人α1-抗胰蛋白酶在胰島β細胞移植中免疫抑制和保護作用的研究*

張曉丹， 葉 劍， 廖玉婷， 齊 暉， 鄧春燕， 李富榮

(暨南大學第二臨床醫學院深圳市人民醫院干細胞與細胞治療重點實驗室，廣東 深圳 518020)

人α1-抗胰蛋白酶在胰島β細胞移植中免疫抑制和保護作用的研究*

張曉丹， 葉 劍， 廖玉婷， 齊 暉， 鄧春燕， 李富榮△

(暨南大學第二臨床醫學院深圳市人民醫院干細胞與細胞治療重點實驗室，廣東 深圳 518020)

目的探討人α1-抗胰蛋白酶(hAAT)蛋白在胰島β細胞移植中的免疫抑制和保護作用。方法構建穩定表達hAAT蛋白的NIT-hAAT細胞系。將NIT-1細胞系和NIT-hAAT細胞系分別2次腹腔注射正常BALB/c小鼠，誘導細胞毒性T淋巴細胞(CTL)產生，將絲裂霉素處理后的2種細胞系與CTL混合培養，流式細胞術檢測NIT-hAAT細胞凋亡情況；ELISA檢測細胞因子表達；實時熒光定量PCR檢測炎癥因子mRNA表達。將2種細胞系分別植入糖尿病模型小鼠左腎包膜內，動態觀察血糖和體重變化、血清中胰島素和C肽水平以及移植部位的病理學變化。結果CTL實驗中，NIT-hAAT細胞受體鼠淋巴細胞的細胞毒作用較NIT-1細胞受體鼠明顯減輕。hAAT具有減輕細胞凋亡、抑制炎癥因子IL-1β、IL-6 mRNA的表達以及調節Th1/Th2細胞因子平衡的作用。NIT-hAAT細胞移植到糖尿病模型小鼠后，血糖明顯下降并維持至28 d，血清中胰島素和C肽含量明顯升高，移植部位炎癥細胞浸潤明顯減輕。結論hAAT蛋白可減輕CTL對β細胞的殺傷作用，抑制炎癥因子的表達，短期內可以抑制移植物免疫排斥反應，對胰島β細胞移植治療糖尿病具有明顯的免疫抑制和保護作用。

α1-抗胰蛋白酶； β細胞； 移植； 免疫抑制； 糖尿病

受移植后炎癥反應介導的移植物破壞與凋亡、免疫抑制劑使用導致胰島β細胞功能損害以及自身免疫作用等多種因素的影響，胰島移植5年后胰島素脫離率只有10%[1-4]。因此，自身免疫和免疫排斥是目前胰島移植需重點解決的問題。

α1-抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin，AAT)是體內重要的絲氨酸蛋白酶抑制劑[5]，近年來研究發現，AAT不但能夠抑制血清中的各種酶，包括中性粒細胞彈性蛋白酶、組織蛋白酶G、蛋白酶3、凝血酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶，還能通過抑制細胞因子、補體活化和免疫細胞滲透發揮抗炎癥反應作用[6]。除了抵抗炎癥作用外，AAT還能顯著地降低細胞因子和鏈脲佐菌素(streptozocin, STZ)對胰島β細胞的凋亡作用[7-8]。另外，AAT治療能夠顯著延長移植的胰島在受體小鼠體內存活時間[9]，并誘導特異性免疫耐受[10]。本研究旨在將人源AAT基因導入小鼠胰島β細胞(NIT-1細胞)，構建穩定表達人AAT蛋白的NIT-1細胞系(NIT-hAAT)，探討人AAT(human AAT,hAAT)對移植的β細胞是否具有免疫抑制和保護作用。

材 料 和 方 法

1材料

穩定表達hAAT基因的pBS-RSV-hAAT質粒由美國華盛頓大學Andre Lieber教授惠贈。真核表達載體pDsRed-N111由北京大學深圳研究生院盧志剛教授惠贈。NIT-1細胞系由中山大學李芳萍教授惠贈。BALB/c小鼠，20周齡，雌雄各半，由廣東省實驗動物中心供給。

