p38 MAPK抑制劑SB203580對雨蛙肽誘導的小鼠胰腺組織損傷的影響*

徐 菁， 曹明華， 馮雅靜， 李 琨， 張一真， 李永渝

(同濟大學醫(yī)學院病理生理教研室，同濟大學消化系統(tǒng)疾病研究所，上海 200092)

p38 MAPK抑制劑SB203580對雨蛙肽誘導的小鼠胰腺組織損傷的影響*

徐 菁， 曹明華， 馮雅靜， 李 琨， 張一真， 李永渝△

(同濟大學醫(yī)學院病理生理教研室，同濟大學消化系統(tǒng)疾病研究所，上海 200092)

目的探討p38 MAPK抑制劑SB203580(SB)對雨蛙肽(caerulein，CAE)誘導的小鼠離體胰腺組織損傷的影響，并探討其可能的機制。方法分離小鼠離體胰腺組織后培養(yǎng)4 h，用CAE(10-5mol/L)刺激，加用或不加用SB (10-5mol/L)進行干預，以生理鹽水(NS)作為對照。在刺激1 h和4 h后測定胰腺組織活力(MTT)、培養(yǎng)上清液中淀粉酶和脂肪酶活性(生化法)以及白細胞介素6(IL-6)和細胞因子誘導的中性粒細胞趨化因子1(CINC-1)的水平(ELISA法)；同時測定胰腺組織中熱休克蛋白60(HSP60)和HSP70蛋白水平(ELISA法)，并用Western blotting測定胰腺組織p38及磷酸化p38 (p-p38)MAPK蛋白的表達。結(jié)果CAE刺激后胰腺組織活力與NS組比較有所下降，尤其在刺激后4 h明顯降低(P<0.05)；CAE刺激后1 h，離體胰腺組織培養(yǎng)上清液中淀粉酶、脂肪酶、IL-6和CINC-1水平較NS組均明顯升高(P<0.05)；胰腺組織中HSP60、HSP70、p38及p-p38 MAPK蛋白的表達較NS組有所升高(P<0.05)，而SB可不同程度干預CAE引起的這些指標的改變。結(jié)論CAE對離體胰腺組織具有損傷作用，SB可減輕CAE造成的胰腺組織的損傷，其機制可能與其對p38 MAPK抑制進而使炎癥反應受到抑制有關；HSP60和HSP70的變化是因為炎癥反應減輕而使細胞應激程度降低所致，還是失去了p38 MAPK的調(diào)控作用所致，還有待進一步研究。

胰腺； p38 MAPK信號通路; 雨蛙肽

p38 絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase, p38 MAPK)信號通路在炎癥、細胞分化、細胞凋亡、應激反應方面發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[1]。p38 MAPK最初作為脂多糖(lipopolysaccha-rides, LPS)刺激產(chǎn)生的酪氨酸磷酸蛋白而被鑒定出[2]，與其它MAPK信號通路相同，p38 MAPK信號通路也是由一套進化上保守、順序激活的三級激酶組成[3]。各種細胞外刺激,包括紫外線、生長因子、細胞因子、炎癥介質(zhì)和G蛋白偶聯(lián)受體的配體等均可激活p38 MAPK[4]。活化后的p38 MAPK可以入核，激活多種轉(zhuǎn)錄因子，進而調(diào)節(jié)各種細胞因子的表達以及細胞凋亡。此外，p38 MAPK還能激活細胞內(nèi)的一些蛋白激酶，進而激活低分子量的熱休克蛋白，參與細胞應激反應[5]。SB203580(SB)是p38 MAPK的特異性抑制劑，許多研究表明它可以抑制炎癥性疾病時的炎癥介質(zhì)的表達[6]。本實驗通過觀測SB對雨蛙肽(caerulein，CAE)誘導的小鼠離體胰腺組織損傷的影響，探討p38 MAPK信號通路是否參與了該病理過程及其可能的作用機制。

材 料 和 方 法

1動物及分組

體重18～22 g C57BL小鼠20只，雌雄各半，購自第二軍醫(yī)大學實驗動物中心。實驗前小鼠禁食不禁水16 h，隨機將小鼠分為4組(每組小鼠5只)：生理鹽水對照組(NS組)、CAE處理組(CAE組)、單用SB組(SB組)及CAE+SB組。

2小鼠胰腺組織塊的分離和培養(yǎng)

參照Jaffrey等[7]的方法，在無菌條件下，將小鼠斷頸處死，迅速取出胰腺組織，將其放入HEPES緩沖液中，仔細清除組織上的血管、系膜及脂肪，再用HEPES緩沖液清洗2遍。將胰腺組織放入1 mL培養(yǎng)液中剪碎至直徑小于0.5 mm×0.5 mm×0.5 mm碎片，靜置1 min，棄上清，加入新鮮培養(yǎng)液12 mL，混勻后均勻分到24孔培養(yǎng)板上并置于5%CO2培養(yǎng)箱(Thermo Electron)培養(yǎng)。

