帕金森病相關(guān)血清蛋白質(zhì)標(biāo)志物的篩選及鑒定*

周 婷， 劉池波， 徐小輝， 梁海燕

(臺(tái)州學(xué)院醫(yī)學(xué)院附屬臺(tái)州市立醫(yī)院 1神經(jīng)內(nèi)科， 2檢驗(yàn)科，浙江 臺(tái)州 318000)

帕金森病相關(guān)血清蛋白質(zhì)標(biāo)志物的篩選及鑒定*

周 婷1△， 劉池波2， 徐小輝1， 梁海燕1

(臺(tái)州學(xué)院醫(yī)學(xué)院附屬臺(tái)州市立醫(yī)院1神經(jīng)內(nèi)科，2檢驗(yàn)科，浙江 臺(tái)州 318000)

目的探討并初步鑒定帕金森病患者血清中相關(guān)蛋白質(zhì)作為特異標(biāo)志物的可能性。方法應(yīng)用表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)結(jié)合納米磁珠技術(shù)檢測(cè)44例帕金森病和60例健康對(duì)照的血清標(biāo)本,應(yīng)用生物信息學(xué)方法篩選差異蛋白峰,經(jīng)高效液相色譜(HPLC)分離出差異蛋白，酶解后進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)分析，利用Xcalibur的程序組件BioWorks 3.2完成蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定分析。結(jié)果經(jīng)SELDI-TOF-MS結(jié)合納米磁珠技術(shù)篩選出質(zhì)荷比m/z位于8 937的蛋白質(zhì)在帕金森病中高表達(dá)(帕金森病組表達(dá)強(qiáng)度為27.47±16.58,正常組表達(dá)強(qiáng)度為5.01±3.47),有顯著差異(P<0.01);6 636和8 697的蛋白質(zhì)在帕金森病中低表達(dá)(帕金森病組表達(dá)強(qiáng)度為5.43±2.66和20.22±9.57,正常組表達(dá)強(qiáng)度為18.85±7.56和51.13±26.22), 有顯著差異(P<0.01)。聯(lián)合上述3種潛在蛋白質(zhì)標(biāo)志物,可區(qū)分帕金森病組和對(duì)照組，其中帕金森病患者檢出率為90.0%(27/30),健康者檢出率為92.5%(37/40)。對(duì)m/z為6 636、8 697和8 937的標(biāo)志物進(jìn)行鑒定,結(jié)果分別為載脂蛋白C-I、載脂蛋白 C-III 和補(bǔ)體成分3a。結(jié)論鑒定出的載脂蛋白 C-I、載脂蛋白C-III和補(bǔ)體成分3a在帕金森病的診斷中具有一定價(jià)值,值得進(jìn)一步研究和探討。

帕金森病； 蛋白質(zhì)組； 表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法； 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用串聯(lián)質(zhì)譜

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)，又名震顫麻痹(shaking palsy)，是一種中老年人常見的緩慢進(jìn)展的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，是中老年人致殘的主要原因之一。臨床上以靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩、肌強(qiáng)直和姿勢(shì)步態(tài)障礙為主要特征，患病率與發(fā)病率隨著年齡的增加而遞增[1]。目前臨床上診斷帕金森病尚無(wú)特異敏感的生化指標(biāo)和影像學(xué)檢查可作為確診的依據(jù)。所以診斷主要依據(jù)臨床癥狀和對(duì)左旋多巴治療的反應(yīng)，但這些方法往往只能發(fā)現(xiàn)中晚期病例，且容易漏診和誤診。目前帕金森病的治療主要在于改善運(yùn)動(dòng)癥狀，而非延緩疾病的進(jìn)程，所以早期診斷帕金森病，為帕金森病的早期干預(yù)及延緩病損提供了可能。因此，探索和建立一種簡(jiǎn)單、快速、敏感性高和準(zhǔn)確性強(qiáng)的帕金森病快速診斷技術(shù)已經(jīng)成為臨床醫(yī)學(xué)上亟待解決的問(wèn)題。表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(surface-enhanced laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS) 是近年來(lái)出現(xiàn)的一種新型的蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法[2-4]，可用于直接檢測(cè)臨床各種類型標(biāo)本，如血清、胸腹水、尿液、腦脊液等，實(shí)現(xiàn)了質(zhì)譜技術(shù)用于臨床標(biāo)本檢測(cè)的飛躍[5-6]。我們利用SELDI-TOF-MS結(jié)合納米磁珠技術(shù)對(duì)44例帕金森病和60例健康對(duì)照的血清標(biāo)本進(jìn)行差異蛋白篩選，再結(jié)合高效液相色譜(high-performance liquid chromatography，HPLC)、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)及液質(zhì)聯(lián)用串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatograph-mass spectrometry tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)對(duì)帕金森病差異蛋白進(jìn)行鑒定分析。

