白藜蘆醇對高脂飲食去卵巢肥胖大鼠海馬組織腦源性神經營養因子水平的影響*

苗玉連, 武傳龍， 劉金波， 江 蓓， 張曉黎△

(山東大學齊魯醫院 1內分泌科， 2腎內科, 山東 濟南 250012)

白藜蘆醇對高脂飲食去卵巢肥胖大鼠海馬組織腦源性神經營養因子水平的影響*

苗玉連1, 武傳龍1， 劉金波1， 江 蓓2， 張曉黎1△

(山東大學齊魯醫院1內分泌科，2腎內科, 山東 濟南 250012)

目的探討去卵巢聯合高脂飲食誘導的肥胖大鼠海馬組織中腦源性神經營養因子(BDNF)、雌激素受體α (ERα)和雌激素受體β (ERβ) 表達的變化，同時觀察白藜蘆醇對這些改變的影響。方法50只3月齡雌性Wistar大鼠隨機分為5組：假手術普通飲食對照(C)組、假手術高脂飲食(H)組、單純去卵巢(O)組、去卵巢高脂飲食(O+H)組和白藜蘆醇(40 mg·kg-1·d-1)+去卵巢高脂飲食(O+H+R)組。3月后抽取股動脈血檢測血清雌二醇(E2)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量；實時熒光定量PCR法檢測海馬BDNF、ERα和ERβ mRNA表達，蛋白免疫印跡法及ELISA法分別檢測海馬BDNF蛋白含量。結果與C組比較，H組大鼠血清TC和LDL-C含量升高，海馬BDNF水平顯著降低(P<0.05或P<0.01)，O組大鼠血清E2水平降低，TC含量升高，海馬BDNF 水平及ERα、ERβ mRNA表達均明顯下降(P<0.05或P<0.01)；O+H組大鼠血清TC含量升高，HDL-C水平降低，海馬BDNF 水平降低，與C組、H組和O組比較均有顯著差異(P<0.05或P<0.01)，海馬ERα和ERβ mRNA表達下降，與C組和H組比較差異顯著(P<0.05或P<0.01)；O+H+R組大鼠血清E2水平升高，TC含量降低，海馬ERα和ERβ mRNA表達水平及BDNF含量均明顯增加，與O+H組比較有顯著差異(P<0.05或P<0.01)。結論去卵巢聯合高脂飲食顯著降低大鼠海馬ERα和ERβ mRNA表達及BDNF水平，而白藜蘆醇能夠明顯改善絕經后肥胖大鼠的血脂水平，上調海馬ERα和ERβ mRNA表達，增加海馬BDNF水平。

卵巢切除術； 高脂飲食； 肥胖； 海馬； 腦源性神經營養因子

絕經后女性人群，雌激素水平降低，脂代謝發生紊亂，大量脂肪沉積，容易出現肥胖或有肥胖傾向[1]。肥胖是認知缺陷的獨立危險因素，肥胖個體認知功能下降[2]。研究發現去卵巢或長期給予高脂飲食的肥胖動物均出現認知功能的下降，同時伴有海馬區神經元相應的病理學改變，而這些缺陷與海馬腦源性營養性神經因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)水平的下降密切相關[3-7]。白藜蘆醇是一種植物雌激素，具有調節脂代謝及神經保護的作用[8]。動物研究證實白藜蘆醇能夠改善高脂飲食誘導的肥胖大鼠認知功能的缺陷[9],增加海馬BDNF的表達[10]，但白藜蘆醇對去卵巢聯合高脂飲食大鼠海馬組織BDNF水平的影響及機制尚不清楚。本實驗采用高脂喂養去卵巢大鼠的方法復制絕經后肥胖模型，通過觀察各組大鼠血清中血脂水平、海馬雌激素受體α(estrogen receptor α, ERα)、雌激素受體β(estrogen receptor α, ERβ)和BDNF mRNA 的表達水平及BDNF蛋白含量等指標的變化，探討白藜蘆醇對絕經后肥胖大鼠海馬組織BDNF水平的影響及機制。

