血栓通注射液對LPS誘導的兔彌散性血管內凝血的拮抗作用*

黃振華， 朱瑋瑋， 林 熙， 祁潔珍， 邱鵬新， 陳家樹， 陳 琪

(1中山大學中山醫學院藥理學教研室，廣東 廣州 510080； 2暨南大學醫學院藥理學系，廣東 廣州 510632；3廣東省食品藥品檢驗所藥理室，廣東 廣州 510180)

血栓通注射液對LPS誘導的兔彌散性血管內凝血的拮抗作用*

黃振華1， 朱瑋瑋2， 林 熙2， 祁潔珍1， 邱鵬新1， 陳家樹1， 陳 琪3△

(1中山大學中山醫學院藥理學教研室，廣東 廣州 510080；2暨南大學醫學院藥理學系，廣東 廣州 510632；3廣東省食品藥品檢驗所藥理室，廣東 廣州 510180)

目的研究血栓通注射液對脂多糖(LPS)誘導的兔彌散性血管內凝血(DIC)的影響。方法對兔耳緣靜脈持續滴注LPS以建立兔DIC模型，記錄各組動物在24 h后的生存率；全自動血漿分析儀測定丙氨酸氨基轉移酶(ALT)和血尿素氮(BUN)；用全自動凝血分析儀檢測活化部分凝血活酶時間(APTT)和凝血酶原時間(PT)；用凝固法測定纖維蛋白原含量；全自動血細胞分析儀進行血小板計數；發色底物法測定蛋白C和抗凝血酶Ⅲ的活性；ELISA法檢測血漿中腫瘤壞死因子α(TNF-α)的含量。結果持續從兔耳緣靜脈滴注LPS后，DIC模型組動物大量死亡，ALT和BUN顯著升高，APTT和PT顯著延長，蛋白C和抗凝血酶Ⅲ的活性明顯降低，血小板計數明顯減少，血漿中TNF-α的含量顯著升高。注射血栓通注射液后，動物的死亡率明顯下降，ALT和BUN明顯下降，APTT和PT明顯縮短，血小板計數明顯上升，纖維蛋白原含量顯著提高，蛋白C和抗凝血酶Ⅲ活性明顯提升；血漿TNF-α的含量明顯降低。結論血栓通注射液對LPS所誘導的兔DIC有良好的拮抗作用。

血栓通注射液； 脂多糖類； 彌散性血管內凝血； 腫瘤壞死因子

彌漫性血管內凝血(disseminated intravascular coagulation, DIC)是由多種復雜病因引起的一種嚴重的獲得性、全身性血栓出血綜合征。 DIC在臨床上主要表現為凝血系統的激活、纖溶系統的紊亂、形成大量的微血栓和纖維蛋白沉積，嚴重的會導致出血、休克、嚴重損害器官、溶血等，大多數DIC起病急、發展快、預后兇險，若診斷和治療不及時，很容易危及患者的生命[1]。研究表明[2]，炎癥因子對DIC的形成和發病都起著促進的作用。目前臨床上主要運用肝素對DIC患者進行治療，然而有臨床研究顯示，采用肝素進行治療的作用并不確定，而且副作用較為明顯，容易引起出血的危險[3]。

血栓通是中藥三七的提取物，主要成分是由人參皂苷和三七皂苷等組成的三七總皂苷。具有活血化瘀、止血、促進纖溶能力、擴張冠狀動脈并增加其血流量的作用[4]。血栓通注射液在實驗和臨床都已經證實了具有抑制血小板和紅細胞的過度聚集，溶解血栓，并能抑制白細胞介素1(interleukin-1，IL-1)、IL-6、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)等的作用[5-6]。因此，血栓通注射液可能通過抑制血栓、溶栓以及抗炎等途徑而阻止DIC的發生和發展。但是目前未見血栓通注射液在防治DIC中的報道。