2試劑

胎牛血清(Gibco)；DMEM培養基(Sigma)；LipofectamineTM2000(Invitrogen)；G418(Sigma)；小鼠干擾素γ(interferon γ,IFN-γ)和白細胞介素4(interleukin-4,IL-4)ELISA檢測試劑盒(Neobioscience)；總RNA提取試劑盒(Gibco)；RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(MBI)；C-肽水平ELISA檢測試劑盒(Mercodia)。

3方法

3.1NIT-hAAT細胞系的構建和鑒定 將PCR擴增的hAAT基因亞克隆至真核表達載體pDsRed-N111的多克隆位點，構建pDsRed-hAAT質粒。用含10%FCS的DMEM培養基在24孔板中擴增NIT-1細胞系。用LipofectamineTM2000將pDsRed-hAAT轉染至NIT-1細胞，72 h后向培養基中加入G418(350 mg/L)進行篩選，之后用低劑量G418(175 mg/L)對細胞株進行篩選，最終獲得的穩定傳代的細胞株即NIT-hAAT細胞系。取第10代和第40代NIT-hAAT細胞系，Western blotting檢測hAAT蛋白的表達。

3.2CTL實驗 取40只BALB/c小鼠，分別在第1 d腹腔注射5×106個NIT-1或NIT-hAAT細胞后，第10 d重復注射等量同種細胞。另20只BALB/c小鼠腹腔注射生理鹽水，作為空白對照組。第20 d處死各組小鼠，取脾臟研磨，紅細胞裂解液裂解紅細胞，RPMI-1640培養液洗滌2次，經200目尼龍網過濾后，淋巴細胞分離液分離淋巴細胞，調整細胞濃度為1×109/L，備用。

3.3單向混合淋巴細胞增殖實驗 CTL實驗中各組淋巴細胞作為反應細胞。將NIT-1和NIT-hAAT細胞接種于12孔培養板中，待細胞密度生長至5×105左右時，每孔加入1～1.5 mL絲裂霉素(30 g/L)，避光處理30 min，作為刺激細胞，進行混合淋巴細胞反應(mixed lymphocyte reaction，MLR)。反應細胞與刺激細胞之比分別為5∶1、10∶1、20∶1及50∶1，5%CO2、37 ℃培養72 h，加入CCK-8試劑(10 μL/well)，測定450 nm波長的吸光度(A)。依下列公式計算刺激細胞的刺激指數(stimulation index,SI)=(實驗孔A值-空白孔A值)/(陰性對照孔A值-空白孔A值)。每組設置3個復孔，并設置相應的陰性對照及空白對照孔。

3.4炎癥細胞因子檢測 取CTL實驗中各組5×106個淋巴細胞與絲裂霉素處理的NIT-1或NIT-hAAT細胞，按10∶1混合培養7 d后，獲取培養上清，-80 ℃保存待用。小鼠IFN-γ和IL-4 ELISA檢測試劑盒檢測細胞因子含量，450 nm波長測定吸光度，通過標準曲線計算各組細胞因子含量。每個樣品設置3個復孔。

3.5流式細胞術檢測細胞凋亡 CTL實驗中各組5×106個淋巴細胞與絲裂霉素處理的NIT-1或NIT-hAAT細胞，按10∶1混合培養7 d后，棄去懸浮的淋巴細胞，用不含EDTA的胰酶消化并收集NIT-1或NIT-hAAT細胞。調整細胞濃度為1×109/L，取100 μL細胞懸液分別加入5 μL Annexin V-FITC和1 μL PI 混勻，避光孵育30 min，PBS洗滌2次，流式細胞術分析細胞凋亡情況。

3.6實時熒光定量PCR檢測炎癥因子C反應蛋白(C-reactive protein,CRP)、IL-1β和IL-6 mRNA表達 CTL實驗中各組5×106個淋巴細胞與絲裂霉素處理的NIT-1或NIT-hAAT細胞，按10∶1混合培養7 d后，收集淋巴細胞，提取總RNA。逆轉錄反應按Revert-AidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit說明書操作。

熒光定量PCR反應體系50 μL，PCR擴增條件為: 93 ℃ 3 min，93 ℃ 45 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 45 s，共40個循環，最后72 ℃ 10 min 。每個樣本同時設置3個平行管，β-actin作為內參照，LightCycler Software 4.05分析計算結果,得到cDNA拷貝數(copies/μL)，結果分析采用目的基因分子拷貝數/β-actin分子拷貝數，計算K值。以取材時間為橫坐標，各基因相應K值作折線圖，分析其表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列