材 料 和 方 法

1研究對(duì)象

收集2011年1月～2012年2月我院住院及門診的PD患者44例，男性24例，女性20例，年齡(67.41±12.87)歲(54～82歲)；病程(3.25±4.36)年(0.5～16年)。入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合2006年中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)病學(xué)分會(huì)運(yùn)動(dòng)障礙及PD學(xué)組所制訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；(2)均經(jīng)CT或MRI檢查，除有老年性腦改變外，未見特殊異常；(3)排除腦血管疾病、腦炎等原因所導(dǎo)致的帕金森綜合征。所有帕金森病患者和健康者血清均來(lái)自浙江省臺(tái)州市立醫(yī)院，隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組與驗(yàn)證組(training set為實(shí)驗(yàn)組,blind set為驗(yàn)證組，見表1)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，受試者均簽署知情同意書。所有外周血標(biāo)本均在清晨空腹采血，采集后立即放入4 ℃冰箱內(nèi)靜置1～2 h，然后4 ℃ 3 000 r/min離心10 min，分離血清后，在冰上將血清轉(zhuǎn)移到新的PCR管中分裝，放入-80 ℃內(nèi)冰箱保存待檢。

表1 44例帕金森病患者和60例對(duì)照組分組情況

2儀器和試劑

乙腈(acetonitrile,ACN)、三氟乙酸(trifluoroacetic acid，TFA)、芥子酸(sinapinic acid，SPA)、尿素、二硫蘇糖醇(DL-dithiothreitol，DTT)、3-[3-(膽酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽{3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate，CHAPS}、Tris-HCl、H2O等購(gòu)自Sigma，SELDI-TOF-MS (PBS IIC)質(zhì)譜儀購(gòu)自Ciphergen Biosystems，弱陽(yáng)離子交換型(WCX)納米磁珠、結(jié)合緩沖液、洗脫液等購(gòu)自北京賽爾迪公司。MALDI-TOF-MS質(zhì)譜儀(AXIMA-CFRTMPlus)購(gòu)于Kratos Analytical,HPLC購(gòu)于Shimadzu，Xcalibur的程序組件BioWorks 3.2數(shù)據(jù)庫(kù)購(gòu)自Thermo Finnigan。

3帕金森病SELDI-TOF-MS分析

將WCX納米磁珠分裝于PCR管中，置于磁性處理器上，吸取液體。再依次加入100 μL結(jié)合緩沖液，混勻后放置5 min，然后把PCR管置于磁性處理器上，吸取液體，重復(fù)上述操作1次。向每個(gè)裝有納米磁珠的PCR管中加入100 μL稀釋好的血清樣品，混勻后室溫放置15 min。將PCR管置于磁性處理器上，吸去未結(jié)合樣品。每管加入100 μL結(jié)合緩沖液，混勻后放置5 min，然后將PCR管置于磁性處理器上，吸取液體，重復(fù)上述操作1次。每管加入10 μL洗脫液混勻，放置5 min后置于磁性處理器上。取5 μL上清液移到另一個(gè)PCR管中，加人5 μL飽和SPA溶液充分混勻，吸取1 μL點(diǎn)樣到Au芯片上，待干后放入儀器讀取。SPA飽和溶液為芥子酸在50% ACN和0.5% TFA的飽和溶液。質(zhì)譜儀參數(shù)設(shè)定為激光強(qiáng)度190，靈敏度8，優(yōu)化范圍2 000～20 000質(zhì)荷比(mass/charge rato,m/z)。每條芯片取1點(diǎn)用同一正常人血清作內(nèi)參照，芯片間 CV≤10%。檢測(cè)前用ALL-IN-ONE多肽標(biāo)準(zhǔn)芯片校正,系統(tǒng)質(zhì)量偏差≤0.1%。原始數(shù)據(jù)先以ProteinChip 3.0軟件校正。

