跨種屬研究Smad3在肝癌組織中的表達及意義*

朱伶群， 曹 驥， 盧曉旭， 李 瑗， 歐 超， 蘇建家， 楊 春△

( 1廣西壯族自治區腫瘤防治研究所實驗研究部， 2廣西醫科大學研究生學院，廣西 南寧 530021)

跨種屬研究Smad3在肝癌組織中的表達及意義*

朱伶群1,2， 曹 驥1， 盧曉旭1,2， 李 瑗1， 歐 超1， 蘇建家1， 楊 春1△

(1廣西壯族自治區腫瘤防治研究所實驗研究部，2廣西醫科大學研究生學院，廣西 南寧 530021)

目的研究Smad3在人、大鼠、樹鼩等不同種屬的肝癌、癌旁及正常肝組織中的表達和意義，進一步驗證跨種屬篩選肝癌關鍵蛋白研究策略的可行性。方法采用實時熒光定量PCR和Western blotting技術分別檢測人、大鼠和樹鼩的肝癌及其相應癌旁組織以及正常肝組織中Smad3 mRNA和蛋白表達水平。結果Smad3 mRNA在人、大鼠和樹鼩的肝癌中表達水平均低于其相應的癌旁組織(均P<0.05)；在大鼠肝癌組織中的表達低于正常肝組織(P<0.05)；在樹鼩癌旁組織中的表達高于正常肝組織(P<0.05)；其余各組織間mRNA表達水平的差別無統計學意義(均P>0.05)。Smad3蛋白在人和大鼠的肝癌組織中的表達水平均低于其相應的癌旁組織及正常肝組織(均P<0.05)；在樹鼩肝癌組織中的表達水平也低于相應的癌旁組織和正常肝組織，但差別無統計學意義(均P>0.05)；3個種屬的癌旁組織與正常肝組織比較，差別無統計學意義(均P>0.05)。結論Smad3在人、大鼠和樹鼩3個種屬的肝癌組織中的mRNA和蛋白表達水平均下調，提示該蛋白表達水平的改變可能在肝癌發生發展中起重要作用，有可能成為防治肝癌的靶分子。

跨種屬； Smad3蛋白； 肝腫瘤

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，以下簡稱肝癌)是全世界和我國最常見的惡性腫瘤之一，位于世界癌癥死亡率的第3位，而全球55%以上的肝癌患者發生在我國[1]。目前已有大量基因被報道與肝癌的發生發展密切相關，卻罕有一致認可者。基于在多個種屬中共同表達的基因可能擁有更重要的保守功能這一認識，近年來國內外已將跨種屬篩選腫瘤關鍵分子的策略應用于多種腫瘤的研究，結果表明，在人和動物的腫瘤發生發展過程中保守存在的共同改變基因，可能是誘發或促進腫瘤的關鍵分子[2]。我們前期通過基因組富集以及Meta分析的方法，從5套不同種屬的肝癌基因表達芯片中篩選出轉錄水平發生改變的基因，Smad3即為其中之一[3]。Smad3是轉化生長因子β(transforming growth factor beta，TGF-β)通路中關鍵的調節信號分子之一，與腫瘤的發生發展及細胞增殖和凋亡的調控密切相關，可能對肝癌起著腫瘤抑制因子的作用[4-5]。目前國內外鮮有應用跨種屬腫瘤基因篩選策略研究Smad3與肝癌關系的報道，Smad3基因是否為肝癌發生過程中的關鍵分子還有待進一步探討。因此，本實驗采用實時熒光定量PCR和Western blotting技術檢測Smad3在人、大鼠和樹鼩3個種屬的肝癌、癌旁及正常肝組織中的表達, 以研究其在肝癌發生發展中的可能作用及意義。

材 料 和 方 法

1材料

1.1人肝及肝癌組織標本 收集廣西醫科大學附屬腫瘤醫院2009年1月～2011年12月手術切除并經病理證實的50例肝癌及對應癌旁組織(距離腫瘤邊緣2 cm以外)和7例正常肝組織，正常肝組織來源于肝良性占位病變經手術切除者，組織于手術取下后先經液氮速凍再移至-80 ℃冰箱保存備用，肝癌病人術前均無放療化療史，患者年齡為24～70歲，中位年齡47.5歲。