3小鼠胰腺組織刺激后各項指標的檢測

根據(jù)前期的實驗結(jié)果[8]，胰腺組織塊在培養(yǎng)48 h過程中存活狀況及功能狀況良好，此次實驗選取基礎培養(yǎng)4 h后的胰腺組織，用藥物進行刺激，CAE終濃度10-5mol/L[8]，SB終濃度 10-5mol/L[6]，并以NS組作為對照。在藥物刺激后1 h、4 h分別收胰腺組織和培養(yǎng)上清，對以下指標進行檢測。

3.1胰腺組織活力的檢測 用四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢測(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)，同時用蛋白定量試劑盒(BCA，碧云天生物技術研究所)測定胰腺組織中的蛋白量，計算得出每毫克組織蛋白的組織活力，以此來判斷組織損傷情況。

3.2檢測組織培養(yǎng)上清液淀粉酶、脂肪酶、白細胞介素6(interleukin-6, IL-6)和細胞因子誘導的中性粒細胞化學趨化因子1(cytokine-induced neutrophil chemoattractant 1, CINC-1)的水平 淀粉酶和脂肪酶活性按照相關生化試劑盒(南京建成生物科技有限公司)說明書介紹的步驟檢測。IL-6和CINC-1水平按照相關ELISA試劑盒(R&D)說明書介紹的步驟檢測。

3.3胰腺組織中熱休克蛋白60(heat-shock protein 60，HSP 60)和HSP70水平的檢測 HSP60和HSP70的檢測按照相關ELISA試劑盒(R&D)說明書介紹的步驟檢測，同時用蛋白定量試劑盒(BCA，碧云天生物技術研究所)測定胰腺組織中的蛋白量，計算得出每毫克組織中的相關蛋白含量。

3.4檢測胰腺組織中p38 MAPK及p-p38 MAPK蛋白的表達 取胰腺組織加入蛋白裂解液(組成：HEPES 25 mmol/L, EDTA 1 mmol/L, NaCl2150 mmol/L, MgCl210 mmol/L, PMSF 1 mmol/L, 蛋白酶抑制劑10 mg/L, 1%NP-40, 2%丙三醇, pH 7.5)，勻漿，使之充分裂解，離心取上清，檢測樣品蛋白濃度(BCA，碧云天生物技術研究所)，之后在等濃度樣品中加入5×上樣緩沖液(碧云天生物技術研究所)，95 ℃煮沸10 min使蛋白變性。之后按照參考文獻[9]完成SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和蛋白轉(zhuǎn)膜操作，上樣樣品量為40 μg。轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂牛奶封閉1 h，TBST洗滌后將NC膜分別與各個Ⅰ抗：p38 MAPK多克隆抗體(Santa Cruz，1∶400稀釋)，p-p38 MAPK多克隆抗體(Santa Cruz，1∶400稀釋)孵育過夜，以GAPDH單克隆抗體(Santa Cruz，1∶1 000稀釋)作為內(nèi)參照。TBST洗膜，室溫下與辣根過氧化物酶(HRP)標記的Ⅱ抗(Santa Cruz，1∶5 000稀釋)孵育2 h。ECL化學發(fā)光法顯色，化學發(fā)光成像分析儀(ImageQuant LAS 4000)曝光、采集圖像。用ImageJ分析蛋白條帶的光強度，將p38 MAPK和p-p38 MAPK蛋白與內(nèi)參照光強度的比值進行半定量分析。

4統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準誤(mean±SEM)表示，用軟件SPSS 13.0進行統(tǒng)計學分析，先用Levene 方法進行方差齊性檢驗，若樣本總體符合方差齊性要求，則對其進行單因素方差分析(ANOVA) ，若樣本總體的方差不齊，采用非參數(shù)檢驗(Kruskal-Wallis檢驗)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1離體胰腺組織活力水平的改變

如圖1所示，CAE刺激小鼠離體胰腺組織后1 h，胰腺組織的活力與對照組比較稍有降低(P>0.05)；CAE刺激4 h后胰腺組織活力明顯降低(P<0.05)，而CAE+SB組較CAE組明顯升高(P<0.05)，但較NS組仍較低(P<0.05)。

2培養(yǎng)上清液中淀粉酶和脂肪酶活性的改變

刺激后1 h，與NS組比較，CAE組培養(yǎng)上清液中的淀粉酶和脂肪酶活性明顯升高(P<0.05)；而CAE+SB組中，兩者的活性與CAE相比顯著降低(P<0.05)，與NS組比較仍處于較高水平(P<0.05)；SB組與NS組比較無明顯差異(P>0.05)，見圖2。刺激后4 h與刺激后1 h結(jié)果表現(xiàn)趨勢一致。

Figure 1. Effects of CAE and SB on the viability of the isolated mouse pancreatic tissues. Mean±SEM.n=5.*P<0.05vsNS group;#P<0.05vsCAE 4 h group.

