臍血與成人外周血粒細胞Toll樣受體表達的比較*

劉 俊, 吳 瑕, 陳智聰, 廖繼東△, 谷景義, 楊曉蕾, 柳國勝, 吳 慧, 李揚秋

(暨南大學 1醫學院田家炳醫學實驗中心， 2第一臨床醫院, 3醫學院血液病研究所，廣東 廣州 510632)

臍血與成人外周血粒細胞Toll樣受體表達的比較*

劉 俊1, 吳 瑕2, 陳智聰1, 廖繼東1△, 谷景義1, 楊曉蕾1, 柳國勝2, 吳 慧2, 李揚秋3

(暨南大學1醫學院田家炳醫學實驗中心，2第一臨床醫院,3醫學院血液病研究所，廣東 廣州 510632)

目的比較臍血與成人外周血粒細胞Toll樣受體(TLRs)的表達情況，為新生兒相關疾病的臨床治療積累實驗資料。方法取臍血和成人外周血，用密度梯度離心結合紅細胞裂解法分離、收集粒細胞，流式細胞術鑒定粒細胞純度，RT-qPCR檢測TLRs 10個成員的mRNA表達水平，流式細胞術測定部分TLRs的蛋白熒光強度。結果(1)流式細胞術檢測結果：采用密度梯度離心結合紅細胞裂解法分離收集的臍血粒細胞CD19-CD24+為(95.66±1.73)%，CD3+為(4.27±1.22)%，成人外周血粒細胞CD19-CD24+為(95.48±2.13)%，CD3+為(4.82±1.07)%。(2)RT-qPCR結果顯示：臍血粒細胞和成人外周血粒細胞TLR1(0.141±0.091vs0.691±0.447)、TLR2(0.388±0.337vs0.901±0.508)、TLR4(0.093±0.071vs0.254±0.147)、TLR6(0.056±0.045vs0.202±0.034)、TLR7(0.001±0.001vs0.004±0.003)和TLR8(0.046±0.040vs0.211±0.146)的表達差異有統計學意義(P<0.01),TLR3、TLR5、TLR9和TLR10的表達差異無統計學意義(P>0.05)；其中TLR3、TLR7和TLR9在臍血和成人外周血粒細胞的相對表達水平均較低。(3)流式分析顯示臍血與成人外周血粒細胞TLR2平均蛋白熒光強度(21.40±3.09vs30.50±5.69)差異有統計學意義(P<0.05)；而TLR4平均蛋白熒光強度差異無統計學意義(P>0.05)。結論臍血粒細胞TLR1、TLR2、TLR4和TLR6 mRNA及TLR2蛋白表達低于成人外周血粒細胞，提示新生兒粒細胞識別細菌性病原微生物感染的能力可能存在缺陷或尚未完全成熟。這是否與新生兒急性細菌性毒血癥發病及病死率較高有直接聯系，有待進一步研究。

新生兒； 臍血； 粒細胞； Toll樣受體； 基因表達

新生兒的感染性疾病發病率及病死率較高，天然免疫和獲得免疫系統均未發育成熟是其主要原因。天然免疫系統是新生兒時期的主要保護屏障，粒細胞是主要的天然免疫功能細胞，在保護新生兒免受細菌等病原微生物的感染中起著重要作用[1-2]。新生兒粒細胞數量不足以及功能缺陷是導致新生兒細菌性敗血癥死亡的主要內因[3-4]。Toll 樣受體(Toll-like receptors， TLRs) 是天然免疫受體超家族中重要一員，可識別病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMP)結構，啟動天然免疫應答和誘發調節獲得免疫[5-6]。TLRs是粒細胞重要功能受體之一[7]。Prince等[8]發現除TLR3和TLR7外，TLRs家族成員在中性粒細胞均有表達。本研究對臍血與成人外周血粒細胞TLRs家族所有成員的基因表達水平進行全面的對比分析，為新生兒天然免疫狀況研究及相關疾病的臨床治療提供第一手實驗資料。

材 料 和 方 法

1材料

取暨南大學附屬第一醫院婦產科分娩的胎齡介于37～42周、體重介于2.5～4.0 kg間的正常新生兒17例，其中男10例，女7例，均征得產婦及家屬的同意，其母在妊娠期無原發性高血壓、冠心病、糖尿病、甲狀腺疾病史、急慢性腎炎以及腫瘤等內外科合并癥和妊娠并發癥，無酗酒吸煙、吸毒等不良嗜好；剔除因任何疾病出生3 d內需轉新生兒病房的新生兒；成人外周血13例，取自正常自愿者，最小年齡23歲，最大年齡54歲，中位年齡30歲，男6例，女7例。