研究證實[7]，由脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)誘導的DIC 模型經過國內外眾多學者長時間的實驗，證明了此模型是類似于人體DIC的病變過程以及病理學的改變的，因而此模型典型而有效。本文以LPS誘導家兔產生DIC，主要通過觀察動物給藥后的凝血系統[活化部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time, APTT)、凝血酶原時間(prothrombin time, PT)、蛋白C、抗凝血酶Ⅲ(antithrombin Ⅲ, ATⅢ)和血小板(platelet, PLT)]、肝腎功能[血漿丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase, ALT)和血尿素氮(blood urine nitrogen, BUN)]、TNF-α等指標的變化，進而證實血栓通注射液能有效對抗LPS誘導家兔產生的DIC。

材 料 和 方 法

1動物

健康雄性新西蘭兔90只，體重2.0～2.5 kg，由廣東省醫學實驗動物中心提供，粵檢證字[SCXK(粵)2008-0002]。

2試劑及儀器設備

血栓通購于廣西梧州制藥集團股份有限公司，國藥準字Z45021769，規格：2 mL∶70 mg；LPS購買于Sigma；肝素購買于山東博士倫福瑞達制藥有限公司，國藥準字H20003094；HITACHI 7170全自動血漿分析儀(HITACHI)；Sysmex CA1500 + CA6000全自動血細胞分析儀(KOBE)；蛋白C和ATⅢ活性檢測試劑盒購于上海太陽生物技術公司；ELISA試劑盒(TNF-α)購于BD Biosciences。

3主要方法

3.1動物模型的建立 參照Hermida等[8]的方法，從家兔一側耳緣靜脈持續注射LPS誘導其產生DIC，家兔耳緣靜脈注射30 mg/kg 3%戊巴比妥鈉進行麻醉，分離右側頸動脈并插管，以備取血。把LPS溶解在60 mL的生理鹽水中，以100 mL/h的速度從家兔耳緣靜脈滴注，連續給藥6 h，建立家兔DIC模型。在給藥后的2 h、4 h進行戊巴比妥鈉腹腔注射以維持動物的麻醉狀態。

3.2動物分組 將家兔隨機分成6組，每組15只。(1) 正常對照組；(2) DIC模型組；(3) 低劑量血栓通注射液治療組；(4) 中劑量血栓通注射液治療組；(5) 高劑量血栓通注射液治療組；(6) 肝素對照組。

3.3給藥方法 (1) 正常對照組：從家兔兩側耳緣靜脈以10 mL/h的速度滴注生理鹽水，持續6 h。(2) DIC模型組：從家兔一側耳緣靜脈以10 mL/h的速度滴注LPS，同時從另一側耳緣靜脈以10 mL/h的速度滴注生理鹽水，持續6 h。(3) 肝素對照組：將肝素溶于60 mL的生理鹽水，從家兔一側的耳緣靜脈以10 mL/h的速度滴注LPS，同時從另一側耳緣靜脈以10 mL/h的速度滴注肝素(500 U/kg)，持續6 h。(4) 血栓通注射液治療組共3組：先將血栓通注射液溶于60 mL的生理鹽水中，從家兔一側耳緣靜脈以10 mL/h的速度滴注LPS，同時從另一側耳緣靜脈以10 mL/h的速度滴注血栓通注射液，持續6 h；低劑量組濃度為10 mg/kg，中劑量組濃度為20 mg/kg，高劑量組濃度為50 mg/kg。

3.4觀察指標和樣品的收集 在注射LPS前和注射LPS 2 h、6 h后分別從動脈取血1 mL，把含有約100 μL的枸櫞酸鈉抗凝藥分別溶入各時段的血液中，3 000 r/min離心10 min，提取血漿并保存在-20 ℃冰箱中。記錄24 h內各組動物的生存率；用HITACHI 7170全自動血漿分析儀測定血漿ALT以及BUN含量；用Sysmex CA1500 + CA6000全自動凝血分析儀檢測APTT、PT和纖維蛋白原含量；用Sysmex SE-9500全自動血細胞分析儀對PLT進行計數；用發色底物法測定血漿蛋白C和ATⅢ的活性；用ELISA試劑盒檢測TNF-α含量。