3.7小鼠糖尿病模型的制備 適應性喂養3～5 d后，將BALB/c小鼠禁食12 h，腹腔注射2% STZ溶液(170 mg/kg)，以高糖/高脂喂養。72 h后尾靜脈采血監測血糖，連續3 d血糖濃度大于0.3 g/L的小鼠為造模成功的糖尿病小鼠。

3.8細胞移植 將BALB/c糖尿病小鼠模型隨機分為3組：(1)NIT-hAAT組(n=10)：左腎包膜下注射1.5×107個NIT-hAAT細胞；(2)NIT-1組(n=10)：左腎包膜下注射1.5×107個NIT-1細胞；(3)對照組(n=10)：左腎包膜下注射PBS 0.1 mL。

3.9移植后功能學檢測 移植后BALB/c小鼠，每天15：00斷尾法取血，MediSenseOptium血糖儀檢測，紙片法連續測定非空腹血糖至36 d。在30 d時摘取左腎。當血糖連續2 d超過0.3 g/L 則診斷為糖尿病。在移植后第7、14、21、28 d，各組小鼠眶周采血0.5 mL，離心分離血清-20 ℃保存，采用ELISA法檢測血清中胰島素和C肽水平。

3.10移植部位病理學觀察 BALB/c小鼠在細胞移植后14和28 d，每組各處死3只BALB/c小鼠取移植左腎組織，10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋固定，切成5 μm組織切片，HE染色。400倍光學顯微鏡下，在移植部位隨機選取10個視野，計數白細胞浸潤個數。

4統計學處理

數據以均數±標準差(mean±SD)表示。隨時間檢測的數據比較采用重復測量設計的方差分析，組間數據分析采用完全隨機設計的方差分析(One-way ANOVA)。兩組均數比較采用獨立樣本t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1NIT-hAAT細胞系構建及hAAT表達的鑒定

將構建的pDsRed-hAAT轉染至NIT-1細胞，經G418篩選后建立穩定的NIT-hAAT細胞系。對NIT-hAAT細胞系表達的hAAT蛋白進行Western blotting鑒定。與第10代結果一致，第40代對照組NIT-1細胞只表達42 kD的β-actin，而NIT-hAAT細胞同時表達β-actin與55 kD的hAAT。這表明構建的NIT-hAAT細胞系在體外傳代至40代，仍能穩定表達hAAT蛋白，見圖1。

Figure 1. hAAT expression confirmed by Western blotting.1:NIT-1 cells transfected with pDsRed-hAAT; 2:NIT-1 cells transfected with pDsRed.

圖1NIT-hAAT表達hAAT蛋白的Westernblotting分析

2AAT的免疫保護和免疫抑制作用

2.1單向混合淋巴細胞增殖實驗 各組淋巴細胞與絲裂霉素處理的NIT-hAAT或NIT-1細胞進行混合淋巴細胞培養，NIT-hAAT組淋巴細胞增殖與NIT-1組相比，受到明顯的抑制(P<0.05)，并隨著NIT-hAAT相對于淋巴細胞比例的提高，抑制效果逐漸增強，具有量效關系，見圖2。當10∶1時，抑制效果呈顯著差異(P<0.01),且NIT-1組較對照組和NIT-hAAT組淋巴細胞增殖能力明顯增強(P<0.01，P<0.05)。

2.2ELISA檢測炎癥細胞因子 ELISA檢測各組淋巴細胞與絲裂霉素處理的NIT-hAAT或NIT-1細胞10∶1比例共培養上清中Th1細胞因子(IFN-γ)和Th2細胞因子(IL-4)水平。結果顯示，與NIT-1組相比，NIT-hAAT組淋巴細胞的IFN-γ分泌水平明顯降低(P<0.05)，IL-4分泌水平明顯升高(P<0.05)。而同一種細胞的移植受體鼠脾細胞中，IFN-γ和IL-4分泌水平無明顯差異(P>0.05)，見表2。

Figure 2. Mixed lymphocyte reactions stimulated by NIT-hAAT and NIT-1 cells.Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsNIT-1.