4蛋白質(zhì)的純化分析

將血清溶解后取出100 μL血清，加入350 μL水，700 μL純乙腈。將上述混合液體置入-20 ℃的冰箱內(nèi)，30 min后取出，3 000 r/min離心10 min。上清液轉(zhuǎn)入PCR管中凍干20 min。將凍干的樣品上樣至HPLC中。收集不同時(shí)點(diǎn)的純化液體，將純化出的蛋白液置入PCR管中凍干約20 μL。各取所收集組分0.5 μL，分別加入1.5 μL基質(zhì)溶液[10 g/Lα-氰基-4-羥基肉桂酸(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, CHCA)]，混合后點(diǎn)于靶板上，靜置結(jié)晶、干燥后用MALDI-TOF-MS檢測(cè)。檢測(cè)條件：脈沖氮激光(337 nm)作為離子解吸電離源，加速電壓20 kV，采用線性分析模式，質(zhì)量范圍：3 000～20 000 (m/z)。找出SELDI-TOF-MS所篩選質(zhì)荷峰值的特異樣本。

5目標(biāo)蛋白質(zhì)的LC-MS/MS分析

取20 μL純化的目標(biāo)蛋白質(zhì)，加60 μL 8 mol/L尿素，使尿素的終濃度為6 mol/L，室溫振蕩20 min；加入0.8 μL 1 mol/L DTT，使其終濃度為10 mol/L，室溫振蕩1 h；再加入3.2 μL 1 mol/L碘乙酰胺，使其終濃度為40 mol/L，避光放置45 min；加入3.2 μL 1 mol/L DTT，終濃度為40 mol/L，振蕩20 min；加入400 μL 50 mol/L NH4HCO3稀釋樣品溶液，使尿素終濃度降為1 mol/L，pH 約8.0。每支樣品中加入0.1 μg蛋白酶K，37 ℃水浴1 h，加入甲酸調(diào)溶液pH<3，終止酶解反應(yīng)。目標(biāo)蛋白的酶解產(chǎn)物用LC-MS/MS進(jìn)行分析。樣品溶液可以通過(guò)特定裝置直接上樣于自制的C18毛細(xì)管液相色譜柱。色譜柱及色譜條件：自制毛細(xì)管柱內(nèi)徑為100 μm，填料部分長(zhǎng)100 mol/L，填料粒徑5 μm。流動(dòng)相A：水，0.1%甲酸；流動(dòng)相B：乙腈，0.1%甲酸；洗脫程序：100% A(0 min)→100%A (5 min)→5% B(5.1min)→65%B(60 min) →100% B (75 min) →100% B (85 min)；流速：200～800 nL/min。質(zhì)譜條件：采用數(shù)據(jù)依賴模式(data-dependent mode)，掃描質(zhì)量范圍：400～2 000 (m/z) ，每次選取全掃描(full scan)中5個(gè)信號(hào)最強(qiáng)的離子峰(母離子)進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜(MS2)分析。

6LC-MS/MS分析數(shù)據(jù)的檢索

數(shù)據(jù)檢索利用Xcalibur的程序組件BioWorks 3.2完成，根據(jù)二級(jí)離子譜圖在NCBI的人類蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索肽段序列。檢索參數(shù)設(shè)置見參考文獻(xiàn)[8]。

7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

帕金森病SELDI蛋白指紋圖譜用Biomarker Wizard 3.1軟件和Biomarker Patterns 4.0.1軟件進(jìn)行分組及相關(guān)性分析，帕金森病組與對(duì)照組之間蛋白質(zhì)峰強(qiáng)度比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1帕金森病血清蛋白指紋圖譜分析

