胰島素控制血糖對糖尿病大鼠腎組織Smad7表達及纖維化病變的影響*

王圓圓， 李 霜， 劉麗榮， 蘇 博， 石 磊， 石明雋， 肖 瑛， 張國忠， 郭 兵

(貴陽醫學院病理生理學教研室，貴州 貴陽 550004)

胰島素控制血糖對糖尿病大鼠腎組織Smad7表達及纖維化病變的影響*

王圓圓， 李 霜， 劉麗榮， 蘇 博， 石 磊， 石明雋， 肖 瑛， 張國忠， 郭 兵△

(貴陽醫學院病理生理學教研室，貴州 貴陽 550004)

目的觀察胰島素控制糖尿病大鼠血糖后是否能上調腎組織Smad7的表達，減輕或延緩糖尿病腎病(DN)腎纖維化病變的發生發展。方法鏈脲菌素復制大鼠糖尿病模型，隨機分為糖尿病組(DM組) 和胰島素治療組(INS組) (n=8)；INS組于成模13周起用胰島素將血糖控制在4～7 mmol/L；同時設正常對照組(NC組)(n=8)。17周處死大鼠，檢測相應生化指標，觀察胰腺和腎組織病理學改變，免疫組化和Western blotting檢測各組大鼠腎組織組織轉化生長因子β1(transforming growth factor β1, TGF-β1)、Smad泛素化調節因子2(Smad ubiquitin regulatory factor 2, Smurf2)、Smad7、 E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)、層連蛋白(fibronectin, FN)和膠原蛋白Ⅰ(collagenⅠ)的蛋白表達。結果與NC組比較，DM組大鼠體重顯著減輕，24 h尿蛋白、血糖和甘油三酯顯著升高(P<0.05)，病理檢查顯示胰島被破壞，腎組織TGF-β1、Smurf2、α-SMA、FN和collagenⅠ蛋白的表達均顯著增加(P<0.05)，并伴有腎小管Smad7和E-cadherin的表達減少(P<0.05)；而經胰島素控制血糖后，INS組大鼠較DM組體重逐漸增加，24 h尿蛋白和血糖均顯著降低 (P<0.05)，腎纖維化病變明顯改善，TGF-β1、Smurf2、α-SMA、FN和collagenⅠ蛋白的表達均顯著減少(P< 0.05)，Smad7和E-cadherin的表達顯著上調(P<0.05)。結論控制血糖能恢復糖尿病大鼠腎組織Smad7蛋白表達水平，減少細胞外基質的沉積，延緩DN的纖維化進展，其機制可能與腎組織中TGF-β1和Smurf2表達降低、Smad7蛋白的泛素化降解減少有關。

糖尿病腎??； 轉化生長因子β； Smad7； 胰島素

糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN) 已成為導致終末期腎衰竭及糖尿病(diabetes mellitus, DM)病死率增加的重要原因。積極防治DN的纖維化病變，對患者的轉歸具有重要意義。DN的發病機制未完全闡明，研究發現，轉化生長因子 β1(transforming growth factor β1, TGF-β1) / Smads介導的細胞信號通路在DN發病中發揮著關鍵的致纖維化效應[1-2]。Smad7作為抑制性Smad蛋白，可以抑制TGF-β1/Smads介導的生物學效應，然而在多種腎纖維化疾病過程中，Smad7的蛋白表達顯著下調[1,3]。近年研究表明控制血糖可部分逆轉糖尿病腎纖維化病變[4]，但有關血糖控制與糖尿病大鼠腎損傷的關系尚需進一步研究。本文旨在觀察胰島素控制糖尿病大鼠血糖后是否能減輕或延緩DN腎纖維化病變的發生發展，并以Smad7為靶點，探討其可能機制。

材 料 和 方 法

1材料

1.1實驗動物 健康清潔級雄性SD大鼠24只，體重(180±20) g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，批號為SCXK(京)2009-0004。

1.2主要試劑 鏈脲菌素(streptozotocin, STZ;Sigma)；甘精胰島素(Novo Nordisk);TGF-β1多克隆抗體、β-actin單克隆抗體和DAB顯色劑(博士德公司);Smad7、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、層連蛋白(fibronectin, FN)和膠原蛋白Ⅰ(collagenⅠ)多克隆抗體(博奧森生物技術有限公司)；Smurf2抗體(Abcam)；兩步法免疫組化檢測試劑(中杉金橋生物技術有限公司)；Western印跡用PVDF膜和3 mm Whatman濾紙 (Millipore)；超敏ECL化學發光試劑盒(碧云天生物研究所)。