1.2大鼠和樹鼩肝及肝癌組織標本 大鼠肝癌及其相應癌旁組織(距離腫瘤邊緣0.5 cm以外，肉眼觀無特殊病變)15例,正常肝組織14例，樹鼩肝癌及其相應癌旁組織(距離腫瘤邊緣0.5 cm以外，肉眼觀無特殊病變)10例,正常肝組織10例,均為本課題組前期項目[6-7]所保存。所有組織均為手術切除后先經液氮速凍然后轉移到-80 ℃。

以上各組織類型標本均經病理組織學檢查證實，見圖1～3，各例人和動物的組織標本均作Smad3 mRNA表達水平的檢測；其中人17例肝癌及其相應癌旁組織和5例正常肝組織、大鼠12例肝癌及其相應癌旁組織和3例正常肝組織、樹鼩4例肝癌及其相應癌旁組織和3例正常肝組織作Smad3蛋白表達水平的檢測。

Figure 1. The histopathological changes of HCC tissues (A),peritumoral tissues (B) and normal liver tissues (C) in human (HE staining,×400).

圖1人肝癌、癌旁及正常肝組織的病理組織學改變

Figure 2. The histopathological changes of HCC tissuses (A),peritumoral tissues (B) and normal liver tissues (C) in rats (HE staining,×400).

圖2大鼠肝癌、癌旁及正常肝組織的病理組織學改變

Figure 3. The histopathological changes of HCC tissuses (A),peritumoral tissues (B) and normal liver tissues (B) in tree shrews (HE staining,×400).

圖3樹鼩肝癌、癌旁及正常肝組織的病理組織學改變

1.3主要試劑與儀器 RNA提取試劑Trizol購自Invitrogen，逆轉錄試劑盒購自Fermentas，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。熒光定量試劑盒為TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司的SYBR? Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time) 試劑盒。Ⅰ 抗采用兔抗Smad3多克隆抗體購自Abcam，鼠抗GAPDH單克隆抗體購自北京中杉金橋公司，均適用于人和大鼠。Dylight680熒光標記的羊抗兔和羊抗鼠Ⅱ抗購自KPL。實時熒光定量PCR儀為ABI生產的ABI StepOneTM，紅外熒光成像儀Odyssey為LI-COR產品。

2方法

2.1實時熒光定量PCR法檢測組織中Smad3 mRNA表達 采用Trizol試劑提取組織總RNA；經微量核酸測定儀檢測，A260/A280值在1.8～2.0之間為合格；以1.0%瓊脂糖電泳和凝膠成像系統檢測所提取的總RNA的完整性；取檢驗合格的RNA，按Fermentas公司逆轉錄試劑盒說明書進行cDNA合成，產物于-20 ℃保存。應用Primer Premier 5.0和DNAMAN軟件在Smad3和GAPDH的高度保守序列區進行引物設計。Smad3上、下游引物序列分別為5’-TGCGAGAAGGCGGTCAAG-3’和5’-CCACAGGCGGCAGTAGAT-3’，產物長度為186 bp；內參照GAPDH上、下游引物序列分別為5’-AAGAAGGTGGTGAAGCAGGC-3’和5’-ACCACCCTGTTGCTGTAGCC-3’， 產物長度為200 bp。

根據試劑盒說明書，采用20 μL反應體系分別以Smad3和GAPDH引物進行擴增。反應體系含：SYBR? Premix Ex Taq (2×)10 μL，PCR Forward Primer(10 μmol/L)0.4 μL，PCR Reverse Primer(10 μmol/L)0.4 μL，ROX Reference Dye(50×)0.4 μL，滅菌去離子水6.8 μL，cDNA模板2 μL。反應條件為：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個反應循環。同時，分別構建Smad3和GAPDH的標準曲線，并設置標準品的梯度稀釋拷貝數。PCR擴增結束后，分析儀即顯示標準曲線、擴增曲線和熔解曲線，根據各自標準曲線計算出待測樣本中初始mRNA相對表達量。計算各組Smad3與對應內參照GAPDH初始相對mRNA表達量的比值，得到肝癌組、癌旁組和正常組數據作為Smad3 mRNA的相對表達量。將PCR擴增產物送北京諾賽基因組研究中心有限公司測序，并將測序結果在NCBI的BLAST中進行比對。