2方法

2.1血液樣本 采用2 mL EDTA-K2真空抗凝管收集，血量為4～6 mL，儲存于4 ℃冰箱，并在1 d之內進行樣本的處理。

2.2粒細胞分離與收集 采用淋巴細胞分離液(購自北京達科為生物技術有限公司)與紅細胞裂解液[9]分離收集粒細胞。

2.3RT-PCR

2.3.1細胞總RNA提取與鑒定 RNA提取方法按天根RNAsimple Total RNA Kit說明書操作；取2 μL用微量核酸定量儀(Thermo)檢測RNA純度以及濃度。

2.3.2引物設計與合成 根據GenBank數據庫，由Oligo 7.0設計，并用NCBI Primer-BLAST分析引物特異性滿足要求之后由上海英維捷基貿易有限公司合成，所有引物均經過PCR擴增產物測序，Vector NTI比對分析驗證證實合格，引物序列見表1。

表1 TLR1～TLR10 PCR引物序列

2.3.3cDNA合成 按東洋紡ReverTra Ace qPCR RT Kit操作指南進行。

2.3.4PCR 根據美津生物2×Taq MasterMix配置PCR反應體系，在PCR儀(東勝創新)上以94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，61 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，共35個循環。收集產物，取5 μL進行瓊脂糖凝膠電泳(2%)，觀察條帶大小與預期值是否一致，剩余產物送至北京六合華大基因科技股份有限公司進行測序，測序結果用Vector NTI進行比對分析。選取擴增片段序列與目標序列一致的引物作為樣本分析用引物。

2.3.5RT-qPCR 根據東洋紡THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix配置PCR反應體系，在熒光定量PCR儀(Bio-Rad PTC-200)上以95 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，61 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，讀板，共45個循環。觀察擴增動力學曲線和熔解曲線，用2-ΔΔCt方法進行相對定量，計算得出目的基因相對于管家基因GAPDH的量。

2.4流式細胞術檢測細胞標志物和TLR2和TLR4表達量 取上述分離收集的細胞，采用流式細胞儀(FACScan，Becton Dickinson)檢測細胞表面抗原CD3、CD19和CD24；對臍血和成人外周血粒細胞進行TLR2和TLR4蛋白表達量檢測，檢測結果以平均熒光強度表示。

3統計學處理

用SPSS 13.0統計軟件進行分析。數據用均數±標準差(mean±SD)表示，檢驗方差齊性，采用兩組樣本t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1粒細胞流式細胞術檢測結果

臍血粒細胞CD19-CD24+為(95.66±1.73)%，CD3+為(4.27±1.22)%，成人外周血粒細胞CD19-CD24+為(95.48±2.13)%，CD3+為(4.82±1.07)%，見圖1。CD19-CD24+細胞數均達到95%以上，且CD3+細胞率均低于6%，顯示采用密度梯度離心結合紅細胞裂解的方法分離獲得了較高純度的粒細胞。

Figure 1. The flow cytometry results of granulocytes from umbilical cord blood (A,C) and adult peripheral blood (B,D).

圖1臍血和成人外周血粒細胞流式細胞術檢測結果

2RT-PCR產物電泳分析結果

RT-PCR產物凝膠電泳結果見圖2，結果顯示TLR1～TLR10和GAPDH的目的條帶單一清晰且與預期值相符。

Figure 2. The agarose gel electrophoretogram of TLR1～TLR10 and GAPDH PCR products. 1：TLR1；2：TLR2；3：TLR3；4：TLR4；5：TLR5；6：TLR6；7：TLR7；8：TLR8；9：TLR9；10：TLR10；11：GAPDH; M：marker.

圖2TLR1～TLR10和GAPDHPCR產物的瓊脂糖凝膠電泳圖

3臍血與成人外周血粒細胞TLRs

RT-qPCR結果顯示，臍血粒細胞和成人外周血粒細胞TLR1(0.141±0.091vs0.691±0.447)、TLR2(0.388±0.337vs0.901±0.508)、TLR4(0.093±0.071vs0.254±0.147)、TLR6(0.056±0.045vs0.202±0.034)、TLR7(0.001±0.001vs0.004±0.003)和TLR8(0.046±0.040vs0.211±0.146)的表達差異有統計學意義(P<0.01),TLT3、TLT5、TLR9和TLR10的表達差異無統計學意義(P>0.05)；其中TLR3、TLR7和TLR9在臍血和成人外周血粒細胞的相對表達水平均較低，見圖3。

Figure 3. The comparison of TLR1～TLR10 mRNA expression in granulocytes from umbilical cord blood and adult peripheral blood.Mean±SD.**P<0.01vsadult group.