30例帕金森病患者和40例對(duì)照者血清的蛋白指紋圖譜經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化后，用 Biomarker Wizard軟件分析，在分子質(zhì)量2 000～20 000范圍內(nèi)共檢測(cè)到143個(gè)蛋白峰，見圖1。

Figure 1. Representative protein spectrum of a Parkinson disease sample detected by SELDI-TOF-MS combined with WCX magnetic beads，showing the protein mass/charge ratio between 2 000 and 20 000．A:healthy control; B: Parkinson’s disease.

圖1經(jīng)SELDI-TOF-MS結(jié)合WCX納米磁珠檢測(cè)帕金森病的血清蛋白質(zhì)指紋表達(dá)圖譜

2帕金森病血清蛋白指紋圖譜數(shù)據(jù)分析及帕金森病診斷模型的建立

經(jīng)Biomarker Patterns軟件進(jìn)一步分析顯示，帕金森病患者外周血清蛋白質(zhì)表達(dá)譜與對(duì)照組相比，m/z為6 636、8 697和8 937的3個(gè)蛋白峰的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，其中m/z為8 937的蛋白峰在帕金森病組中明顯高于對(duì)照組，而m/z為6 636和8 697的蛋白峰則在對(duì)照組中相對(duì)高表達(dá)(P<0.01),見表2。用此模型分析30例帕金森病患者與40例對(duì)照者的質(zhì)譜結(jié)果，帕金森病患者檢出率為90.0%(27/30),健康者檢出率為92.5%(37/40)，見表3。根據(jù)差異蛋白及其特定組合，理論上可以區(qū)分帕金森病組與對(duì)照組。

表2帕金森病組與對(duì)照組血清蛋白質(zhì)峰強(qiáng)度的比較

Table 2. Conparison of signal intensity of various serum protein peaks between Parkinson’s disease and healthy control

Groupm/z663686978937Parkinsondisease5.43±2.66**20.22±9.57**27.47±16.58**Healthycontrol18.85±7.5051.13±26.225.01±3.47

**P<0.01vshealthy control.

3診斷模型的驗(yàn)證

采用14例帕金森病患者與20例對(duì)照者檢測(cè)得到的蛋白指紋圖譜對(duì)已建立的帕金森病診斷模型進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果表明其對(duì)帕金森病診斷的帕金森病患者檢出率為85.7%(12/14)，健康者檢出率為90.0%(18/20),見表3。

表3帕金森病診斷模型的診斷特性

Table 3. Prediction results of the diagnostic model for Parkinson’s disease

GroupSampleCaseNo.Correctly-classifiedNo.Accuracy(%)TrainingsetParkinsondisease302790.0control403792.5BlindsetParkinsondisease141285.7Healthycontrol201890.0

4差異蛋白質(zhì)峰的純化

將帕金森病的3個(gè)差異蛋白質(zhì)峰(6 636、8 697和8 937)經(jīng)HPLC分離純化后，收集到不同的PCR管中，經(jīng)MALDI-TOF-MS檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)3個(gè)純化樣本分別是相對(duì)分子質(zhì)量為6 632.9、8 697.2和8 933.1的特異蛋白質(zhì),見圖2。

5質(zhì)譜分析及數(shù)據(jù)庫(kù)檢索

將上述3管的蛋白質(zhì)樣品酶解后，采用LC-MS/MS測(cè)定該蛋白質(zhì)的酶解肽段，數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)Xcalibur的程序組件BioWorks 3.2 完成，根據(jù)二級(jí)離子譜圖在NCBI的人類蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索肽段序列。最終鑒定m/z為6 636、8 697和8 937的標(biāo)志物分別為載脂蛋白C-I、載脂蛋白 C-III 和補(bǔ)體3a(complement 3a,C3a)，見表4。

