SMYD3過表達對人肝內膽管癌細胞miR-124表達及細胞增殖的影響*

鄭禮平， 李志花△， 陳汝福， 曾 兵， 周嘉嘉， 龔遠鋒， 宋亞東

(中山大學孫逸仙紀念醫院 1腫瘤科， 2肝膽外科，廣東 廣州 510120)

SMYD3過表達對人肝內膽管癌細胞miR-124表達及細胞增殖的影響*

鄭禮平1， 李志花1△， 陳汝福2， 曾 兵2， 周嘉嘉2， 龔遠鋒2， 宋亞東1

(中山大學孫逸仙紀念醫院1腫瘤科，2肝膽外科，廣東 廣州 510120)

目的探討肝內膽管癌細胞HCCC-9810中SET和MYND結構域含有蛋白3(SET and MYND domain-containing protein 3，SMYD3)過表達對miR-124表達及細胞增殖能力的影響。方法瞬時轉染 SMYD3 真核表達質粒后， Western blotting 檢測細胞中SMYD3 蛋白水平的變化；qRT-PCR 檢測細胞中SMYD3 mRNA 和miR-124 表達；甲基化特異性PCR檢測miR-124-1、miR-124-2和miR-124-3基因啟動子甲基化水平；CCK-8 和平板克隆形成實驗檢測細胞增殖能力。結果以空白組為對照，肝內膽管癌細胞HCCC-9810在轉染pEGFP-SMYD3質粒后，SMYD3蛋白及 mRNA 表達均顯著上升(P<0.05)，miR-124-1、miR-124-2和miR-124-3基因啟動子甲基化顯著增加(P<0.05),miR-124表達明顯下降(P<0.05),細胞增殖能力顯著提高(P<0.05)。結論過表達 SMYD3可引起miR-124基因啟動子甲基化增加，導致膽管癌細胞中miR-124 的表達下降，同時過表達SMYD3可增強細胞增殖能力。

HCCC-9810細胞； SET和MYND結構域含有蛋白3； miR-124； 甲基化特異性PCR； 細胞增殖

SET及MYND結構域含有蛋白3(SET and MYND domain-containing protein 3, SMYD3)包含SET和MYND兩個鋅指型功能結構域。SET結構域具有組蛋白甲基轉移酶功能，而MYND結構域則與基因啟動子區域的特定序列結合，從而使靶基因發生甲基化，進而影響靶基因的轉錄，促進腫瘤細胞生長、侵襲和遷移等[1-2]。miR-124在多種腫瘤組織和細胞中表達下調，并受DNA甲基化調控[3-4]。本課題組前期研究發現在膽管癌細胞中轉染丙型肝炎病毒核心蛋白(hepatitis C virus core protein，HCV C)可引起miR-124表達下調[5]，同時可上調SMYD3的表達[6]。本研究通過上調膽管癌細胞SMYD3的表達，探討HCV C調控miR-124表達的潛在機制，以進一步闡明丙型肝炎病毒的致癌機制。

材 料 和 方 法

1材料

人肝內膽管癌細胞株HCCC-9810購自中國科學院上海細胞庫，RPMI-1640培養基及胰蛋白酶購自Gibco；SMYD3兔抗人單克隆抗體購自Santa Cruz；RNA提取試劑Trizol、DNA提取試劑(PureLinkTMGenomic DNA Kits)和脂質體(lipofectamineTM2000)均購自Invitrogen；qRT-PCR試劑盒購自TaKaRa。SMYD3真核表達質粒pEGFP-SMYD3由本課題組構建[7]，無內毒素質粒提取試劑盒購自廣州津美公司，重亞硫酸鹽轉化DNA甲基化檢測試劑盒(MethylDetectorTMBisulfite Modification Kit)購自Invitrogen；96孔板購自Corning; CCK-8試劑購自日本同仁化學研究所。

2主要方法

2.1細胞培養和瞬時轉染 HCCC-9810細胞培養于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中，置于37 ℃、5% CO2和相對濕度95%的恒溫培養箱中培養。1～2 d換液，當細胞生長接近90%融合時，用質量濃度0.25%胰酶消化細胞，以1∶2或1∶3比例傳代。將5×105個RBE細胞重懸于2 mL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中，轉種于6孔培養板中；37 ℃、5%CO2培養箱中培養24 h，待細胞融合達80%～90%時開始轉染。轉染前2 h更換不含血清的新鮮培養基。實驗分組：A組:處理組，轉染質粒pEGFP-SMYD3(以下簡稱SMYD3質粒組)；B組:僅轉染空載體pEGFP(以下簡稱空載體組)；C組:空白組，僅以無血清培養基培養。按LipofectamineTM2000轉染試劑盒說明書進行細胞轉染，24～48 h后收集細胞進行轉染后檢測。如接種在96孔板中，按說明書相應地調整細胞數及轉染試劑量。