圖3臍血與成人外周血粒細胞的TLR1～TLR10mRNA表達量比較

4流式細胞術檢測TLR2和TLR4蛋白熒光強度結果

臍血與成人外周血粒細胞TLR2和TLR4的平均蛋白熒光強度見表2。臍血粒細胞TLR2和TLR4的平均蛋白熒光強度均低于成人外周血粒細胞，且兩者間TLR2的平均蛋白熒光強度差異有統計學意義(P<0.05)。

討 論

新生兒的感染性疾病發病率及病死率較高，先天免疫和獲得免疫系統均未成熟是其主要原因。先天免疫系統是新生兒時期的主要保護屏障，粒細胞是先天免疫系統最豐富的細胞，是急性炎癥反應的最終效應細胞，在清除外來病原體的過程中起著至關重要的作用。它們還參與先天和獲得免疫細胞的激活和調節過程。在包括細胞內病原體引起的感染、自身免疫性疾病、慢性炎癥和癌癥等疾病的發病機制中起著關鍵性作用。因此，粒細胞在保護新生兒免受細菌性病原微生物的感染中起著重要作用[1-2, 7]。然而新生兒粒細胞存在數量不足以及功能缺陷，這是導致新生兒細菌性敗血癥死亡的主要因素之一[3-4]。

表2臍血與成人外周血粒細胞TLR2和TLR4的平均蛋白熒光強度

Table 2. The mean protein fluorescence intensity of TLR2 and TLR4 in granulocytes from umbilical cord blood and adult peripheral blood (mean±SD)

GroupnTLR2TLR4Neonate1721.40±3.09*23.04±4.11Adult1330.50±5.6929.16±5.81

*P<0.05vsadult group.

我們采用隨機抽取法從華僑醫院婦產科收集17例正常足月新生兒的臍血和13例正常成人自愿者外周血，按指引提取合格粒細胞并提取RNA和合成cDNA后進行各基因檢測分析。所用的RT-PCR引物經擴增產物測序，Vector NTI比對分析驗證證實合格，保證后續RT-qPCR分析臍血與成人外周血粒細胞TLRs家族成員的基因表達情況的可信性。用流式細胞術檢測粒細胞TLR2和TLR4的平均蛋白熒光強度，有效避免因細胞蛋白提取過程中目標蛋白丟失而產生的實驗誤差。

TLRs是天然免疫受體超家族中一個極其重要的受體家族，表達于多種類型的組織細胞，能夠識別病原相關分子模式，啟動天然免疫應答，清除病原體并指導和調控獲得免疫。已知人類體細胞共存在10個TLRs家族成員，部分成員參與免疫細胞的調控[1, 10]。中性粒細胞上的TLRs與PAMPs及內源性配體結合后，可激活天然免疫反應，介導急性炎癥反應，直接殺傷入侵病原微生物[8]。研究發現新生兒胎齡越小，其臍血單個核細胞TLR2和TLR4水平越低，推測可能是新生兒天然免疫能力低下，易患細菌性敗血癥等嚴重感染性疾病的重要原因[11]。林桃等[12]研究顯示在新生兒敗血癥中隨著C反應蛋白升高，其外周血單個核細胞TLR2同步升高，兩者呈正相關，且均與發病的早晚有關。Wu等[13]發現TLR4在新生兒窒息導致腎臟缺血再灌注損傷時所激發的炎癥反應中起著關鍵作用。且 TLR4 的異常信號轉導可能是壞死性小腸結腸炎分子發病機制之一[14]。Liu等[15]研究表明當新生兒發生壞死性小腸結腸炎時，所有的 TLRs 均在 48 h內發生變化，早于小腸結腸的組織形態學變化。上述報道均以臍血單個核細胞或組織中的TLRs為研究對象，探討其表達變化與新生兒并發癥的關系。由于常用密度梯度離心法分離所得單個核細胞主要為T、B淋巴細胞以及單核細胞的混合體，且臍血單個核細胞的情況更為復雜，除淋巴、單核細胞外，還包含造血干細胞、間充質干細胞等幼稚的細胞組分[16-17]。已知這些細胞均可表達不同的TLRs家族成員[18-19]，對實驗結果的評判存在一定的干擾。新生兒以T、B淋巴細胞為主的獲得免疫體系相對于以粒細胞為主的天然免疫體系更為幼稚[1]。天然免疫是新生兒機體首要的或關鍵的屏障，與新生兒的健康休戚相關。

