粥樣硬化的進展[8]。ICAM-1升高的程度直接反映內皮細胞表達 ICAM-1 的狀況，因此，血漿中的ICAM-1可作為一種潛在內皮功能狀態的標志[9]。

活血化瘀中藥干預心血管疾病已得到眾多研究肯定，有報道蜂膠水提物通過對血管內皮細胞粘附分子表達的影響起到抗動脈粥樣硬化的作用[10]。根據中醫藥理論及CABG術后VECs損傷的病理生理機制的新的觀點，我們提出益氣活血降濁軟堅中藥配伍有望提高干預CABG術后VECs損傷的療效,進而提出了益氣活血降濁軟堅中藥組方的復方：軟脈降脂合劑，并且對其降脂及改善內皮功能進行了預試驗，包括基礎實驗研究[11]及臨床研究[12]。軟脈降脂合劑是由黃芪、丹參、決明子及昆布的提取物等組成，其功能主要是益氣健脾、化痰降濁和活血通絡。

實驗中我們采用了單標CD146+計數CECs法及雙標CD146+/CD45-計數CECs法，比較了實驗兔模型組與給藥組CECs占全血細胞數量的百分比情況。結果發現模型組和給藥組比較，無論在單標CD146計數CECs法還是在2種標志物計數CECs法中，平均CECs的百分比均是明顯增高，兩者比較差異有統計學意義(P<0.05)。中藥與西藥對照組比較差異也有統計學意義(P<0.05)。而軟脈降脂合劑中、高兩個劑量組雖然組間比較未見有顯著差異，但是還是表現出了一定的量效關系。ELISA檢測P-選擇素和ICAM-1的表達，軟脈降脂合劑中、高劑量組和西藥對照組與模型組相比均降低，差異有統計學意義(P<0.05)，軟脈降脂合劑高劑量組與西藥對照組比較也有降低，差異有統計學意義(P<0.05)。本研究發現，在CABG術后，P-選擇素和ICAM-1的表達主要在手術段血管內皮細胞升高，軟脈降脂合劑能夠明顯抑制損傷血管內膜P-選擇素和ICAM-1的表達，同時降低CECs數量，從而減輕術后內皮細胞的損傷。綜上可見，中藥軟脈降脂合劑對于CABG術后的血管內皮損傷有促進修復的作用，有助于改善CABG的預后。

[1] Goldman S，Zadina K，Moritz T，et al．Long-term patency of saphenous vein and left internal mammary artery grafts after coronary artery bypass surgery： results from a Department of Veterans Affairs cooperative Study[J]．J Am Coll Cardiol，2004，44(11)：2149-2156．

[2] Fang L，Wei H，Mak KH，et al．Markers of low-grade inflammation and soluble cell adhesion molecules in Chinese patients with coronary artery disease[J]．Can J Cardiol，2004，20(14)：1433-1438．

[3] Shi Y, O’Brien JE, Mannion JD, et al. Remodeling of autologous saphenous vein grafts: the role of perivascular myofibroblasts[J]. Circulation,1997,95(12): 2684-2693.

[4] O’Brien JE, Shi Y, Fard A, et al. Wound healing around and within saphenous vein bypass grafts[J]. J Thorac Cardiovasc Surg,1997,114(1):38-45.

[5] Woywodt A, Bahlmann FH, De Groot K, et al. Circulating endothelial cells: life, death, detachment and repair of the endothelial cell layer[J]. Nephrol Dial Transplant, 2002, 17(10):1728-1730.

[6] Yasue H，Nakagawa H，Itoh T，et al．Coronary artery spasm: clinical features，diagnosis，pathogenesis，and treatment[J]．J Cardiol, 2008, 51(1): 2-17．

[7] Li M, Zhang Y, Ren H, et al． Effect of elopidogrel on the inflammatory progression of early atherosclerosis in rabbits model [J]．Atheroselerosis, 2007, 194(2): 348-356.

[8] 吳以嶺, 袁國強, 游佳華, 等. 通心絡超微粉對高脂飲食兔主動脈內皮保護機制的實驗研究[J]. 中國病理生理雜志, 2007, 23(4): 629-633.

[9] Suboda V, Todd JA. Fundamental of endothelial function for the clinical cardiologist[J]．Circulation, 2002, 105(5): 546-549．

[10]張云香, 陳文峰, 王家富, 等. 蜂膠水提物對血管內皮細胞黏附分子表達的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2010, 26(12): 2311-2315.

[11]馬慧萍, 鄭廣娟, 張 靜, 等. 軟脈降脂膠囊對載脂蛋白 E基因敲除小鼠動脈粥樣硬化影響的實驗研究[J]. 中西醫結合心腦血管病雜志, 2005, 3(2): 132-134.

[12]李寶華, 鄭廣娟, 張文高, 等. 自制軟脈降脂膠囊對血脂及內皮依賴性舒張功能的影響[J]. 實用醫藥雜志, 2004, 21(9): 820-821.

EffectofRuanmaijiangzhimixtureinterventiononendothelialcellfunctionafterarterybypassgraft

XU Ping1,2, PENG Hui3, 4, ZHU Ying3, 4, HE Song-min3, 4, FENG Bing3, 4, LI Xiu-li5, HUANG Xiao-qian5, CHEN Ting6, ZHANG Xiao-ning7, ZHENG Guang-juan3,4

(1GuangdongCardiovascularInstitute,2GuangdongGeneralHospital,Guangzhou510080,China;3GuangdongHospitalofTraditionalChineseMedicine,4GuangdongProvincialAcademyofChineseMedicalSciences,Guangzhou510006,China;5ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine,Jinan250355,China;6GuangzhouUniversityofTraditionalChineseMedicine,Guangzhou510006,China;7AnhuiProvincialFriendshipHospital,Hefei230041,China.E-mail:zhengguangjuan@163.com)

AIM: To observe the effect of Ruanmaijiangzhi mixture on the function of endothelial cells in rabbits after artery bypass graft.METHODSA New Zealand white rabbit model of right common carotid artery bypass graft was established. The rabbits were randomly divided into 4 groups: model group, aspirin control group, middle dose of Ruanmaijiangzhi group and high dose of Ruanmaijiangzhi group. Eight weeks after treatment, circulating endothelial cells (CECs) in anticoagulated blood were detected by flow cytometry. The serum levels of P-selectin and intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) were measured by ELISA.RESULTSCompared with model group, the relative ratio of CECs, and the levels of P-selectin and ICAM-1 in medication administration groups were significantly decreased. The effect in Ruanmaijiangzhi groups was better than that in aspirin control group. Ruanmaijiangzhi treatment showed a positive dose-related correlation.CONCLUSIONChinese medicine Ruanmaijiangzhi mixture decreases CECs, P-selectin and ICAM-1 to improve the endothelial cell function after coronary artery bypass graft.

Ruanmaijiangzhi mixture; Artery bypass graft; Endothelial cells

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.01.003

1000- 4718(2013)01- 0015- 05

2012- 11- 01

2012- 12- 20

廣東省自然科學基金資助項目(No.9151009504000007)；高等學校博士學科點專項科研基金資助項目(No.20104425110005)

△通訊作者 Tel：020-81887233；E-mail：zhengguangjuan@163.com.