材 料 和 方 法

1動物

健康3月齡Wistar雌性大鼠50只，體重(200±12)g，由山東大學實驗動物中心提供。動物飼料分為去豆類普通飼料和高脂飼料，其中高脂飼料成分為：78.9%基礎飼料，1%膽固醇，0.1%膽酸鹽，10%黃粉，10%豬油，均購于北京科奧協力飼料有限公司，質量合格證：SCXK(京)2009-0012。

2主要試劑

白藜蘆醇購于Sigma；大鼠雌二醇(estradiol, E2)放免試劑盒購于天津九鼎醫學生物工程有限公司；蛋白酶抑制劑混合物cocktail為Amresco產品；BCA蛋白濃度測定試劑盒購于上海碧云天公司；兔抗大鼠BDNF抗體購于Abcam，小鼠抗大鼠β-actin抗體和HRP 標記的Ⅱ抗均購于中杉金橋公司；RNAiso Plus、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser和SYBR Premix EX TaqTM均為TaKaRa產品；大鼠BDNF ELISA試劑盒購于北京科盈美生物科技有限公司；其余試劑均為國產分析純；所用引物由濟南博尚生物技術有限公司根據設計合成，見表1。

表1 引物序列

3方法

3.1動物處理 50只Wistar雌鼠分籠適應性喂養7 d，喂養環境：相對濕度為45%～60%，溫度為22 ℃～26 ℃，每天給予12 h(7：00～19：00)光照，12 h(19：00～次日7：00)黑暗。7 d后按體重隨機分成5組，每組10只：假手術普通飲食對照(C)組、假手術高脂飲食(H)組、單純去卵巢(O)組、去卵巢高脂飲食(O+H)組和白藜蘆醇+去卵巢高脂飲食(O+H+R)組。各組大鼠手術前禁食12 h, 0.3%戊巴比妥鈉溶液(1 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，俯臥位固定、備皮、消毒，無菌操作行雙側卵巢切除術，C組和H組大鼠僅切除雙側卵巢周圍少量脂肪組織(體積與卵巢相近)。

3.2飼料喂養與藥物干預方法 C組及O組給予去豆類普通飼料，其余3組均給予足量的去豆類高脂飼料，自由飲水。去卵巢手術后7 d，白藜蘆醇干預組給予1%羧甲基纖維素鈉溶液配制的白藜蘆醇混懸液(40 mg·kg-1·d-1)灌胃，其余4組給予相應劑量的1%羧甲基纖維素鈉溶液灌胃。每周稱量體重，根據大鼠體重變化調整用藥劑量，連續喂養3個月。

3.3標本采集 3個月后，排除手術或感染等因素死亡的大鼠，每組剩余大鼠7～9只，在末次灌藥并禁食12 h后，稱量體重，0.3%戊巴比妥鈉溶液(1 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，完全麻醉大鼠后取股動脈血5 mL, 3 000 r/min 4 ℃離心15 min ,取上清分裝于相對無菌的EP管中，-80 ℃冰箱保存。相對無菌條件下，在冰上將大鼠開顱取腦，迅速分離兩側海馬組織，放于無菌凍存管中，液氮保存。

3.4大鼠血清E2、總膽固醇(total cholesterol, TC)、甘油三酯(triglyceride, TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol, HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C)含量測量方法 放免法檢測血清E2水平；酶光度比色法測定血清中TC和TG含量；直接測定法檢測血清LDL-C和HDL-C水平。

3.5海馬組織勻漿蛋白提取及蛋白濃度測定 右側海馬組織稱重后移入新的EP管中，加入相應體積PBS稀釋的蛋白酶抑制劑混合物cocktail，充分研磨后冰上靜置30 min，在12 000 r/min 4 ℃離心20 min，取上清分裝到新的EP管中，抽取其中1 μL按BCA蛋白濃度測定試劑盒實驗操作說明進行操作，用酶標儀檢測吸光值，計算海馬組織蛋白濃度；取蛋白樣品200 μL按1∶4比例加入5×LB上樣緩沖液于100 ℃煮沸變性10 min，-20 ℃保存用于蛋白免疫印跡法檢測BDNF蛋白含量，其余-80 ℃條件保存用于ELISA法檢測 BDNF蛋白含量。