圖2NIT-hAAT和NIT-1單向混合淋巴細胞實驗

表2單向混合淋巴細胞實驗中分泌炎癥細胞因子IFN-γ和IL-4的水平

Table 2. Comparison of the secretion of IFN-γ and IL-4 in lymphocytes immunized by NIT-1 or NIT-hAAT cells(ng/L.Mean±SD.n=3)

GroupIFN-γ(Th1)IL-4(Th2)NIT-1cell-primedlymphocytesNIT-hAATcell-primedlymphocytesNIT-1cell-primedlymphocytesNIT-hAATcell-primedlymphocytesNIT-1218.29±4.75196.06±1.82*22.80±3.7524.20±4.75*NIT-hAAT41.83±3.46**33.54±5.82**45.40±2.60**52.10±3.25**Control182.01±6.42164.60±5.2328.20±0.8232.20±7.21

*P<0.05,**P<0.01vscontrol or NIT-1.

2.3實時熒光定量PCR檢測炎癥因子mRNA表達 與NIT-1細胞移植受體鼠相比，NIT-hAAT細胞移植受體鼠脾淋巴細胞中CRP mRNA的表達明顯增強(P<0.05)，而IL-1β和IL-6 mRNA的表達減弱(P<0.05)，見圖3。這表明hAAT可抑制炎癥因子的表達。

Figure 3. Inflammatory cytokine expression analysed by real-time fluorescence quantitative PCR from aninvitroextended CTL assay. A,C,E:mediated by NIT-1 cell-primed lymphocytes; B,D,F: mediated by NIT-hAAT cell-primed lymphocytes.Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNIT-1.

圖3實時熒光定量PCR檢測炎癥因子mRNA表達

2.4流式細胞術檢測細胞凋亡 經絲裂霉素處理的NIT-1或NIT-hAAT細胞分別與NIT-1或NIT-hAAT細胞誘導產生的CTL混合培養7 d后，流式細胞術檢測發現，NIT-1細胞與NIT-1誘導產生的CTL細胞混合培養時，NIT-1細胞發生明顯的細胞凋亡(37.55%±1.05%)；與NIT-hAAT誘導產生的CTL細胞混合培養時，NIT-1細胞凋亡發生率較低(12.94%±0.36%)(P<0.05)。NIT-hAAT細胞與NIT-1誘導產生的CTL細胞混合培養時，NIT-hAAT細胞凋亡明顯降低(10.05%±0.95%)；而與NIT-hAAT誘導產生的CTL細胞混合培養時，NIT-hAAT細胞凋亡最低(8.56%±1.34%)(P<0.05)，見圖4。

Figure 4. The apoptosis of NIT-1 (A,C) and NIT-1-hAAT (B,D) cells determined by flow cytometric analysis with Annexin V-FITC and PI staining. A, B:mediated by NIT-1 cell-primed lymphocytes; C,D:mediated by NIT-hAAT cell-primed lymphocytes.

圖4流式細胞術分析NIT-1或NIT-hAAT細胞凋亡散點圖

3AAT對NIT-1細胞移植后的功能影響

3.1糖尿病模型小鼠血糖和體重變化 糖尿病BALB/c小鼠左腎包膜移植NIT-1或NIT-hAAT細胞后，每3 d監測1次各組小鼠血糖濃度變化，移植后第3 d兩組小鼠的血糖均迅速降低。NIT-1組在移植12 d后血糖開始升高，15 d時升至0.3 g/L，第30 d摘除左腎后血糖無明顯變化；NIT-hAAT組小鼠維持正常血糖水平至30 d，在第30 d摘除左腎后血糖迅速升高至糖尿病水平。NIT-hAAT組小鼠體重平緩增加，NIT-1組和糖尿病組小鼠體重逐漸減少，見圖5A。

3.2胰島素和C肽水平 胰島素和C肽水平方面，NIT-hAAT組小鼠移植3 d后開始明顯升高，并維持在較高水平，較糖尿病組小鼠升高顯著(P<0.01)。NIT-1組小鼠在移植后第3 d開始明顯升高并持續至第14 d，之后胰島素和C肽水平逐漸降低，第21 d時與糖尿病組相比無明顯區別，見圖5B、C。