在本實驗中，我們以臍血粒細胞為研究對象，通過密度梯度離心結合紅細胞溶解獲取較高純度的粒細胞，較少的淋巴細胞污染，較好地規避造血干細胞、間充質干細胞等幼稚細胞的干擾，分析粒細胞整個Toll樣受體家族表達的情況。結果發現，TLRs所有家族成員基因的表達，無論在臍血還是成人外周血粒細胞均存在個體差異。TLR1、TLR2、TLR4和TLR6 mRNA在新生兒粒細胞中的表達明顯低于成人外周血粒細胞；且TLR2和TLR4蛋白表達檢測與Viemann等[20]檢測結果一致，顯示新生兒粒細胞TLR2表達低于成人，而TLR4差別無統計學意義。TLR2 能和TLR1或TLR6結合形成異質二聚體，可識別一部分革蘭陽性細菌的脂蛋白和磷壁酸、分支桿菌細胞壁、鉤端螺旋體的脂多糖LPS、酵母菌細胞壁以及少見的脂多糖等類配體[21]，它們的低下是否正是新生兒粒細胞不能全面和迅速地識別并清除上述病原體，從而導致病菌在血液中大量繁殖引起新生兒細菌性敗血癥的內在因素有待進一步探討；TLR3、TLR7、 TLR8和TLR9表達于細胞內，主要是對病毒核酸的監測和識別，TLR3 識別雙鏈RNA，而TLR7和TLR8 識別單鏈RNA，TLR9識別未甲基化的CG輔酶Ⅰ(CpG 序列)，調節細菌DNA 和某些病毒的反應[22-23]。我們的結果顯示TLR3、TLR7和TLR9 mRNA在臍血與成人外周血粒細胞中均低表達，而Prince等[8]發現中性粒細胞不表達TLR3和TLR7。低豐度的TLR3 和TLR7 mRNA是樣本中殘存的T、B細胞所致[18]，還是粒細胞表達低下？ 以及TLR3、TLR7和TLR9 mRNA的低表達是否與粒細胞主要針對細菌性病原微生物入侵的天然特性有關，有待進一步探討。

綜上所述，本研究發現臍血粒細胞與細菌性病原微生物成分識別相關的TLR1、TLR2、TLR4和TLR6 mRNA及TLR2蛋白表達低于成人外周血粒細胞，與新生兒，尤其是早產兒急性細菌性毒血癥發病及病死率較高的臨床表現一致，為新生兒相關疾病的臨床治療積累了實驗資料。因本實驗分離的粒細胞中仍殘存約5%的T細胞，仍有進一步提高樣本細胞純度的空間，以明確TLR3和TLR7 mRNA的表達情況。

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ComparisonofToll-likereceptorexpressioningranulocytesfromumbilicalcordbloodandadultperipheralblood

LIU Jun1, WU Xia2, CHEN Zhi-cong1, LIAO Ji-dong1, GU Jing-yi1, YANG Xiao-lei1, LIU Guo-sheng2, WU Hui2, LI Yang-qiu3

(1TinKa-pingCenterforMedicalExperiments,SchoolofMedicine,2theFirstClinicalHospital,3InstituteofHematology,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:tliaojd@jnu.edu.cn)

AIM: To compare the expression levels of Toll-like receptors (TLRs) in the granulocytes isolated from umbilical cord blood and adult peripheral blood.METHODSThe granulocytes in umbilical blood and adult peri-pheral blood were isolated by the method of density gradient centrifugation combined with red blood cell splitting. The purity of the cells was evaluated by flow cytometry. The mRNA expression levels of 10 TLRs were detected by RT-qPCR, and the protein levels of some TLRs were also tested by flow cytometry.RESULTSThe populations of CD19-CD24+cells and CD3+cells were (95.66±3.15)% and (4.19±1.54)% in neonatal granulocytes,respectively, and were (95.36±1.74)% and (4.30±0.96)% in adult granulocytes,respectively. The relative mRNA expression levels of TLRs in the granulocytes isolated from umbilical cord blood and adult peripheral blood were as follows: TLR1 0.141±0.091 and 0.691±0.447, TLR2 0.388±0.337 and 0.901±0.508, TLR4 0.093±0.071 and 0.254±0.147, TLR6 0.056±0.045 and 0.202±0.034, TLR7 0.001±0.001 and 0.004±0.003, and TLR8 0.046±0.040 and 0.211±0.146,and the diffe-rence had statistical significance (P<0.01). However, no difference in the expression levels of TLR3, TLR5, TLR9 and TLR10 between the neonatal and adult gra-nulocytes was observed (P>0.05). Among them, the mRNA expression of TLR3, TLR7 and TLR9 was at a low level in both neonatal and adult granulocytes. The protein level of TLR2 in adult gra-nulocytes (30.50±5.69) was higher than that in neonatal granulocytes (21.40±3.09,P<0.05).CONCLUSIONLow mRNA expression of TLR1, TLR2, TLR4 and TLR6, and low protein level of TLR2 in neonatal granulocytes indicate that the ability of recognizing bacterial pathogen by neonatal granulocytes may be defective or not yet fully mature.

Neonate; Umbilical cord blood; Granulocyte; Toll-like receptors; Gene expression

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.04.018

1000- 4718(2013)04- 0676- 06

2012- 12- 29

2013- 02- 26

廣東省產業技術研究與開發資金計劃項目(No.2010B031600107);廣東省自然科學基金資助項目(No.07005966)

△通訊作者Tel： 020-85225841; E-mail: tliaojd@jnu.edu.cn