討 論

SELDI-TOF結(jié)合HPLC及LC-MS/MS技術(shù)組合是近年出現(xiàn)的一種新的蛋白質(zhì)研究方法，它集臨床蛋白質(zhì)組學(xué)差異蛋白篩選、鑒定為一體的較理想的技術(shù)平臺(tái)[9]。目前已在自身免疫性疾病[10]、感染性疾病[11]及惡性腫瘤[12-14]等多種疾病標(biāo)志物篩選方面取得了突破性的進(jìn)展，并且篩選出許多與疾病相關(guān)的新型生物標(biāo)志物為臨床疾病的診斷和治療提供新的選擇[15-16]。

Figure 2. MALDI-TOF-MS atm/zof spectra of the three purified potential protein markers atm/zof 6 636, 8 697 and 8 937.

圖2m/z6636、8697和8937的3個(gè)差異蛋白經(jīng)蛋白純化后的MALDI-TOF-MS圖

在本研究中，我們通過(guò)SLEDI-TOF-MS技術(shù)結(jié)合WCX納米磁珠篩選出m/z6 636、8 697和8 937的蛋白質(zhì)標(biāo)志物3個(gè)，其中8 937在帕金森病血清中高表達(dá)，6 636和8 697在帕金森病血清中低表達(dá)。由這3個(gè)標(biāo)志物組合的診斷模型對(duì)帕金森病患者檢出率為90.0%(27/30),健康者檢出率為92.5%(37/40)。提示可以將這3個(gè)蛋白質(zhì)標(biāo)志物作為帕金森病血清學(xué)診斷的指標(biāo)。通過(guò)本研究建立的診斷模型對(duì)14例帕金森病組與20例對(duì)照組進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果對(duì)帕金森病患者檢出率為85.7%(12/14)，健康者檢出率為90.0%(18/20)。結(jié)合HPLC及LC-MS/MS技術(shù)對(duì)m/z為6 636、8 697和8 937的標(biāo)志物進(jìn)行鑒定,結(jié)果為載脂蛋白 C-I、載脂蛋白C-III 和C3a。

表4 帕金森病差異蛋白質(zhì)的氨基酸序列

m/z為6 636的蛋白為載脂蛋白 C-I，主要是在肝臟合成，極少一部分是由小腸合成，其主要的生物學(xué)功能是參與脂類代謝。目前已有報(bào)道關(guān)于應(yīng)用SELDI-TOF技術(shù)篩選胰腺癌[17]和非小細(xì)胞肺癌[18]患者血清中的差異蛋白，發(fā)現(xiàn)m/z6 636的蛋白在胰腺癌和非小細(xì)胞肺癌患者血清中低表達(dá)，并鑒定為載脂蛋白 C-I，與本研究中m/z6 636的蛋白為同一蛋白。但至今，國(guó)內(nèi)外有關(guān)載脂蛋白 C-I與帕金森病的相關(guān)性研究報(bào)道甚少，有待進(jìn)一步研究。m/z為8 697的蛋白為載脂蛋白C-III，載脂蛋白 C-III是由79個(gè)氨基酸殘基組成的分子量為8 800的糖蛋白，主要在肝臟合成，其次在小腸。載脂蛋白C-III主要分布于富三酰甘油脂蛋白和高密度脂蛋白(HDL)中。目前已有報(bào)道載脂蛋白C-III是心血管疾病的重要危險(xiǎn)因素，可引起脂質(zhì)代謝異常，其直接參與致血管內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)過(guò)程，幾乎參與動(dòng)脈粥樣硬化形成的全過(guò)程，被視為一個(gè)獨(dú)立的促炎和促粥樣硬化因素。此外，載脂蛋白C-III還具有阻止肝細(xì)胞攝取含載脂蛋白E的乳糜微粒殘?bào)w的作用。同時(shí)，F(xiàn)an等[12]通過(guò)SELDI技術(shù)篩選乳頭狀甲狀腺癌，發(fā)現(xiàn)m/z為8 697的蛋白在乳頭狀甲狀腺癌中低表達(dá)，與本研究中m/z8 697的蛋白相同。載脂蛋白C-III在帕金森病患者血清中呈低表達(dá)，提示帕金森病的發(fā)生可能對(duì)載脂蛋白C-III的表達(dá)起抑制作用。這可能與帕金森病的發(fā)生對(duì)載脂蛋白C-III合成部位的損害有關(guān)，載脂蛋白C-III表達(dá)下調(diào)的原因有待于進(jìn)一步研究。m/z為8 937的蛋白峰鑒定為C3a。補(bǔ)體具有調(diào)節(jié)炎癥及免疫反應(yīng)的功能，C3是由α和β鏈組成的，是血清中含量最豐富的補(bǔ)體成分，C3可裂解為C3a和C3b， C3a具有作為配體與細(xì)胞表面相應(yīng)受體結(jié)合后,激發(fā)細(xì)胞脫顆粒,釋放組胺之類的血管活性介質(zhì)，從而增強(qiáng)血管通透性并刺激內(nèi)臟平滑肌收縮的功能，是一種過(guò)敏毒素。同時(shí)可對(duì)免疫應(yīng)答的各個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，可成為炎癥的一種生物標(biāo)志物。在本研究中，C3a在帕金森病中高表達(dá)，其機(jī)制尚不清楚，可能作為一種因子參與帕金森的發(fā)生與發(fā)展。