圖1CAE及SB對小鼠離體胰腺組織活力的影響

Figure 2. Effects of CAE and SB on amylase (A) and lipase (B) activity in the culture supernatants of the isolated mouse pancreatic tissues. Mean±SEM.n=5.*P<0.05vsNS or SB group;#P<0.05vsCAE group.

圖2CAE及SB對離體小鼠胰腺組織培養(yǎng)上清液中淀粉酶和脂肪酶水平的影響

3培養(yǎng)上清液中IL-6和CINC-1活性的改變

刺激后1 h，與NS組比較，CAE組培養(yǎng)上清液中的IL-6和CINC-1活性均明顯升高(P<0.05)；而CAE+SB組中，IL-6和CINC-1的活性與CAE組相比顯著降低(P<0.05)，與NS組相比基本相當(P>0.05)；SB組與NS組比較無明顯差異(P>0.05)，見圖3。刺激后4 h與刺激后1 h結(jié)果表現(xiàn)趨勢一致。

Figure 3. Effects of CAE and SB on IL-6 (A) and CINI-1 (B) levels in the culture supernatants of the isolated mouse pancreatic tissues. Mean±SEM.n=5.*P<0.05vsNS or SB group;#P<0.05vsCAE group.

圖3CAE及SB對離體小鼠胰腺組織培養(yǎng)上清液中IL-6和CINI-1水平的影響

4胰腺組織中HSP60和HSP70蛋白的表達

刺激后1 h，與NS相比較，CAE組中胰腺組織HSP60和HSP70蛋白表達水平有所升高(P<0.05)；而CAE+SB組中，HSP60和HSP70蛋白表達水平與CAE組相比有所降低(P>0.05)，與NS組相比基本相當(P>0.05)；SB組與NS組比較無明顯差異(P>0.05)，見圖4。刺激后4 h與刺激后1 h結(jié)果表現(xiàn)趨勢一致。

Figure 4. Effects of CAE and SB on HSP60 (A) and HSP70 (B) protein levels in the isolated mouse pancreatic tissues. Mean±SEM.n=5.*P<0.05vsNS group.

圖4CAE及SB對離體小鼠胰腺組織中HSP60和HSP70蛋白表達水平的影響

5胰腺組織中p38和p-p38MAPK蛋白的表達

刺激后1 h，與NS組比較，CAE組中胰腺組織p38和p-p38 MAPK蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)；而CAE+SB組中，p38和p-p38 MAPK蛋白表達水平與CAE組相比顯著降低(P<0.05)，與NS組相比基本相當(P>0.05)；SB組與NS組比較無明顯差異(P>0.05)，見圖5。刺激后4 h與刺激后1 h結(jié)果表現(xiàn)趨勢一致。

討 論

急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)是一種始發(fā)于胰腺，易于向遠隔器官累及的急性炎癥性疾病。其病理生理過程復雜，與多種因素相關，包括胰酶的激活、炎癥介質(zhì)、細胞因子等[10]。雨蛙肽是膽囊收縮素(cholecystokinin, CCK)的類似物，有研究表明它可引起胰酶分泌，大劑量可誘導AP發(fā)生[11]，目前廣泛被應用于AP實驗研究。本課題組進行了大量的實驗研究證實雨蛙肽可引起胰腺組織的損傷，用雨蛙肽進行在體實驗時[9]，胰腺病理切片可見組織重度水腫、中性粒細胞浸潤等，此外血清淀粉酶、脂肪酶活性升高，促炎細胞因子水平也升高。本實驗采用雨蛙肽刺激離體的胰腺組織，同樣觀測到胰腺組織的損傷，表現(xiàn)為胰腺組織活力下降，同時培養(yǎng)上清液中淀粉酶、脂肪酶、IL-6和CINC-1水平均明顯升高。本實驗的結(jié)果與前期在體實驗[9]的結(jié)果相一致。