1.3主要器材 穩步倍加型血糖儀(強生公司)，超低溫冰箱(Sanyo)，高速低溫離心機(Beckman)，Bayer 1650全自動生化分析儀(Beckman)，電泳系統及電轉移裝置(Amersham)，凝膠成像系統(Bio-Rad)。

2方法

2.1糖尿病模型的制備和分組 16只大鼠適應性飼養1周后，乙醚麻醉后尾靜脈按55 mg/kg注射0.01 mol/L無菌檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH 4.5)的STZ。48 h后測空腹血糖，血糖值≥16.7 mmol/L為糖尿病大鼠模型成功。隨機分成糖尿病組(DM組)和胰島素治療組(INS組), 每組8只動物，INS組從第13周起開始皮下注射甘精胰島素，實行個體化劑量，以血糖控制在4～7 mmol/L、尿糖陰性為準；DM組同時注射溶媒。并設相同鼠齡正常對照組(NC組)(n=8)，操作同上。各組大鼠均給予普通飼料，自由飲水。

2.2大鼠的血、尿、胰腺和腎組織收集 實驗17周時處死動物。處死前收集24 h尿液，記錄尿量。禁食6～8 h，稱重，麻醉后股動脈穿刺采集血液，4 ℃離心，分離血清，尿液和血清于-20 ℃保存供檢測尿蛋白及生化指標用。開腹取胰腺和腎臟，胰腺及一側腎臟固定于4%多聚甲醛供制作石蠟切片用，另一腎臟于-80 ℃保存供Western印跡檢測。

2.3生化指標檢測 氧化酶法測血清葡萄糖(blood glucose,BG)； CHOD-PAP法測血總膽固醇(choleste-rol,CHO)；GOD-PAP法測血甘油三酯(triglyceride,TG)；考馬斯亮藍法測尿蛋白(urine protein,UP)，均按試劑說明書操作。UP與24 h尿量乘積為24 h UP。

2.4胰腺和腎組織形態學觀察 胰腺和腎臟組織行石蠟切片，HE染色后光鏡下觀察胰腺和腎組織形態結構的改變，Masson染色觀察腎組織的纖維化病變。

2.5免疫組化染色 采用免疫組化SP法檢測TGF-β1(1∶50)、Smad7(1∶200)、E-cadherin(1∶75)、α-SMA (1∶100)和collagenⅠ(1∶100)在各組大鼠腎組織的分布和表達，PBS作為陰性對照，DAB顯色，蘇木素復染。TGF-β1、FN和collagenⅠ陽性表達計數方法參考本實驗室以前的研究[5]，取10個高倍(400倍)視野，取均值。

2.6Western blotting檢測 取-80 ℃保存的各組大鼠腎皮質，每組100 mg，分別加入組織蛋白提取液后勻漿、離心、取上清，用BCA試劑盒(碧云天)測定各組蛋白質濃度，按所測得濃度計算每泳道所需體積，加入加樣緩沖液煮沸10 min。經10%SDS-PAGE凝膠電泳分離，再轉移至PVDF膜上，脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入Smad7、Smurf2、E-cadherin、α-SMA或β-actinⅠ抗，工作濃度分別為1∶200、1∶600、1∶100、1∶150和1∶300，4 ℃孵育過夜。次日用TBST洗膜后，加入相應的辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗(濃度均為1∶5 000)室溫孵育1 h，再加入ECL化學發光試劑，暗室曝光，Bio-Rad凝膠成像系統掃描膠片，Quantity One軟件分析各條帶的面積和灰度值，兩者乘積為積分灰度值，每個樣本重復操作3 次。同一張膠上Smad7、Smurf2、E-cadherin、α-SMA與相應的β-actin條帶所測積分灰度值的比值，即相應蛋白的相對表達量。

3統計學處理

用SPSS 13.0 統計軟件處理，數據以均數±標準差(Mean±SD)表示，多組比較采用單因素方差分析(方差齊時，采用SNK-q檢驗；不齊時，采用Games-Howell檢驗)，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1大鼠一般情況和相關生化指標的檢測

糖尿病大鼠模型復制成功后，DM組大鼠逐漸出現多飲、多尿、多食等現象，較相同鼠齡NC組，DM組大鼠體重顯著減輕(P<0.05)，而INS組給予胰島素控制血糖后，大鼠多飲、多尿、多食現象有所改善，體重逐漸增加，在治療4周(總16周)后有統計學意義(P<0.05)； DM組24 h UP、BG和TG顯著高于NC組(P<0.05)，而與DM組大鼠相比，INS組BG和24 h UP均顯著降低(P<0.05)，如見圖1。