本研究鑒定出的載脂蛋白C-I、載脂蛋白C-III 和C3a在帕金森病診斷中的聯(lián)合應(yīng)用具有較高的準(zhǔn)確性，該聯(lián)合檢測(cè)模型可作為帕金森病的一種新的診斷方法。但由于這3個(gè)蛋白分別在胰腺癌、非小細(xì)胞肺癌以及乳頭狀甲狀腺癌中均有不同表現(xiàn)，并非帕金森病特有蛋白，因此在下一步研究中，我們將利用這3個(gè)蛋白組成的診斷模型擴(kuò)大在帕金森病患者中的臨床早期診斷應(yīng)用，并將該模型用于帕金森病的療效觀察中，以了解該模型在帕金森病診斷、療效觀察中的更多臨床意義。

[1] Pahwa R, Lyons KE. Early diagnosis of Parkinson’s disease: recomendations from diagnostic clinical guidelines[J]. Am J Manag Care，2010,16(4):S94-S99.

[2] Xiao X, Zhao X, Liu J, et al. Discovery of laryngeal carcinoma by serum proteomic pattern analysis[J]. Sci China C Life Sci， 2004,47(3):219-223.

[3] Pang RT, Poon TC, Chan KC, et al. Serum proteomic fingerprints of adult patients with severe acute respiratory syndrome[J]. Clin Chem, 2006, 52(3):421-429.

[4] Liang Y, Fang M, Li J, et al. Serum proteomic patterns for gastric lesions as revealed by SELDI mass spectrometry[J]. Exp Mol Pathol, 2006, 81(2):176-180.

[5] Zhang Q, Wang J, Dong R, et al. Identification of novel serum biomarkers in child nephroblastoma using proteomics technology[J]. Mol Biol Rep, 2011,38(1):631-638.

[6] Cho WC. Proteomics technologies and challenges[J]. Genomics Proteomics Bioinformatics, 2007, 5(2):77-85.

[7] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)病學(xué)分會(huì)運(yùn)動(dòng)障礙及帕金森病學(xué)組．帕金森病的診斷[J]．中華神經(jīng)科雜志，2006，39(6)：408-409．

[8] 王偉平，劉池波．胃腺癌血清蛋白質(zhì)標(biāo)志物的篩選及鑒定[J]．中國(guó)病理生理雜志，2012，28(2)：274-280．

[9] Li J, Xie Z, Shi L,et al. Purification, identification and profiling of serum amyloid A proteins from sera of advanced-stage cancer patients[J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 2012,889-890:3-9.

[10] Li YZ, Hu CJ, Leng XM,et al. Promising diagnostic biomarkers for primary biliary cirrhosis identified with magnetic beads and MALDI-TOF-MS[J]. Anat Rec (Hoboken), 2009,292(3):455-460.