4統計學處理

數據以均數±標準差(mean±SD)表示。應用SPSS 13.0統計軟件對資料進行分析，以方差分析檢測各組均數差異，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1血栓通注射液對LPS誘導的DIC兔生存率的影響

DIC模型組24 h后的生存率為26.7%；血栓通注射液低、中、高3個劑量組在24 h后的生存率分別是33.3%、60.0%和66.7%；肝素組在24 h后生存率為66.7%，見圖1；中劑量組以及高劑量組血栓通注射液治療組的動物在24 h后的生存率比DIC模型組明顯升高(P<0.05)；正常對照組動物在24 h后的生存率為100%(圖中無顯示)。

Figure 1. Effect of Xueshuantong injection on survival rate of the rabbits with LPS-induced DIC.n=15.*P<0.05vsDIC group.

圖1血栓通注射液對LPS誘導的DIC兔生存率的影響

2血栓通注射液對LPS誘導的DIC兔凝血系統的影響

2.1APTT 和 PT DIC模型組動物在注射LPS 2 h和6 h后，APTT和PT與正常對照組相比都明顯延長(P<0.05)。 模型組APTT為(87.64±15.83)s和(130.45±13.68)s，PT為(8.64±1.29)s和(15.31±2.73)s。正常對照組APTT為(23.51±7.38)s和(23.02±6.45)s，PT為(6.51±1.21)s和(6.34±0.73)s,見表1。在注射血栓通注射液2 h以及6 h后，低、中、高3組劑量組APTT和PT都明顯下降(P<0.05)，見表1。

2.2血小板計數 DIC模型組動物在注射LPS 2 h和6 h后測得的PLT與正常對照組相比明顯下降(P<0.05)。DIC模型組為(153.27±20.46)×109/L和(120.37±20.43)×109/L，正常對照組為(336.27±25.18)×109/L和(332.62±26.39)×109/L。在血栓通注射液給藥2 h和6 h后，低、中、高 3個劑量組的PLT顯著升高(P<0.05)，見表1。

2.3纖維蛋白原含量 DIC模型組在注射LPS 6 h后，纖維蛋白原含量與正常對照組相比明顯降低(P<0.05)。DIC模型組為(2.57±0.19)g/L，正常對照組為(4.54±0.33)g/L，見表1。在血栓通注射液給藥6 h后，低、中、高3個劑量組的纖維蛋白原含量都明顯升高(P<0.05)，見表1。

2.4血漿蛋白C DIC模型組在注射LPS 2 h和6 h后，蛋白C的含量與正常對照組相比都明顯下降(P<0.05)。DIC模型組為(72.93±10.51)%和(52.87±14.94)%，正常對照組為(101.21±3.16)%和(100.87±5.32)%，見表1。在血栓通注射液給藥6 h后，低、中、高3個劑量組的纖維蛋白原含量測得分別是(69.34±8.13)%、(74.41±11.62)%和(77.63±5.29)%，與DIC模型組比較都明顯升高(P<0.05)，見表1。

2.5抗凝血酶Ⅲ活性 DIC模型組在注射LPS 2 h和6 h后，抗凝血酶Ⅲ的含量與正常對照組相比都顯著下降(P<0.05)。DIC模型組為(64.27±13.96)%和(43.73±10.50)%，正常對照組為(96.42±5.94)%和(99.73±3.63)%，見表1。在血栓通注射液給藥2 h后，中、高劑量組的含量與DIC模型組比較都明顯升高(P<0.05)，分別為(82.67±15.62)%和(87.32±12.13)%，見表1。在血栓通注射液給藥6 h后，低、中、高 3個劑量組的含量與DIC模型組比較都明顯升高(P<0.05)，分別為(74.53±8.37)%、(84.19±16.37)%和(84.66±10.97)%，見表1。