4病理學觀察

NIT-1組移植后14 d時只殘存少量移植細胞，浸潤炎癥細胞數量為(31.0±1.0)，28 d時未見移植細胞，組織呈纖維化改變。NIT-hAAT組在移植后14 d時有大部分移植細胞存活，浸潤炎癥細胞數量為(14.0±2.9)，明顯低于NIT-1組(P<0.01)，28 d后NIT-hAAT組炎癥細胞浸潤(16.0±3.6)與14 d無明顯變化，仍有移植細胞存活，見圖6。

Figure 5. Changes of blood glucose (A), insulin (B) and C-peptide (C) levels in diabetic mice after transplantation. Mean±SD. Ten mice were used in monitoring blood sugar level. Five mice were used in determination of C-peptide and insulin secretion.*P<0.05vsdiabetes.

圖5糖尿病小鼠移植NIT-1或NIT-hAAT細胞后血糖、胰島素和C-肽水平的變化

討 論

NIT-1是一種能自主分泌胰島素的NOD鼠源β細胞系，是研究1型糖尿病的常用細胞模型[11]。本研究中將AAT基因導入NIT-1，構建NIT-hAAT細胞系，經Western blotting方法證實，NIT-hAAT細胞系在體外擴增培養至40代后仍具有良好的自我增殖和分泌hAAT的能力。在體外CTL實驗中，將NIT-hAAT和NIT-1細胞分別與NIT-hAAT和NIT-1細胞刺激的同種異體BALB/c小鼠CTL共培養，發現NIT-hAAT細胞對CTL的刺激增殖作用明顯低于NIT-1細胞。與NIT-1組相比，NIT-hAAT組CTL的Th1(IFN-γ)分泌水平明顯降低(P<0.05)，Th2(IL-4)分泌水平明顯升高。與NIT-1細胞移植受體小鼠相比，NIT-hAAT細胞移植受體鼠CTL中CRP mRNA的表達明顯增強(P<0.05)，而炎癥因子IL-1β、IL-6mRNA的表達減弱(P<0.05)。NIT-hAAT細胞與NIT-hAAT誘導產生的CTL混合培養時，NIT-hAAT細胞凋亡最低(P<0.05)。通過CTL實驗證實，hAAT具有保護NIT-1細胞的作用，可能通過與IL-1β和IFN-γ結合抑制對β細胞破壞[12]；也可能在β細胞內通過抑制caspase-3活化直接發揮抗凋亡作用[7]；或通過調節Th1/Th2細胞因子的平衡發揮作用。IL-4屬于Th2型細胞因子，可以促進Th0向Th2分化，抑制Th0向Th1分化，NIT-hAAT細胞能夠促進IL-4的產生。因此推測，AAT可能誘導Th2細胞的產生，分泌過量的IL-4，進而下調Th1細胞因子的殺傷能力，同時抑制炎癥因子的基因表達。本研究的實驗結果證實，NIT-hAAT細胞與NIT-hAAT細胞介導的CTL共培養時，NIT-hAAT細胞凋亡率最低，與NIT-1細胞介導的CTL共培養，NIT-hAAT細胞凋亡率也明顯降低，表明AAT可能通過免疫保護和免疫抑制發揮雙重作用。

Figure 6. The pathological changes of mouse left kidneys after transplantation (HE staining).A,B:14 d after transplantation;C,D:21 d after transplantation; A,C: NIT-1 group; B,D: NIT-hAAT group. Scale bar=200 μm.