3.6蛋白免疫印跡法檢測海馬中BDNF蛋白含量 取出已變性的海馬組織蛋白，各孔分別加入20 μg蛋白樣品，電泳，轉膜，1× TBST配制的牛奶封閉液封閉1.5 h，1× TBST洗3 次，每次3 min,洗膜后分別加入小鼠抗大鼠β-actin單克隆抗體(1∶400)、兔抗大鼠BDNF抗體(1∶100)，4 ℃孵育過夜，1× TBST洗3 次，每次15 min, 洗膜后分別加入HRP 標記的Ⅱ抗(1∶10 000)，室溫孵育1 h，1× TBST洗3 次，每次15 min，ECL發光試劑盒化學發光顯色。

3.7ELISA 法檢測海馬組織中的BDNF蛋白含量 取各組大鼠海馬組織勻漿，按ELISA試劑盒說明書進行操作，酶標儀在450 nm處檢測吸光度。

3.8實時熒光定量PCR檢測海馬BDNF、ERα和ERβ mRNA表達 左側海馬組織稱重，按RNAiso Plus試劑盒說明書分離純化海馬組織中的總RNA，分光光度法測定并計算提取的總RNA濃度及含量(冰上進行)，參照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser實驗操作說明將提取的RNA在反轉錄儀器上進行反轉錄，總反應體積20.0 μL，將反轉錄好的cDNA于LightCycler? Real-Time PCR擴增儀上按操作說明書進行cDNA的擴增，擴增程序采用兩步法：預變性為95 ℃ 30 s，1個循環；之后95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，進行40個循環。PCR結束后，95 ℃ 0 s, 65 ℃ 15 s，95 ℃ 0 s，進行融解曲線分析。結果采用2-ΔΔCt方法分析。

4統計學處理

各組數據均以均數±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS 18.0統計軟件對各組實驗數據進行處理，多組間比較采用雙因素方差分析(Two-way ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1各組大鼠體重變化

圖1可見，實驗開始時，各組大鼠體重無顯著差異(P>0.05)，給予相應干預3個月后，與C組相比，H組大鼠體重增加不明顯(P>0.05)，而O組大鼠體重明顯增加(P<0.01)； O+H組高脂飲食聯合去卵巢大鼠體重明顯增加，與H組和O組分別比較均有顯著差異(均P<0.01)；與O+H組比較，去卵巢聯合高脂飲食大鼠給予白藜蘆醇干預后體重明顯降低(P<0.05)，但仍高于H組大鼠體重(P<0.01)。

Figure 1. Changes of the body weight of the rats in various groups. Mean±SD.n=7～9.

圖1各組大鼠體重變化趨勢

2各組大鼠血清E2水平

由表2可見，大鼠卵巢切除3月后，O組和O+H組大鼠血清E2水平與C組相比均明顯降低 (P<0.01)；但白藜蘆醇干預(O+H+R)組大鼠E2水平較O+H組明顯升高(P<0.05)，且與H組相比差異無統計學意義(P>0.05)。

3各組大鼠血脂水平的變化

由表2可見，高脂飲食或(和)去卵巢大鼠血清中TC含量均顯著增高(H組、O組和O+H組vsC組，均P<0.01)；O+H組去卵巢大鼠給予高脂飲食后TC顯著升高，與O組和H組比較均有顯著差異(均P<0.01)；給予白藜蘆醇干預后，O+H+R組大鼠血清中TC含量比O+H組明顯降低(P<0.01)。去卵巢不增加LDL-C水平(O組vsC組，P>0.05；O+H組vsH組，P>0.05)，而高脂飲食卻明顯增加血清LDL-C水平(H組vsC組，P<0.01；O+H組vsO組，P<0.01)；但白藜蘆醇并不降低高脂喂養去卵巢大鼠血清中LDL-C含量(P>0.05vsO+H組)。去卵巢明顯增加大鼠血清HDL-C水平，與C組比較均有顯著差異(O組vsC組，P<0.01；O+H組vsH組，P<0.01)；而且去卵巢聯合高脂飲食大鼠給予白藜蘆醇干預后血清中HDL-C含量較O+H組明顯升高(P<0.01)。各組大鼠血清TG水平無顯著差異(P>0.05)。

表2 各組大鼠血清E2及血脂含量變化

*P<0.05，**P<0.01vscontrol (C) group;##P<0.01vssham operation plus high-fat diet (H) group;▲▲P<0.01vsovariectomy plus normal diet (O) group;△P<0.05,△△P<0.01vsovariectomy plus high-fat diet (O+H) group.