表1血栓通注射液對LPS誘導的兔DIC模型凝血系統的影響

Table 1. Coagulation parameters 2 and 6 h after LPS infusion into rabbits in different treatment groups(mean±SD.n=15)

GroupTime(h)APTT(s)PT(s)Platelets(×109/L)Fibrinogen(g/L)FDP(μg/L)ProteinC(%)ATⅢ(%)Normal223.51±7.38*6.51±1.21*336.27±25.18*4.21±0.13<0.05101.21±3.16*96.42±5.94*623.02±6.45*6.34±0.73*332.62±26.39*4.54±0.33*<0.05100.87±5.32*99.73±3.63*DIC287.64±15.838.64±1.29153.27±20.463.76±0.9254.70±10.8272.93±10.5164.27±13.966130.45±13.6815.31±2.73120.37±20.432.57±0.1975.36±12.7352.87±14.9443.73±10.50Xueshuantong Lowdose(10mg/kg)221.92±3.22*6.28±0.78*278.47±30.10*3.36±0.61*21.38±5.71*86.42±7.62*73.18±14.36628.56±6.07*6.73±1.19*205.16±32.63*3.08±0.24*24.27±6.89*69.34±8.13*74.53±8.37* Mediumdose(20mg/kg)220.63±5.18*5.92±0.42*315.12±37.34*3.99±0.15*18.74±3.67*87.36±10.58*82.67±15.62*623.81±3.98*6.38±1.07*303.24±25.85*3.87±0.39*22.82±9.12*74.41±11.62*84.19±16.37* Highdose(50mg/kg)226.54±4.21*6.54±0.34*343.19±36.13*3.66±0.74*16.38±4.21*85.94±7.48*87.32±12.13*629.15±3.69*7.12±1.56*321.71±28.12*3.35±0.45*18.63±3.39*77.63±5.29*84.66±10.97*Heparin229.36±3.75*6.84±0.33*320.91±31.77*2.91±0.98*36.87±6.42*70.84±10.6274.53±19.28647.38±5.73*7.73±0.41*263.31±22.36*2.68±1.0748.53±11.66*65.16±5.37*63.62±16.54*

*P<0.05vsDIC group.

3血栓通注射液對LPS誘導的DIC兔肝腎功能的影響

3.1對血漿ALT的影響 DIC模型組注射LPS后，2 h和6 h收集的血漿ALT與正常對照組相比明顯升高(P<0.05)；注射血栓通注射液后，2 h和6 h的ALT活性都比DIC模型組下降，隨著血栓通注射液劑量的升高，ALT的活性下降更為明顯(P<0.05)，見圖2。

Figure 2. Effect of Xueshuantong injection on the plasma level of ALT in LPS-induced DIC rabbits.Mean±SD.n=15.*P<0.05vsDIC group.

圖2血栓通注射液對LPS誘導的DIC兔血漿中ALT活性的影響

3.2對血漿BUN的影響 DIC模型組注射LPS后，2 h和6 h提取的血漿BUN與正常對照組相比明顯升高(P<0.05)；注射血栓通注射液后，2 h和6 h所收集血漿的BUN濃度都比DIC模型組下降，隨著血栓通注射液劑量的提升，BUN的濃度下降更為明顯(P<0.05)，見圖3。

4血栓通注射液對LPS誘導的DIC兔細胞因子的影響

在注射LPS 2 h后，血漿中的TNF-α含量顯著升高(P<0.05)，在6 h后TNF-α含量上升到最高值。模型組比正常對照組顯著升高(P<0.05)，見圖4。注射血栓通注射液后，血漿中的TNF-α含量明顯下降，而在給藥6 h后，中劑量及高劑量組中的TNF-α下降尤其顯著(P<0.05)。作為陽性對照組的肝素在給藥6 h后，血漿中的TNF-α含量也顯著降低(P<0.05)，見圖4。