[11] Kanmura S, Uto H, Sato Y,et al. The complement component C3a fragment is a potential biomarker for hepatitis C virus-related hepatocellular carcinoma[J]. J Gastroenterol, 2010,45(4):459-467.

[12] Fan Y, Shi L, Liu Q,et al. Discovery and identification of potential biomarkers of papillary thyroid carcinoma[J]. Mol Cancer, 2009,8:79.

[13] Shi L, Zhang J, Wu P,et al. Discovery and identification of potential biomarkers of pediatric acute lymphoblastic leukemia[J]. Proteome Sci,2009,7: 7.

[14] Zhang Q, Wang J, Dong R,et al. Identification of novel serum biomarkers in child nephroblastoma using proteomics technology[J]. Mol Biol Rep, 2011,38(1):631-638.

[15] Liu C, Pan C, Shen J,et al. MALDI-TOF MS combined with magnetic beads for detecting serum protein biomarkers and establishment of boosting decision tree model for diagnosis of colorectal cancer[J]. Int J Med Sci, 2011, 8(1):39-47.

[16] Liu C. The application of SELDI-TOF-MS in clinical diagnosis of cancers[J]. J Biomed Biotechnol, 2011,2011:245821.

[17] Takano S, Yoshitomi H, Togawa A. Apolipoprotein C-1 maintains cell survival by preventing from apoptosis in pancreatic cancer cells[J]. Oncogene, 2008,27(20):2810-2822.

[18] Yang Y, Zhao S, Fan Y,et al. Detection and identification of potential biomarkers of non-small cell lung cancer[J]. Technol Cancer Res Treat, 2009, 8(6):455-466.

ScreeningandidentificationofspecificserumbiomarkersofParkinsondisease

ZHOU Ting1, LIU Chi-bo2, XU Xiao-hui1, LIANG Hai-yan1

(1DepartmentofNeurology,2DepartmentofClinicalLaboratory,TaizhouMunicipalHospitalAffiliatedtoTaizhouUniversitySchoolofMedicine,Taizhou318000,China.E-mail:dr_zhouting@yahoo.com.cn)

AIM: To screen the possible serum biomarkers of Parkinson’s disease.METHODSThe surface-enhanced laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (SELDI-TOF-MS) was used to screen the serum samples from 44 cases of Parkinson’s disease and 60 control subjects. The differentially expressed protein peaks were selected and isolated with high-performance liquid chromatography (HPLC), and processed with enzyme before analysis by liquid chromatography-mass spectrometry tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). The data mining was performed by Xcalibur program component BioWorks 3.2.RESULTSThree differentially expressed protein peaks were selected as potential serum biomarkers from the patients of Parkinson’s disease: the protein at 8 937m/zpeak showed significant increase (27.47±16.58 in Parkinson’s disease group, and only 5.01±3.47 in control group), and the proteins at 6 636 and 8 697m/zpeaks showed significant decreases (5.43±2.66 and 20.22±9.57, respectively, in Parkinson’s disease group, and 18.85±7.56 and 51.13±26.22, respectively, in control group). The proteins at 6 636, 8 697 and 8 937m/zpeaks were identified as apolipoprotein C-I, apolipoprotein C-III and complement 3a,respectively. Combined use of these 3 biomarkers effectively distinguished the subjects between Parkinson’s disease group and control group. The detection rate of the patients with Parkinson’s disease was 90.0% (27/30), and the detection rate of the healthy sibkects was 92.5% (37/40).CONCLUSIONThe apolipoprotein C-I, apolipoprotein C-III and complement component 3a identified as potential markers of Parkinson’s disease have diagnostic value in clinical application.

Parkinson disease; Proteome; Surface-enhanced laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry; Liquid chromatography-mass spectrometry tandem mass spectromery

R741.04

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.04.016

1000- 4718(2013)04- 0664- 06

2012- 08- 31

2013- 03- 04

臺(tái)州市市級(jí)科技資金資助項(xiàng)目(No.102KY11)

△通訊作者 Tel: 0576-88858166; E-mail: dr_zhouting@yahoo.com.cn