2糖尿病大鼠胰腺組織和腎組織病理學改變

胰腺HE染色可見NC組大鼠胰島完整，輪廓規則整齊，胰島內細胞排列整齊，胞漿飽滿，細胞界限清楚，而DM組胰島內形態欠規則，細胞排列紊亂，常有細胞缺失、塌陷及炎癥細胞浸潤，見圖2。腎組織HE染色顯示NC組腎臟結構清晰完整，DM組大鼠部分腎小管擴張，腎小管上皮細胞(renal tubular epithelial cell, RTEC)空泡變性，細胞萎縮和脫落，小管間質細胞增多伴有炎癥細胞的浸潤，毛細血管基底膜增厚，INS組病變明顯減輕。腎組織Masson染色顯示NC組腎小球完整，清晰，RTEC飽滿，而DM組腎臟結構排列不清，可見腎小球和腎小管纖維化明顯，INS組病變減輕，見圖2。

Figure 1. Levels of metabolic and renal parameters. A: body weight of rats in each group at each equal time；B: levels of 24 h urine protein(24 h UP), blood glucose(BG), cholesterol(CHO), triglyceride(TG) in each group.Mean±SD.n=8.*P<0.05vsNC group;▲P<0.05vsDM group.

圖1各組大鼠代謝和腎臟參數

Figure 2. Histological changes of rat pancreatic (A; HE staining,×200) and renal (B; HE staining and Masson staining, ×200) tissues.

圖2各組大鼠胰腺和腎組織形態學變化

3TGF-β1、FN、collagenI、E-cadherin和α-SMA蛋白在各組大鼠腎組織中的表達

免疫組化結果提示，NC組大鼠腎組織TGF-β1極少表達， FN和collagenⅠ的陽性染色僅少量存在于細胞間質；DM組大鼠腎組織TGF-β1、FN和collagenⅠ的表達明顯增加，均顯著高于NC組(P<0.05)；而INS組大鼠腎組織TGF-β1、FN和collagenⅠ的表達較DM組明顯減少(P<0.05)，見圖3。

Figure 3. The expression of TGF-β1, FN and collagenⅠ in renal tissues(immunohistochemical staining,×400). The arrows indicate positive expression.Mean±SD.n=8.*P<0.05vsNC group,▲P<0.05vsDM group.

圖3TGF-β1、FN和collagenⅠ在各組大鼠腎組織中的表達

免疫組化顯示，E-cadherin在大鼠腎組織主要表達于RTEC。Western blotting檢測表明，與NC組相比，DM組大鼠腎皮質中E-cadherin蛋白的表達明顯下調(P<0.05)，而INS組大鼠E-cadherin蛋白表達較DM組明顯增多(P<0.05)，見圖4。

α-SMA在正常大鼠的腎皮質表達極少，僅在血管周圍見到陽性表達，而在DM組大鼠RTEC可見到大量陽性染色。Western blotting檢測表明：與NC組相比，DM組大鼠腎皮質中α-SMA蛋白的表達顯著增多(P<0.05)，而INS組大鼠α-SMA表達較DM組顯著減少(P<0.05)，見圖5。

4Smad7和Smurf2蛋白在各組大鼠腎組織中的表達

與NC組相比，DM組大鼠腎皮質中Smad7蛋白的表達明顯下調(P<0.05)，僅為正常時的48%；INS組大鼠Smad7蛋白表達較DM組明顯增多(P<0.05)，見圖6。

Smurf2在DM組大鼠腎組織表達增加，顯著高于NC組(P<0.05)，而INS組大鼠腎組織Smurf2表達較DM組明顯減少(P<0.05)，見圖7。

討 論

本研究用STZ尾靜脈注射復制大鼠DM模型，DM大鼠血糖顯著升高且尿糖陽性，胰腺組織切片可見胰島縮小，β細胞數量減少，同時出現明顯的蛋白尿，血肌酐顯著升高，腎組織中FN和collagenⅠ蛋白表達增多，提示糖尿病大鼠出現腎纖維化的病理改變，并發有DN。

Figure 4. The level of E-cadherin expression in rat renal tissues. A: Immunohistochemical staining(×400). The arrow indicates positive expression. B: Western blotting.Mean±SD.n=8.*P<0.05vsNC group;▲P<0.05vsDM group.

圖4E-cadherin在腎組織中的分布及在各組大鼠腎組織中的表達

Figure 5. The level of α-SMA expression in rat renal tissues. A: immunohistochemical staining (×400). The arrow indicates positive expression. B: Western blotting.Mean±SD.n=8.*P<0.05vsNC group;▲P<0.05vsDM group.