2.2Western blotting檢測組織中Smad3蛋白表達 分別取各例組織樣本50～100 mg常規方法提取總蛋白，加入上樣緩沖液煮沸變性，加樣至SDS-PAGE膠上電泳，轉膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，洗膜；加 Ⅰ 抗(Smad3工作液濃度 1∶500，GAPDH工作液濃度1∶1 000)，過夜孵育，洗膜；加熒光 Ⅱ 抗(工作液濃度1∶7 500)，室溫避光孵育1 h，洗膜；以Odyssey紅外熒光成像儀掃描圖像，讀取灰度值。計算各組Smad3和內參照GAPDH的灰度值比值，得到肝癌組、癌旁組及正常組數據作為Smad3蛋白相對表達量。

3統計學處理

采用SPSS 13.0統計軟件對數據進行分析處理；各組計量資料數據用均數±標準差(mean±SD)表示；多組間均數的比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1總RNA質量及基因測序

所有樣本總RNA的A260/A280比值在1.8～2.0之間，瓊脂糖凝膠電泳后成像顯示28S、18S和5S條帶清晰。測序所得序列經BLAST比對，顯示各序列的同源性均在98%以上，即擴增產物序列與設計序列基本一致。

2實時熒光定量PCR反應

如圖4所示，Smad3和 GAPDH的標準曲線直線相關系數分別為r=0.991和r=0.993，斜率(slope)分別為-3.856和-3.69。擴增曲線均呈S型，有明顯的指數擴增期和平臺期，曲線走行光滑，顯示擴增結果理想,見圖5。熔解曲線峰形窄而尖，峰單一無雜峰，見圖6。

3Smad3mRNA在人、大鼠和樹鼩肝癌、癌旁和正常肝組織中的表達水平

實時熒光定量PCR結果顯示，人肝癌組織Smad3 mRNA的表達量低于癌旁肝組織，差別有統計學意義(P<0.05)，肝癌組織Smad3 mRNA的表達量也低于正常肝組織，但差別無統計學意義(P>0.05)；癌旁肝組織與與正常肝組織比較，差別無統計學意義(P>0.05)。大鼠肝癌組織Smad3 mRNA的表達量低于癌旁肝組織和正常肝組織，差別有統計學意義(P<0.05)；癌旁肝組織與正常肝組織比較，癌旁肝組織Smad3 mRNA的表達量低于正常肝組織，差別無統計學意義(P>0.05)。樹鼩肝癌組織及正常肝組織Smad3 mRNA的表達量均低于癌旁肝組織，差別有統計學意義(P<0.05)；肝癌組織與正常肝組織比較，差別無統計學意義(P>0.05),見圖7。

4Smad3蛋白在人、大鼠和樹鼩肝癌、癌旁和正常肝組織中的表達水平

Western blotting結果顯示，在人、大鼠和樹鼩的肝癌組織中，Smad3蛋白的條帶明顯弱于癌旁及正常肝組織，而癌旁和正常肝組織比較則差異不明顯，見圖8～10。統計分析結果見圖11，即人和大鼠肝癌組織Smad3蛋白的表達水平均顯著低于癌旁肝組織和正常肝組織(P<0.05)；樹鼩肝癌組織Smad3蛋白的表達低于癌旁和正常肝組織，但是差別無統計學意義(P>0.05)；人、大鼠和樹鼩3個種屬癌旁組織的Smad3蛋白表達水平與正常肝組織比較，差別無統計學意義(P>0.05)。

Figure 4. Real-time fluorescent quantitative PCR (RFQ-PCR) standard curves of Smad3 (A) and GAPDH (B).

圖4Smad3和GAPDH實時熒光定量PCR標準曲線圖

Figure 5. RFQ-PCR amplification plot of Smad3 (A) and GAPDH (B).

圖5Smad3和GAPDH實時熒光定量-PCR擴增曲線圖

Figure 6. RFQ-PCR melting curves of Smad3 (A) and GAPDH (B).

圖6Smad3和GAPDH實時熒光定量PCR熔解曲線圖

Figure 7. Expression of Smad3 mRNA in HCC tissues，peritumoral tissues and normal liver tissues of human, rat and tree shrew.Mean±SD.*P<0.05vsHCC tissues.

圖7Smad3mRNA在人、大鼠和樹鼩肝癌、癌旁和正常肝組織中的表達

Figure 8. Western blotting analysis of Smad3 protein levels in human HCC tissues (lane 1,3) peritumoral tissues (lane 2,4) and normal liver tissues (lane 5,6).GAPDH served as an internal control.