2.2qRT-PCR檢測SMYD3 mRNA及miR-124表達 轉染24 h后，Trizol法提取各組細胞的總RNA，用紫外分光光度計檢測提取RNA的濃度及純度，并確定RNA的純度在1.8～2.0之間。按qRT-PCR試劑盒操作說明書合成cDNA。 SMYD3 mRNA檢測所用的引物序列依據GenBank中NM_022743序列設計。SMYD3(106 bp)上游引物5’-GGCAGAGAACACAGCCTGAT-3’,下游引物5’-ACACGCCGTATTTCCCTCT-3’；β-actin (186 bp)上游引物5’-AAGATGACCCAGATCATGTTTGAG-3’，下游引物5’-GCAGCTCGTAGCTCTTCTCCAG-3’。PCR反應參數為：95 ℃ 30 s, 95 ℃ 5 s及60 ℃ 20 s，共40個循環。 miR-124的熒光定量檢測試劑盒購自廣州銳博公司，U6為內參照。PCR反應條件：95 ℃ 20 s,95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，70 ℃ 10 s，40個循環。所有標本均重復檢測3次，計算出Ct值，采用2-ΔΔCt法進行計算分析。

2.3Western blotting測定SMYD3蛋白的表達 瞬時轉染48 h后，按說明書提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。配制10%SDS-PAGE凝膠電泳，各上樣孔加入25 μg蛋白樣品，電泳后轉印至硝酸纖維素膜(PVDF)膜上。PVDF膜以50 g/L脫脂奶粉封閉2 h，加入SMYD3兔抗人單克隆Ⅰ抗(1∶1 000)于4 ℃孵育過夜。經TBST漂洗3次后，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔Ⅱ抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h，TBST漂洗3次，ECL化學發光法試劑盒顯影、曝光。經Bio-Rad公司的圖形分析軟件Quantity One對圖片進行分析并測定灰度值。取SMYD3/GAPDH的灰度值之比作為蛋白的相對表達量。

2.4甲基化特異性PCR測定miR-124基因啟動子甲基化水平 瞬時轉染24 h后，按說明書提取各組DNA。按MethylDetectorTMBisulfite Modification Kit試劑盒操作說明書進行甲基化特異性PCR反應。引物序列參照相關文獻[8]。miR-124-1(U)上游引物5’- AATAAAGAGTTTTTGGAAGATGTT -3’,下游引物5’- AAAAAAATAAAAAACAACACATATAC -3’；miR-124-1(M)上游引物5’- AAAGAGTTTTTGGAAGACGTC -3’，下游引物5’- AATAAAAAACGACGCGTATA -3’。miR-124-2(U)上游引物5’- GGGGTAATTAATTTGGATTTATGTT -3’，下游引物5’- AAAACCACTATTAATTAATCTATTCCA -3’ ；miR-124-2(M)上游引物5’- GGGTAATTAATTTGGATTTACGTC -3’,下游引物5’- ACCGCTATTAATTAATCTATTCCG -3’。miR-124-3(U)上游引物5’- GGGTGAGGATTTTATGTAAGTTT -3’,下游引物5’- TTCACCACATACCTTAATTATATAAAC -3’；miR-124-3(M)上游引物5’- GCGAGGATTTTACGTAAGTTC-3’,下游引物5’- CCGCGTACCTTAATTATATAA -3’。甲基化特異性PCR條件為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，退火30 s(miR-124-1退火溫度58 ℃，miR-124-2及miR-124-3的退火溫度為55 ℃)，72 ℃延伸30 s，共35個循環；最后72 ℃ 10 min。PCR產物經2.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，于凝膠成像系統拍攝并分析結果。

2.5CCK-8法檢測細胞增殖情況 取處于對數期生長的HCCC-9810細胞，接種于96孔板，每孔接種1 000個細胞。培養24 h，約70%～80%融合后，轉染目的質粒。實驗分為SMYD3質粒組、空載體組和空白對照組。分別在轉染10 h、15 h、20 h、25 h、30 h、35 h和40 h后，更換為不含血清的新鮮培養基，并向每孔加入10 μL CCK-8試劑。置于37 ℃孵育2 h，用酶標儀測定450 nm的吸光值，每個時點每組設5個復孔。