圖5α-SMA在腎組織中的分布及在各組大鼠腎組織中的表達

Figure 6. The level of Smad7 expression in rat renal tissues. A: immunohistochemical staining (×400). The arrow indicates positive expression. B: Western blotting.Mean±SD.n=8.*P<0.05vsNC group;▲P<0.05vsDM group.

圖6Smad7在腎組織中的分布及在各組大鼠腎組織中的表達

Figure 7. The level of Smurf2 expression in rat renal tissues detected by Western blotting.Mean±SD.n=8.*P<0.05vsNC group;▲P<0.05vsDM group.

圖7Smurf2在各組大鼠腎組織中的表達

大量研究表明，TGF-β1在嚴重的腎纖維化病程中表達均上調，發揮多種致纖維化效應，成為腎纖維化疾病發生過程中的重要細胞因子[1-3]。在DM狀態下，高糖介導多種細胞表達TGF-β1， TGF-β1通過跨膜的Ⅱ型(TβRⅡ)和Ⅰ型(TβRⅠ)受體激活其下游的Smad2/3，Smad2/3隨后與Smad4形成復合物轉移入細胞核中參與TGF-β1目的基因的轉錄活化而發揮其致纖維化效應。我們的研究結果顯示，糖尿病大鼠16周時，其腎組織中TGF-β1表達顯著增加，RTEC表達的上皮細胞標志物E-cadherin顯著減少，而間質細胞標志物α-SMA出現高表達，提示RTEC向間質細胞轉分化(epithelial to mesenchymal transition, EMT)的發生，且FN和collagenⅠ在腎間質也顯著增加，表明細胞外基質(extracellular matrix, ECM) 的沉積增多[2,6-7]。由RTEC經EMT過程發展而來的成纖維細胞活化后，可誘導ECM的產生，進一步加重腎臟的纖維化[8]。因此，對抗TGF-β1的致纖維化效應已成為防治腎纖維化的研究熱點。

Smad7蛋白作為抑制性Smad，可通過多個環節對抗TGF-β1/Smad信號通路的效應：Smad7可與TβRI形成一個穩定復合物，從而抑制其招募及磷酸化R-Smad及R-Smad-Smad4復合物的形成[9]，并且與TβRI 結合的Smad7能作為配體招募WW-HECT型E3泛素連接酶介導對TβRI的降解[10]，同時有多種蛋白通過與Smad7結合而調節TβRI的活性和穩定性[11]；而在細胞核內，Smad7能通過MH2結構域綁定到特定的DNA結構域，與去乙酰酶抑制劑及其它一些轉錄共抑制因子共同抑制TGF-β1/Smad目的基因的轉錄[12]。近年來研究發現Smad7在腎纖維化疾病進程中表現出抑制纖維化病變的作用[1,3]。Liu等[2]將特異性作用于腎臟包含Smad7基因的質粒轉染db/db小鼠后，發現由TGF-β1/Smad2/3介導的腎纖維化病變明顯減輕[2]；在DN進程中，發現將Smad7基因敲除能增強TGF-β1/Smad2/3介導的腎臟損害，包括：尿蛋白出現、腎小球和腎小管間質collagenⅠ、collagenⅣ、FN的沉積，而過表達Smad7基因能減輕上述病理改變[13]。這些研究提示：Smad7作為TGF-β1/Smad信號通路的負調節因子，其蛋白表達的水平決定了TGF-β1的生物效應。本實驗中，我們發現Smad7蛋白在DN時表達明顯減少，僅為正常時的48%，從而使TGF-β1過激活Smad2/3，誘導了EMT的發生和ECM的沉積，促進DM時腎組織的纖維化。Fukasawa等[14]的研究結果顯示，在單側輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction, UUO)模型的腎組織中Smad7蛋白的表達進行性減少，但其mRNA的表達上調，進一步研究發現Smad蛋白的減少是由于E3泛素連接酶介導的泛素化降解增強所致，而加入蛋白酶體抑制劑會抑制Smad7的降解，Liu等[1]也有相同的發現。但是，也有作者得出不同的研究結果，他們發現UUO模型可以導致Smad7 mRNA的表達減少[15-16]。本實驗的免疫印跡結果發現：E3泛素連接酶Smurf2在DN時的表達顯著增多，提示DN時表達上調的Smurf2可能增強了對Smad7蛋白的降解作用，導致Smad7蛋白表達明顯減少，進而使TGF-β1/Smad信號通路失去控制，促進了DN的發生發展。但是，Smad7蛋白在DN的表達減少是由于E3泛素連接酶介導的泛素蛋白酶途徑對其蛋白的降解作用，還是同時有mRNA表達下調兩者共同作用的結果，目前并不清楚，將有待于我們進一步研究。