圖8Westernblotting檢測Smad3蛋白在人肝癌、癌旁和正常肝組織中的表達

Figure 9. Western blotting analysis of Smad3 protein levels in rat HCC tissues (lane 1, 3). peritumoral tissues (lane 2,4) and normal liver tissues (lane 5,6) GAPDH served as an internal control.

圖9Westernblotting檢測Smad3蛋白在大鼠肝癌、癌旁和正常肝組織中的表達

Figure 10. Western blotting analysis of Smad3 protein levels in tree shrew HCC tissues (lane 1,3).peritumoral tissues (lane 2,4) and normal liver tissues (lane 5,6).GAPDH served as an internal control.

圖10Westernblotting檢測Smad3蛋白在樹鼩肝癌、癌旁和正常肝組織中的表達

Figure 11. Expression of Smad3 protein in HCC tissues, peritumoral tissues and normal liver tissues of human, rat and tree shrew.Mean±SD.*P<0.05vsHCC tissues.

圖11Smad3蛋白在人、大鼠和樹鼩肝癌、癌旁和正常肝組織中的表達

討 論

近年提出的跨種屬腫瘤基因組學策略(cross-species oncogenomics approach)被認為是鑒定腫瘤基因的有力工具之一[8]。Colak等[9]通過基因芯片對人和大鼠早期肝癌進行分析，篩選出包括Smad3等在內的數個跨種屬保守基因，認為其與早期肝癌的惡性轉化密切相關，但未做進一步驗證。我們也在前期研究中應用生物信息學等技術，跨種屬地篩選出Smad3等一組肝癌差異表達基因。為進一步驗證Smad3在多個種屬的肝癌發生發展中表達水平的改變及研究其意義，本研究對人、大鼠、樹鼩3個種屬的肝癌、癌旁肝組織及正常肝組織，應用實時熒光定量PCR和Western blotting方法分別檢測Smad3 mRNA及蛋白的表達情況。結果顯示，在轉錄水平上，3個種屬肝癌組織的Smad3 mRNA表達水平均明顯低于同一個體的癌旁肝組織；但將各種屬的正常肝組織與肝癌、癌旁組織作比較，結果各不相同——我們推測此現象可能與種屬特異性相關。在翻譯水平上，3個種屬肝癌Smad3蛋白表達水平均低于癌旁組織和正常肝組織，但樹鼩各組蛋白水平相比較，差別無統計學意義，這可能與所用例數較少有關。此外，我們發現Smad3轉錄水平與翻譯水平并非完全一致，其原因可能為：mRNA翻譯為蛋白的過程中可能存在轉錄后調控等情況，導致兩者表達水平不一致。蛋白作為基因功能的執行者，在生物功能中起著主要作用，且蛋白表達水平相對穩定，因此我們認為Smad3蛋白在3個種屬的肝癌中相對于癌旁和正常肝組織均呈現低表達，提示Smad3基因在肝癌發生發展過程中可能發揮著關鍵分子的作用。

TGF-β通路作為人類疾病過程中最常發生改變的信號通路之一，與包括肝癌在內的多種腫瘤的發生發展密切相關[10]。Smads蛋白是目前所知最重要的細胞內TGF-β受體激酶底物, 可將TGF-β 信號直接由細胞外轉導入細胞核。研究表明，TGF-β通路的生物學功能主要通過其下游的信號分子Smads進行調節[11]。Smad3作為Smads家族重要成員之一，在TGF-β介導的細胞增殖、分化、凋亡以及腫瘤發生發展和轉移的過程中均起著至關重要的作用[4]。而在參與腫瘤發生發展的過程中，Smad3突變極為少見，主要表現為表達水平的改變[12]。目前已有大量研究證實Smad3在食管鱗狀細胞癌、胃癌、結直腸癌等多種惡性腫瘤中均呈現低表達[13-14]，本實驗結果也表明Smad3在人、大鼠和樹鼩多種屬的肝癌中呈低表達，提示Smad3表達水平降低或缺失可能與惡性腫瘤發生發展密切相關。目前，TGF-β通路的抑癌作用已被廣泛認可，Smad3作為TGF-β信號通路的下游介質，它的丟失將可能導致TGF-β信號通路抑癌作用減弱或消失。近年研究發現，Smad3過表達可抑制腫瘤細胞的增殖、促進細胞凋亡[15]。因此，Smad3常被看作抑癌基因參與腫瘤調控。目前Smad3與肝癌關系的研究較少，其具體抑癌機制尚不明確。Yang等[15]通過轉基因技術發現過表達Smad3能降低肝臟對化學誘癌的敏感性，同時可抑制Bcl-2的轉錄，從而誘導肝癌細胞凋亡；他們還發現Smad3高表達對正常肝組織功能無影響，但在腫瘤形成之初高表達的Smad3即開始發揮著腫瘤抑制因子的作用，認為Smad3在肝癌治療方面擁有廣闊的前景。此外，Kim等[16]通過免疫組化對肝癌病人Smad3水平進行了檢測, 其生存率分析結果表明，Smad3在細胞質中表達陽性者，其無復發存活率和疾病相關存活率均較低，而其在細胞核中的表達與生存率無關，認為Smad3可作為判斷肝癌術后復發及預后的一個重要標志物，對術后治療有重要的指導意義。