2.6平板克隆形成實驗 將3×108/L HCCC-9810細胞接種于6 孔板內，恒溫培養箱培養24 h后，按LipofectamineTM2000說明書進行質粒轉染。轉染24 h后將細胞用胰酶消化后吹散成單細胞懸液， 取1 000個細胞接種于中皿， 每組設3個重復孔，實驗分為SMYD3質粒組、空載體組和空白對照組。于37 ℃、5% CO2和相對濕度95%的恒溫培養箱中培養7 d。用多聚甲醛固定， 1%結晶紫染色。顯微鏡下計算克隆形成數(含有10 個細胞以上的集落為1個克隆)，克隆形成率(%)=克隆形成數/接種細胞數×100%。

3統計學處理

結 果

1轉染后SMYD3mRNA及蛋白表達

qRT-PCR檢測顯示，轉染SMYD3質粒組的SMYD3 mRNA 表達水平均較空白組明顯升高，比值為5.146±0.124，差異有統計學意義(P<0.05)；而轉染空載體組與空白組相比SMYD3 mRNA表達水平則無明顯差異，比值為1.213±0.087(P>0.05),見圖1。Western blotting 結果顯示：轉染SMYD3質粒組的 SMYD3蛋白表達水平較空白組明顯升高，灰度比值為2.832±0.132，差異有統計學意義(P<0.05)；而轉染空載體組與空白組的 SMYD3蛋白表達水平則無明顯差異，灰度比值為1.115±0.069(P>0.05),見圖2。

圖1HCCC-9810細胞SMYD3mRNA的表達

圖2HCCC-9810細胞SMYD3蛋白的表達

2甲基化特異性PCR結果

甲基化特異性PCR結果顯示,SMYD3質粒組miR-124-1、miR-124-2和miR-124-3基因啟動子甲基化水平顯著上調，比值分別為3.524±0.105、3.002±0.099和2.892±0.087，差異有統計學意義(P<0.05)；而空載體組與空白組相比，三者表達水平則無明顯差異(比值分別為1.106±0.033、1.098±0.053和0.998±0.047)，見圖3。

Figure 3. Methylation ofmiR-124 gene in HCCC-9810 cells. U: unmethylated; M: methylated. 1: blank group; 2: empty plasmid group; 3: SMYD3 plasmid group.

圖3HCCC-9810細胞miR-124基因的甲基化

3SMYD3對miR-124表達的影響

qRT-PCR檢測顯示，轉染SMYD3質粒組的miR-124表達水平均較空白組明顯下降，比值為0.345±0.014，差異有統計學意義(P<0.05)；而轉染空載體組與空白組miR-124表達水平則無明顯差異，比值為0.976±0.025(P>0.05),見圖4。

圖4HCCC-9810細胞miR-124的表達

4SMYD3對細胞生長曲線的影響

CCK-8實驗結果顯示：轉染SMYD3質粒組細胞在25 h～40 h，吸光度值顯著高于空白組細胞，差異有統計學意義(P<0.05)；而轉染空載體的細胞與空白組細胞相比無顯著差異(P>0.05),見圖5。

5平板克隆實驗

各組克隆形成率：SMYD3質粒組為48.3%±3.3%，空載體組為16.5%±2.1%，空白組為18.3%±2.4%。SMYD3質粒組細胞增殖能力顯著強于空白組細胞，差異有統計學意義(P<0.05)；而空載體組細胞與空白組無明顯差異(P>0.05),見圖6。

圖5HCCC-9810細胞增殖曲線

圖6HCCC-9810細胞的克隆形成率

討 論

MicroRNA (miRNA) 是生物體內長度約為 21～23個核苷酸的非編碼小 RNA, 廣泛存在于各種動植物中。miRNA 與相關蛋白形成 RNA 誘導沉默復合體，結合靶基因mRNA，通過抑制蛋白質的翻譯下調特異性基因的表達[9]。miRNA能控制細胞的生長、分化和凋亡，在腫瘤發生、發展過程中起著非常關鍵的作用，已成為腫瘤細胞與分子生物學研究領域中最受關注的生物分子之一[9-10]。在腫瘤發生發展過程中存在著miRNA的異常表達。miRNA 基因啟動子區域CpG島發生異常甲基化可以導致某些關鍵 miRNA 表達紊亂[11]。