4各組大鼠海馬組織ERαmRNA的表達

由圖2可見，去卵巢大鼠海馬組織中ERα mRNA的表達明顯低于假手術組(O組vsC組，P<0.05；O+H組vsH組，P<0.05)，而高脂飲食并不影響ERα mRNA在大鼠海馬組織的表達(H組vsC組，P>0.05；O+H組vsO組，P>0.05)；給予去卵巢聯合高脂喂養大鼠白藜蘆醇干預3月后，海馬中ERα mRNA的表達明顯增加，與O+H組相比有顯著差異(P<0.05)。

Figure 2. Changes of ERα mRNA expression in hippocampus. Mean±SD.n=7～9.*P<0.05vscontrol (C) group;#P<0.05vssham operation plus high-fat diet (H) group;△P<0.05vsovariectomy plus high-fat diet (O+H) group.

圖2各組大鼠海馬組織中ERαmRNA的表達

5各組大鼠海馬組織ERβmRNA的表達

由圖3可見，與ERα mRNA表達的變化相似，高脂飲食并不改變大鼠海馬組織ERβ mRNA的表達 (H組vsC組，P>0.05；O+H組vsO組，P>0.05)；而去卵巢卻明顯降低大鼠海馬組織中ERβ mRNA的表達水平(O組vsC組，P<0.01；O+H組vsH組，P<0.01)；但是白藜蘆醇干預3月后，大鼠海馬中ERβ mRNA的表達明顯增加，與O+H組相比有顯著差異(P<0.05)。

Figure 3. Changes of ERβ mRNA expression in hippocampus. Mean±SD.n=7～9.**P<0.01vscontrol (C) group;##P<0.01vssham operation plus high-fat diet (H) group;△P<0.05vsovariectomy plus high-fat diet (O+H) group.

圖3各組大鼠海馬組織中ERβmRNA的表達

6各組大鼠海馬BDNFmRNA的表達

由圖4可見， H組和O組大鼠給予高脂飲食或去卵巢3個月后，海馬組織中BDNF mRNA的表達水平與C組比較均明顯降低(P<0.05，P<0.01)；而去卵巢聯合高脂飲食(O+H)組大鼠海馬BDNF mRNA的表達水平明顯低于單純高脂飲食(H)組與單純去卵巢(O)組，差異均有統計學意義(P<0.01，P<0.05)；與O+H組比較，白藜蘆醇明顯增加海馬BDNF mRNA的表達(P<0.01)。

Figure 4. Changes of BDNF mRNA expression in hippocampus. Mean±SD.n=7～9.*P<0.05,**P<0.01vscontrol (C) group;##P<0.01vssham operation plus high-fat diet (H) group;▲P<0.05vsovariectomy plus normal diet (O) group;△△P<0.01vsovariectomy plus high-fat diet (O+H) group.

圖4各組大鼠海馬組織中BDNFmRNA的表達

7各組大鼠海馬BDNF蛋白的含量

Western blotting與ELISA結果可見，與C組比較，H組和O組大鼠海馬組織中BDNF 蛋白水平均明顯降低(P<0.05，P<0.01)；O+H組高脂喂養聯合去卵巢大鼠海馬組織中BDNF 蛋白水平明顯降低，與H組和O組分別比較均有顯著差異(均P<0.01)；而給予去卵巢聯合高脂飲食大鼠白藜蘆醇干預3個月后，海馬組織BDNF 蛋白水平較O+H組大鼠明顯增加(P<0.05)，見圖5。