5血栓通注射液對LPS誘導的DIC兔蛋白性微血栓的影響

在注射LPS后，血管中纖維蛋白性微血栓明顯增加，而分別注射低劑量、中劑量和高劑量的血栓通注射液后，微血栓明顯逐漸減少，中劑量組比低劑量組明顯減少，在高劑量組中幾乎沒有產生蛋白微血栓，見圖5。

Figure 3. Effect of Xueshuantong injection on the plasma level of BUN in LPS-induced DIC rabbits.Mean±SD.n=15.*P<0.05vsDIC group.

圖3血栓通注射液對LPS誘導的DIC兔血漿中BUN濃度的影響

Figure 4. Effect of Xueshuantong injection on the plasma level of TNF-α in LPS-induced DIC rabbits.Mean±SD.n=15.*P<0.05vsDIC group.

圖4血栓通注射液對LPS誘導的DIC兔血漿中TNF-α含量的影響

討 論

DIC是一種隱晦的并可以引起全身凝血系統紊亂的疾病，它可以造成組織或內皮的損傷，導致炎癥的釋放，誘發彌漫性微血栓的形成，甚至造成器官功能的損傷。DIC難以被發現，起病急，治療困難，因而危害極其嚴重[9]。

動物模型在注射LPS后，死亡率顯著上升。而在給藥中、高劑量組的血栓通注射液后，動物模型的死亡率明顯下降。提示血栓通注射液可能防治由LPS引起的DIC疾病。

Figure 5. Effect of Xueshuantong injection on fibrin microthrombi in LPS-induced DIC rabbits (fibrin staining,×400).

圖5血栓通注射液對LPS誘導的DIC兔血管中纖維蛋白性微血栓形成的影響

ALT主要存在于肝臟、心臟和骨骼肌中，當肝功能受到損害時，血液中的ALT酶就會升高。BUN主要經由腎小球濾過而隨尿排出，當腎功能受損害時，會導致腎小球濾過率降低，而令血濃度增加。因此，ALT和BUN是分別反映肝、腎損傷的重要實驗室指標，ALT和BUN的升高提示肝和腎可能受到了損害[10]。動物模型在注射LPS后，ALT和BUN顯著上升，表明動物的肝、腎可能受到嚴重損傷。而在注射血栓通注射液后，給藥組的ALT和BUN與LPS模型組相比均明顯下降，提示在DIC發生時，血栓通注射液有保護肝、腎的重要作用。

APTT是臨床上判斷是否缺乏外源性凝血因子的唯一指標，PT則是臨床上判斷患者是否缺乏內源性凝血因子的指標。APTT和PT在協助DIC 發生的預測、診斷、治療效果等方面具有重要的臨床意義[11]。動物模型在注射LPS后，APTT和PT都明顯延長，表明動物體內凝血因子被大量消耗。而在給藥血栓通注射液后，APTT和PT明顯縮短，提示凝血時間的縮短，止血功能得到恢復。

當凝血酶生成，大量的血小板聚集，血小板就會呈進行性減少，而免疫介導損傷等情況也常讓血小板急劇減少，故血小板是作為首選的DIC 診斷實驗室指標[12-13]。動物模型在注射LPS后，血小板因為DIC的產生而大量聚集，含量明顯下降。動物模型在注射血栓通注射液后，血小板的含量明顯升高，表明血栓通注射液能有效降低DIC導致的凝血反應，抑制血栓的形成，使凝血系統得到恢復。

蛋白C 和抗凝血酶Ⅲ是抗凝機制中兩個重要的抗凝調節蛋白。DIC發生時，凝血系統被激活，因而激活大量的凝血酶，抑制了蛋白C和抗凝血酶Ⅲ活性[14]。動物模型在注射LPS后，蛋白C的含量明顯下降，抗凝血酶Ⅲ的活性明顯降低。而在注射血栓通注射液后，動物模型的蛋白C和抗凝血酶Ⅲ都顯著升高，這可能是血栓通注射液的抗凝作用產生的結果。