我們于DM成模12周后，開始胰島素干預，通過對大鼠個體化治療將其血糖降至正常范圍，觀察控制血糖是否能減緩DN的發生發展。隨著胰島素治療時間的延長，與DM組大鼠相比，INS組大鼠多飲、多尿、多食現象有所改善，體重逐漸增加、24 h UP顯著降低，TG和CHO表現出減少的趨勢，提示大鼠的代謝功能明顯改善，并且腎組織HE和Masson染色顯示，腎臟纖維化病變明顯減輕。同時，大鼠腎組織中Smad7蛋白的表達顯著上調，TGF-β1和Smurf2表達顯著減少，而RTEC表達的E-cadherin增加，α-SMA表達減少，FN 、collagenⅠ在腎間質的沉積減少。表明控制血糖可以延緩甚至逆轉DN的發展，其機制可能是由于TGF-β1和Smurf2表達下調，抑制性調節蛋白Smad7表達水平恢復等共同作用的結果。

綜上所述，糖尿病大鼠腎組織TGF-β1和Smurf2表達增加，上調的Smurf2可能通過增強對Smad7蛋白的泛素化降解而促進DN的發生發展；控制血糖可通過降低腎組織中TGF-β1及Smurf2的表達而恢復Smad7蛋白表達水平，減少ECM的沉積，延緩DN的纖維化進展。但是，Smad7蛋白在DN的表達減少是由于在蛋白水平的降解增加，還是同時有其基因水平的表達下調的綜合作用，有待進一步研究證實。

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EffectofbloodglucosecontrolonexpressionofSmad7andrenalfibrosisindiabeticrats

WANG Yuan-yuan, LI Shuang, LIU Li-rong, SU Bo, SHI Lei, SHI Ming-jun, XIAO Ying, ZHANG Guo-zhong, GUO Bing

(DepartmentofPathophysiology,GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,China.E-mail:guobingbs@126.com)

AIM: To verify the hypothesis that treatment with insulin to control the blood glucose (BG) may relieve or slow down the development of diabetic nephropathy (DN) in diabetic rats by increasing the expression of Smad7.METHODSThe diabetic rat model was established by tail-vein injection of streptozotocin. Sixteen rats were divided into 2 groups. Eight of these animals in diabetes mellitus (DM) group had no treatment. The remaining eight of them in insulin treatment (INS) group were injected with insulin. After 13 weeks, the rats in INS group were given individual treatment with insulin to let the blood glucose level keep within 4 to 7 mmol/L. Meanwhile, 8 rats were used for normal control (NC group). After 16 weeks, the rats were sacrificed to detect the relevant biochemical parameters, and to observe the histophathological changes of the kidney and pancreas. In addition, immunohistochemical staining and Western blotting were employed to detect the protein expression of transforming growth factor β1(TGF-β1), Smad ubiquitin regulatory factor 2 (Smurf2), Smad7, E-cadherin, α-sooth muscle actin (α-SMA), fibronectin (FN) and collagen I.RESULTSCompared with NC group, the body weight was significantly reduced in DM group, whereas the body weight in INS group increased gradually. Compared with NC group, the levels of 24 h urine protein (24 h UP), BG and triglyceride (TG) were remarkably increased in DM group. Pathological detection on pancreas indicated that the islet was destroyed. The levels of TGF-β1, Smurf2, α-SMA, FN and collagenⅠ in the kidneys were increased in DM group, and the expression of Smad7 and E-cadherin, which were mainly located in renal tubular epithelial cells, was significantly reduced. Compared with DM group, the levels of 24 h UP and BG were significantly reduced in INS group, and the alleviated renal fibrosis was observed under light microscope. In addition, the protein levels of TGF-β1, Smurf2, α-SMA, FN and collagenⅠ in INS group were decreased compared with DM group, and the expression of Smad7 and E-cadherin was increased significantly.CONCLUSIONTarget glucose control with insulin treatment restores the protein expression of Smad7 in the kidney of diabetic rats, reduces the accumulation of extracellular matrix and slows down DN progress. The decrease in TGF-β1and Smurf2 expression, and the attenuation of Smad7 ubiquitination in renal tissues are the crucial parts in this process.

Diabetic nephropathies; Transforming growth factor beta; Smad7; Insulin

R363.2+1

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2013.01.007

1000- 4718(2013)01- 0043- 07

2012-09-02

2012-10-14

國家自然科學基金資助項目(No.81160094)；貴州省優秀科技教育人才省長專項基金資助項目(No.黔省專合字 [2010]40號)

△通訊作者 Tel: 0851-6908348; E-mail: guobingbs@126.com