討 論

BDNF屬于神經營養因子家族中的成員之一，是突觸可塑性與記憶力形成過程的主要調節因子，具有維持神經元功能和再生修復及防治神經細胞退行性變的功能，大腦區域BDNF表達上調可抵御神經元的損傷，對神經元具有保護作用，而且海馬的BDNF能夠通過影響與阿爾茲海默病(Alzheimer disease, AD)相關的前膽堿能神經系統及突觸蛋白形成過程對學習記憶功能發揮一定的作用[11]。

近年研究證實，認知功能的降低與雌激素缺乏及高脂飲食存在一定的聯系，而這種聯系與海馬組織BDNF水平的改變有密切關系[3-7]，動物實驗表明，去卵巢大鼠空間記憶能力降低，同時伴有海馬BDNF水平的下降，而給予補充雌激素或植物雌激素后BDNF的降低得到糾正，大鼠的記憶能力改善[6]；高脂飲食誘導的肥胖大鼠海馬脂質代謝紊亂，誘發炎癥反應、氧化應激，引起BDNF的表達減少，降低海馬突觸的可塑性進而影響認知功能[5，7-8]。已證實，去卵巢或肥胖均會影響動物認知相關因子BDNF的改變，但2種因素聯合對大鼠海馬BDNF的影響未見報道，我們采用高脂喂養去卵巢大鼠的方法復制絕經后肥胖模型，實驗結果發現：去卵巢聯合高脂飲食組大鼠的體重顯著增加，出現高脂血癥，海馬組織中BDNF mRNA表達及蛋白水平明顯下降，說明高脂飲食聯合去卵巢可導致BDNF的降低，減弱對海馬的保護作用，提示失去雌激素保護后高脂飲食誘導的肥胖及代謝紊亂加重可能加劇大鼠海馬認知功能的損傷。但也有學者發現給予去卵巢小鼠高膽固醇飲食9周后，雌激素合成增加，海馬區膽堿能活性增加，小鼠空間認知能力提高[12]，這可能與高脂飼料中膽固醇含量的多少及喂養時間的長短有一定關系。與以往研究一致，我們也同樣發現：單純高脂飲食或單純去卵巢大鼠均出現高膽固醇血癥，海馬組織中BDNF mRNA表達及蛋白含量均有明顯下降，但我們還發現高脂飲食明顯增加大鼠血清LDL-C水平，而去卵巢卻不改變其含量。

Figure 5. Changes of BDNF protein expression in hippocampus.A: Western blotting; B: ELISA. Mean±SD.n=7～9.*P<0.05,**P<0.01vscontrol (C) group;##P<0.01vssham operation plus high-fat diet (H) group;▲▲P<0.01vsovariectomy plus normal diet (O) group;△P<0.05vsovariectomy plus high-fat diet (O+H) group.

圖5各組大鼠海馬組織中BDNF蛋白水平

白藜蘆醇是一種植物雌激素，具有類雌激素作用，近年來的研究提示白藜蘆醇可以增加AD大鼠海馬區淀粉樣β肽(amyloid beta-peptides，Aβ)的清除能力[13]，能夠通過抗氧化、抑制炎癥因子的產生等途徑誘導BDNF mRNA的表達起到神經保護的作用[9-10]。大腦是雌激素發生作用的重要靶器官，海馬存在大量的ERα和ERβ，提示雌激素受體可能與認知功能相關。雌激素受體基因缺失鼠的海馬突觸可塑性降低，出現記憶缺失，補充雌激素后，雌激素通過影響ERα和ERβ的表達改善大鼠認知功能[14]，且有研究報道海馬的雌激素受體與BDNF有廣泛的共表達[15]，提示雌激素受體與BDNF有一定的聯系。本研究結果也顯示：去卵巢明顯降低大鼠海馬組織ERα和ERβ mRNA的表達，同時伴有BDNF水平的降低，而給予白藜蘆醇干預3月后，發現高脂去卵巢大鼠E2水平升高，TC含量降低，海馬組織BDNF水平明顯升高，同時伴有海馬ERα和ERβ mRNA表達增加，提示白藜蘆醇增加高脂飲食去卵巢大鼠海馬BDNF水平的機制可能與上調ERα和ERβ mRNA的表達有關，但我們的結果還發現：高脂飲食可明顯降低假手術或去卵巢大鼠海馬組織BDNF水平，卻不影響海馬ERα和ERβ mRNA表達水平，提示大鼠海馬組織BDNF的水平可能還受ERα和ERβ之外其它途徑的影響，但海馬雌激素受體的改變對于雌激素缺乏引起BDNF的變化有一定的相關性。