圖6糖尿病小鼠移植部位病理學分析

糖尿病模型鼠的移植實驗中，將NIT-hAAT細胞移植到糖尿病小鼠左腎[13]，血糖在移植3 d后明顯降低，維持至30 d，左腎摘除后血糖迅速升高成為高血糖癥；而NIT-1細胞移植組小鼠血糖在移植3 d后降低，12 d后即開始迅速升高。我們同時觀察到，在14、21和28 d時NIT-hAAT組小鼠血清胰島素和C肽水平較糖尿病組和NIT-1組小鼠明顯升高(P<0.05)。張悅等[14]同樣證實，AAT可提高NIT-1細胞生存能力和減輕炎癥反應的發生。我們先前將NIT-hAA移植到7周齡雌性NOD鼠左腎包膜下,發現NIT-hAAT移植后NOD鼠糖尿病的發生時間明顯推遲，發病率明顯降低；胰腺炎減輕，胰島細胞凋亡減少，移植部位炎癥細胞浸潤減少, hAAT具有抑制移植物免疫排斥反應和抑制自身免疫攻擊的雙重作用[12]。Lewis等[15]在胰島移植實驗中發現，AAT可阻斷中性粒細胞與巨噬細胞對移植物的浸潤，在移植物周圍形成袖口狀T調節細胞層，這些細胞表達Foxp3、TGF-β、CTLA-4等T調節細胞相關蛋白；Walters等[16]也在移植物周圍發現類似的保護細胞層，從而減少移植物的炎癥浸潤，延長存活時間。由于胰島素瘤細胞系來自NOD/Lt小鼠，移植后會發生免疫排斥，NIT-hAAT細胞表達的hAAT蛋白能夠抑制對胰島細胞的免疫排斥反應，并表現出免疫保護作用；通過上調IL-4的分泌，調節Th1/Th2細胞的平衡，抑制免疫反應發生，減輕胰島β細胞移植中的免疫排斥反應，延長胰腺β細胞在小鼠體內存活期。NIT-hAAT在體內如何發揮免疫抑制和免疫保護的作用機制，以及是否具有誘導免疫耐受，維持長久移植的胰島細胞存活，還需要進一步研究。

綜上所述，本研究通過構建攜帶免疫調節功能元件hAAT的胰島β細胞構建NIT-hAAT細胞系。通過單向混合淋巴細胞增殖實驗，證實hAAT對胰島細胞具有雙重免疫保護作用。將NIT-hAAT移植到糖尿病小鼠體內，發現NIT-hAAT能夠在體內發揮負性免疫調節作用，短期內可以抑制移植物免疫排斥反應。

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Immunosuppressiveandprotectiveeffectsofhumanα1-antitrypsinonpancreaticβ-celltransplantation

ZHANG Xiao-dan, YE Jian, LIAO Yu-ting, QI Hui, DENG Chun-yan, LI Fu-rong

(KeyLaboratoryofStemCellandCellularTherapy,theSecondClinicalMedicalCollege,ShenzhenPeople’sHospital,JinanUniversity,Shenzhen518020,China.E-mail:frli62@yahoo.com)

AIM: To study the immunosuppressive and protective effects of human α1-antitrypsin (hAAT) on pancreatic β-cell transplantation.METHODSAn NIT-1 cell line (NIT-hAAT) was constructed, which can stably express the protein of hAAT. The BALB/c mice were intraperitoneally injected with NIT-1 and NIT-hAAT cell lines twice to induce cytotoxic T-lymphocytes (CTL). The apoptotic situation, the cytokine expression, and the mRNA expression of inflammatory factors were examined after mixed culture of CTL with NIT-1 or NIT-hAAT cell line pretreated with mitomycin. Both cell lines were transferred into the left renal capsule of the diabetic mice to dynamically observe the changes of blood sugar and body weight, the serum levels of insulin and C-peptide, and the pathological changes of the transplanted sites.RESULTSThe results of extended CTL killing assay showed that the cytotoxic effect on NIT-hAAT cell acceptor mice was significantly reduced compared with NIT-1 cell acceptor mice. hAAT effectively reduced apoptosis, inhibited the mRNA expression of inflammatory factors IL-1β and IL-6, and adjusted the balance of Th1/Th2 cytokine expression. After NIT-hAAT was transplanted into the diabetic mice, blood glucose decreased obviously and maintained for 28 d. The serum levels of insulin and C-peptide increased obviously. The infiltration of the inflammatory cells in the transplanted sites significantly reduced.CONCLUSIONhAAT has the abilities of reducing cytotoxic effect of CTL on the β-cells, inhibiting inflammatory factor expression, and stopping short-term immunological rejection of the acceptor. hAAT has obvious immunosuppressive and protective effects on pancreatic β-cell transplantation for treatment of diabetes.

α1-antitrypsin; β-cells; Transplantation; Immunosuppression; Diabetes mellitus

R392.11

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.04.008

1000- 4718(2013)04- 0619- 07

2013- 01- 14

2013- 03- 11

國家973前期專項(No. 2007CB516811)；國家自然科學基金資助項目(No.81270857)；深圳市科技計劃(No. 200901001)

△通訊作者 Tel: 0755-25533018-2450; E-mail: frli62@yahoo.com