促炎因子在DIC的發生與發展都起到促進的作用，TNF-α是DIC早期產生的一種炎癥因子，炎癥因子的產生會加速機體正常細胞的凋亡，減慢炎癥細胞的凋亡，從而進一步增強炎癥活動[6]。嚴重時能讓機體產生全身炎癥反應，誘導DIC的產生并促進其發展。動物模型在注射LPS后，TNF-α的含量明顯升高。在注射血栓通注射液后，TNF-α的含量與模型組比較明顯下降。這提示血栓通能夠減少炎癥因子，保護正常細胞并減慢其凋亡，從而對LPS誘導的兔DIC產生拮抗作用。

綜上所述，在注射LPS而誘導產生DIC的兔模型中，注射了血栓通注射液后，動物模型的死亡率明顯下降；ALT和BUN的含量顯著降低，動物的肝、腎功能得到保護；APTT和PT都明顯縮短，血小板的含量明顯升高，蛋白C和抗凝血酶Ⅲ的含量顯著升高，這些作用可能與血栓通注射液能夠減少凝血物質的消耗，阻止凝血系統活化相關；TNF-α的含量明顯減少，表明了血栓通注射液能夠抑制促炎因子產生，保護正常細胞。因此，血栓通注射液有良好的抗DIC作用，在DIC的預防與治療上有著良好的發展前景。

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EffectofXueshuantonginjectiononLPS-inducedDICinrabbits

HUANG Zhen-hua1, ZHU WEI-wei2, LIN Xi2, QI Jie-zhen1, QIU Peng-xin1, CHEN Jia-shu1, CHEN Qi3

(1DepartmentofPharmacology,ZhongshanSchoolofMedicine,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China;2DepartmentofPharmacology,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China;3Departmentofpharmacology,GuangdongInstituteforFoodandDrugControl,Guangzhou510180,China.E-mail:chenqi911@hotmail.com)

AIM: To evaluate the effect of Xueshuantong injection on lipopolysaccharide (LPS)-induced experimental disseminated intravascular coagulation (DIC) in rabbits.METHODSTo establish the LPS-induced DIC model, LPS was continuously injected into the rabbit autricular vein for 6 h. The survival rate of the rabbits was recorded after 24 h. The plasma levels of alanine aminotransferase (ALT) and blood urine nitrogen (BUN) were detected. Activated partial thromboplastin time (APTT), prothrombin time (PT), platelet count and fibrinogen concentration were measured. The activity of protein C, antithrombin Ⅲ (ATⅢ) and the concentration of tumor necrosis factor α (TNF-α) were also determined.RESULTSThe survival rate of DIC rabbits was only 26.7%. BUN and ALT increased obviously. APTT and PT became much longer, platelet count, fibrinogen, protein C and ATⅢ decreased obviously, and plasma TNF-α increased remarkably. The intravenous administration of Xueshuantong injection increased the survival rate of DIC rabbits up to 66.7% in a dose-dependent manner. Xueshuantong injection also decreased the plasma levels of BUN, ALT, APTT, PT and TNF-α significantly, while increased the levels of fibrinogen, platelet, protein C and ATⅢ in plasma.CONCLUSIONXueshuantong injection has therapeutic effect on LPS-induced DIC in rabbits.

Xueshuantong injection; Lipopolysaccharides; Disseminated intravascular coagulation; Tumor necrosis factor

R543.7

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.04.019

1000- 4718(2013)04- 0682- 06

2012- 10- 12

2013- 03- 11

國家自然科學基金資助項目(No. 81000209)；教育部科學技術研究重點項目(No. 210255)；暨南大學科研培育與創新基金資助項目(No. 21609304)

△通訊作者 Tel: 020-81853842; E-mail: chenqi911@hotmail.com