綜上所述，高脂喂養去卵巢肥胖大鼠雌激素水平降低，脂代謝紊亂，海馬組織ERα、ERβ和BDNF mRNA的表達及BDNF蛋白含量降低；植物雌激素白藜蘆醇能夠升高去卵巢聯合高脂飲食大鼠血清E2水平，增加海馬組織BDNF的表達，其機制可能與降低大鼠體內膽固醇含量、減少海馬組織脂質沉積以及增加ERα、ERβ mRNA表達有一定的相關性，但其具體機制還需進一步探討。

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Effectofresveratrolonlevelofbrain-derivedneurotrophicfactorinhippocampusofobeseratsinducedbyovariectomyandhigh-fatdiet

MIAO Yu-lian1, WU Chuan-long1, LIU Jin-bo1, JIANG Bei2, ZHANG Xiao-li1

(1DepartmentofEndocrinology,2DepartmentofNephrology,QiluHospitalofShandongUniversity,Jinan250012,China.E-mail:sallyzh66@sina.com)

AIM: To explore the effects of resveratrol on the level of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) and the mRNA expression of estrogen receptor α (ERα) and estrogen receptor β (ERβ) in hippocampus of obese rats induced by ovariectomy and high-fat diet.METHODSFifty female Wistar rats, aged 3 months, were randomly divided into 5 groups: control (C) group, sham operation plus high-fat diet (H) group, ovariectomy plus normal diet (O) group, ovariectomy plus high-fat diet (O+H) group, and ovariectomy plus high-fat diet and treated with resveratrol (40 mg·kg-1·d-1) (O+H+R) group. Three months later, the blood was collected from the femoral artery to detect the serum concentrations of total cholesterol (TC), triglyceride (TG), high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C), low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C) and estradiol (E2). The mRNA expression of ERα, ERβ and BDNF in the hippocampus was determined by real-time PCR. The protein level of BDNF in hippocampal tissues was detected by ELISA and Western blotting.RESULTSCompared with C group, the serum levels of TC and LDL-C in H group were increased, and the hippocampal level of BDNF was decreased. The rats in O group had higher concentration of serum TC, and lower levels of serum E2and the mRNA expression of ERα, ERβ and BDNF in the hippocampus than those in C group. Compared with C,H and O groups, the level of serum TC was higher, and the level of serum E2and the expression of BDNF in the hippocampus was lower in O+H group. The mRNA expression of ERα and ERβ in hippocampus was also reduced as compared with C group and H group. After treated with resveratrol, the rats in O+H+R group showed lower level of serum TC, and higher levels of serum E2, hippocampal BDNF and mRNA expression of ERα and ERβ than those in O+H group.CONCLUSIONOvariectomy combined with high-fat diet decreases the mRNA expression of ERαand ERβ and the level of BDNF in the rat hippocampus. Resveratrol improves the blood lipid metabolism and up-regulates the mRNA expression of ERα/ERβ and the level of BDNF in the hippocampus in obese rats induced by ovariectomy and high-fat diet.

Ovariectomy; High-fat diet; Obesity; Hippocampus; Brain-derived neurotrophic factor

R285

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.04.017

1000- 4718(2013)04- 0670- 06

2012- 11- 08

2013- 01- 31

山東省優秀中青年科學家科研獎勵基金資助項目(No.BS2009YY038)；山東大學自主創新基金資助項目(No.2012TS162)；山東大學自主創新基金資助項目(No.2012TS204)

△通訊作者 Tel: 0531-82169462; E-mail: sallyzh66@sina.com