總之，本研究驗證了經跨種屬策略篩選出的Smad3在人、大鼠和樹鼩3個種屬的肝癌組織中的mRNA和蛋白表達水平均呈現下調，這一結果一方面提示Smad3與肝癌的發生發展密切相關,可能為肝癌發生發展過程中的關鍵分子之一，另一方面還提示 Smad3可能發揮著抑癌基因的作用，但其具體機制仍有待進一步探討。同時，本研究結果也證實了跨種屬研究腫瘤相關基因的可行性。下一步，我們將通過體外及體內實驗進一步觀察Smad3對肝癌細胞生物學行為及肝癌發生發展過程的影響，其中包括：(1)通過肝癌細胞體外實驗觀察Smad3過表達對肝癌細胞增殖及凋亡等生物學行為的影響，并應用Western blotting及RT-PCR等技術進一步明確Smad3與主要周期、凋亡相關基因的關系；(2)通過裸鼠人肝癌移植瘤實驗進一步觀察Smad3過表達對移植瘤生長和轉移的影響，從而深入探討Smad3作為防治肝癌靶點的可能性。

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Cross-speciescomparisonofSmad3expressioninhepatocellularcarcinomatissues

ZHU Ling-qun1, 2, CAO Ji1, LU Xiao-xu1,2, LI Yuan1, OU Chao1, SU Jian-jia1, YANG Chun1

(1ResearchDepartmentofGuangxiCancerInstitute,2GraduateSchool,GuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China.E-mail:cxl_yang@yahoo.com.cn)

AIM: To study the expression of Smad3 and its significance in hepatocellular carcinoma (HCC) in different species including human, rat and tree shrew, and to verify the feasibility of cross-species oncogenomic approach.METHODSReal-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction and Western blotting were applied to detect the expression of Smad3 at mRNA and protein levels in HCC tissues, corresponding HCC adjacent liver tissues and normal liver tissues collected from different species including human, rat and tree shrew.RESULTSThe mRNA expression of Smad3 in HCC tissues of human, rat and tree shrew was lower than those in the corresponding HCC tissues adjacent liver tissues. The mRNA level of Smad3 in HCC tissues of rat was lower than those in its normal liver tissues, while that in HCC adjacent tissues of tree shrew appeared higher than those in the normal liver tissues. No significant difference of Smad3 expression in other tissues was observed. The protein levels of Smad3 in HCC of human and rat were lower than those in the corresponding HCC adjacent liver tissues and the normal liver tissues. However, the protein expression of Smad3 was at a low level in HCC tissues of tree shrew and was lower than that in the HCC adjacent liver tissues and the normal liver tissues, although without statistical difference. The differences of Smad3 expression between HCC adjacent liver tissues and normal liver tissues in all the 3 species were not statistically significant.CONCLUSIONSmad3 is lowly expressed in HCC tissues of different species, suggesting that it might play a pivotal role in hepatocarcinogenesis and be applied as a key molecular target in HCC prevention and treatment.

Cross-species; Smad3 protein; Liver neoplasms

R735.7

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.01.011

1000- 4718(2013)01- 0070- 06

2012- 08- 28

2012- 11- 21

國家自然科學基金資助項目(No.30960428)；廣西自然科學基金資助項目(No.2012GXNSFAA053167)

△通訊作者 Tel:0771-5310593; E-mail: cxl_yang@yahoo.com.cn