miR-124在多種腫瘤組織和細胞中表達下調，包括肝癌、髓母細胞瘤、口腔鱗癌等，miR-124在其中發揮抑制腫瘤細胞生長、降低腫瘤侵襲性的作用[3-5]。成熟的miR-124由3種前體加工而成，miR-124-1(位于染色體8p23.1)、miR-124-2(位于染色體8q12.3)和miR-124-3(位于染色體20q13.33)。SMYD3在肝癌、膽管癌、乳腺癌、宮頸癌等中表達增高，促進腫瘤細胞生長、增殖和侵襲[ 1-2,6,12]。本課題組前期研究發現在膽管癌細胞中SMYD3的表達受miR-124的調控[5-6]，且SMYD3可以引起抑癌基因RASSF1A啟動子的甲基化，使RASSF1A表達下降，上調SMYD3可以引起DNA甲基化轉移酶3B表達升高，促進膽管癌細胞增殖[6,13]。因此，我們推測，SMYD3和miR-124之間可能存在一個負反饋調控的關系：即miR-124在調控SMYD3表達的同時，反過來又受到SMYD3的調控。

本研究中，HCCC-9810細胞在轉染SMYD3 質粒后，SMYD3 mRNA及蛋白表達均明顯上升，而轉染空載體組變化不明顯，表明轉染是成功的。過表達SMDY3能夠顯著上調miR-124-1、miR-124-2和miR-124-3基因啟動子甲基化水平，miR-124表達亦明顯降低，提示SMYD3可以通過誘導miR-124基因啟動子區CpG島甲基化而下調miR-124的表達。本研究提示，在HCV相關膽管癌中，可能存在一個由HCV C誘導形成的SMYD3-miR-124的負反饋通路，有待進一步研究證實。

SMYD3可直接或間接影響細胞中原癌基因蛋白(c-Met、JunD、Wnt10B等)、細胞周期調節蛋白(CDK2、DNA拓撲異構酶Ⅱβ等)、信號轉導相關蛋白(RAB40C、GNRF2等)的表達量，促進細胞增殖[14-15]。本研究中，CCK-8及平板克隆增殖結果均提示SMYD3可促進膽管癌細胞增殖，與相關研究結果一致。

綜上所述，SMYD3可引起組蛋白的甲基化修飾導致DNA甲基化酶的表達上調，進而誘導miR-124基因啟動子甲基化來調控miR-124的表達。此外，過表達SMYD3可以促進膽管癌細胞增殖。本研究揭示了膽管癌中miR-124表達調控的新機制，有望為膽管癌的臨床研究提供潛在可行的治療靶點。

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EffectofSMYD3over-expressiononmiR-124expressionandproliferationabilityinhumanintrahepaticcholangiocarcinomacells

ZHENG Li-ping1, LI Zhi-hua1, CHEN Ru-fu2, ZENG Bing2, ZHOU Jia-jia2,GONG Yuan-feng2, SONG Ya-dong1

(1DepartmentofOncology,2DepartmentofHepatobiliarySurgery,SunYat-senMemorialHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510120,China.E-mail:lzhzsdxsyx@126.com)

AIM: To explore the effect of SET and MYND domain-containing protein 3 (SMYD3) over-expression on miR-124 expression and proliferation ability of human intrahepatic cholangiocarcinoma cells.METHODSTransient transfection of SMYD3 eukaryotic expression plasmid into human intrahepatic cholangiocarcinoma cell line HCCC-9810 were performed. The expression of SMYD3 at mRNA and protein levels was measured by qRT-PCR and Western blotting, respectively. The expression ofmiR-124 was detected by qRT-PCR, and the methylation status ofmiR-124 gene was determined by methylation-specific PCR. Cell proliferation was examined by CCK-8 assay and colony formation experiment.RESULTSAfter transfected with SMYD3 eukaryotic expression plasmid, the over-expression of SMYD3 in HCCC-9810 cells was observed. Compared with the blank cells, the expression level of miR-124 was significantly decreased andmiR-124 gene promoter methylation was significantly increased. In addition, SMYD3 over-expression significantly promoted the proliferation of HCCC-9810 cells.CONCLUSIONThe transient transfection of SMYD3 plasmid increases the methylation ofmiR-124 gene promoter and induces under-expression of miR-124. Over-expression of SMYD3 promotes the proliferation of cholangiocarcinoma cells.

HCCC-9810 cells; SET and MYND domain-containing protein 3; miR-124; Methylation-specific PCR; Cell proliferation

R735. 8

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2013.01.012

1000-4718(2013)01-0076-05

2012-07-20

2012-10-29

國家自然科學基金資助項目(No. 30872485)

△通訊作者 Tel: 020-81332107; E-mail: lzhzsdxsyx@126.com