在AP的發(fā)生發(fā)展過程中，NF-κB的激活占有重要的地位，而p38 MAPK信號通路參與了這一調(diào)節(jié)[12]。p38 MAPK的下游蛋白激酶MK2磷酸化后可激活并觸發(fā)NF-κB的激活和放大[13]。我們以前的研究證實，在小鼠急性胰腺炎模型中，MK2基因敲除鼠的局部和全身炎癥反應的表現(xiàn)都較野生鼠減輕[14]。本實驗發(fā)現(xiàn)，CAE刺激后的小鼠離體組織中p38和p-p38 MAPK蛋白表達增高，表明CAE可激活p38 MAPK，而p38 MAPK特定的抑制劑SB203580可抑制CAE誘導的p38 MAPK的激活，并減弱炎癥反應和細胞因子的釋放，這進一步證明了p38 MAPK信號通路參與了AP的炎癥過程。這一結(jié)果與小鼠在體實驗結(jié)果相一致(結(jié)果未發(fā)表)。

Figure 5. Effects of CAE and SB on p38 MAPK and p-p38 MAPK protein expression in the isolated mouse pancreatic tissues. Mean±SEM.n=5.*P<0.05vsNS or SB group;#P<0.05vsCAE group.

圖5CAE及SB對離體小鼠胰腺組織中p38和p-p38MAPK蛋白表達水平的影響

熱休克蛋白是在從細菌到哺乳動物中廣泛存在的一類熱應急蛋白質(zhì)，多具有分子伴侶活性。按照蛋白的大小，熱休克蛋白共分為5類，分別為HSP100、HSP90、HSP70和HSP60以及小分子熱休克蛋白[15]。研究表明，熱休克蛋白有抗凋亡、參與炎癥反應等作用[16]。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，用RNA干擾技術(HSP60 RNAi)抑制胰腺組織HSP60的表達，胰腺組織對損傷因子的敏感性增加，促炎細胞因子水平明顯高于非干擾組，表明HSP60對胰腺組織具有保護作用[17]。也有學者看到，p38 MAPK和HSP70在體內(nèi)外都會相互影響，認為HSP70是核易位p38潛在的伴侶因子[18]。在本實驗中，CAE刺激小鼠離體胰腺組織后，HSP60和HSP70的表達增加，而使用SB干預后，可使HSP60和HSP70的表達在一定程度上降低，提示p38 MAPK可能參與了熱休克蛋白HSP60和HSP70合成的調(diào)節(jié)。而HSP60和HSP70的變化是因為炎癥反應減輕而使細胞應激程度降低所致，還是失去了p38 MAPK的調(diào)控作用所致還有待進一步研究。

總之，本次實驗的結(jié)果顯示，在離體小鼠胰腺組織培養(yǎng)中，SB可減輕雨蛙肽造成的損傷，其機制可能與其對炎癥介質(zhì)和細胞因子的抑制有關。本實驗進一步證實了p38 MAPK信號通路在炎癥中的作用，為AP發(fā)生機制的闡明和AP的治療提供了新的思路。

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Effectofp38MAPKinhibitorSB203580oncaerulein-inducedpancreatictissueinjuryinmice

XU Jing, CAO Ming-hua, FENG Ya-jing, LI Kun, ZHANG Yi-zhen, LI Yong-yu

(DepartmentofPathophysiology,InstituteofDigestiveDiseases,TongjiUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200092,China.E-mail:liyongyu@tongji.edu.cn)

AIM: To investigate the effect of p38 MAPK inhibitor SB203580 (SB) on caerulein (CAE)-induced injury in isolated mouse pancreatic tissues.METHODSThe pancreatic tissues of the mice were isolated, cultured for 4 h, and stimulated with CAE (10-5mol/L) alone or combined with SB (10-5mol/L). Normal saline (NS) was used as control reagent. At the time points of 1 h and 4 h after stimulation, the pancreatic tissues and the culture supernatants were harvested. The following parameters for evaluating the degree of injury were observed: the viability of the pancreatic tissues, the activity of amylase and lipase, and the content of interleukin-6 (IL-6) and cytokine-induced neutrophil chemotactic factor 1 (CINC-1) in the cultured supernatant. The levels of heat-shock protein (HSP) 60 and 70, and p38 and p-p38 proteins in the pancreatic tissues were measured by ELISA or Western blotting.RESULTSAfter stimulation with CAE, the viability of the pancreatic tissues decreased at 1 h and was even lower at 4 h. The levels of amylase, lipase, IL-6, CINC-1, HSP60 and HSP70 as well as the expression of p38 and p-p38 were significantly increased at the time point of 1 h as compared with NS group. These changes were partly or totally prevented by SB treatment.CONCLUSIONCAE effectively damages the isolated pancreatic tissues. SB203580 reduces the injury, which may be related to the inhibition of the inflammatory responses.

Pancreas; p38 MAPK signaling pathway; Caerulein

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.04.024

1000- 4718(2013)04- 0713- 05

2012- 12- 20

2013- 03- 05

國家自然科學基金資助項目(No. 81270477)

△通訊作者 Tel: 021-65981021; E-mail: liyongyu@tongji.edu.cn