阿霉素聯合致敏樹突狀細胞對荷宮頸癌小鼠的治療作用*

曾小平， 王紅梅， 黃永紅， 周曉燕， 蔡震宇， 徐方云

(南昌大學基礎醫學院 1病理生理學教研室， 2免疫學教研室, 江西 南昌 330006)

阿霉素聯合致敏樹突狀細胞對荷宮頸癌小鼠的治療作用*

曾小平2， 王紅梅1△， 黃永紅1， 周曉燕1， 蔡震宇1， 徐方云1

(南昌大學基礎醫學院1病理生理學教研室，2免疫學教研室, 江西 南昌 330006)

目的探討阿霉素(adriamycin，ADM)聯合凍融抗原致敏的樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)對荷宮頸癌小鼠的免疫治療作用。方法建立小鼠皮下移植瘤模型；應用反復凍融法處理小鼠宮頸癌U14細胞，并致敏小鼠骨髓來源的DCs，制備DCs疫苗；流式細胞術鑒定DCs成熟表型；荷瘤小鼠分為對照組(PBS組)、DCs疫苗組、ADM組和ADM聯合DCs疫苗組，進行3個周期的治療。觀察腫瘤大小，第21 d取血，ELISA法檢測小鼠血清IL-2、IL-12和IFN-γ含量；處死動物，稱腫瘤重量。結果腫瘤凍融抗原致敏DCs后，可高表達白細胞分化抗原CD11c、CD80和CD86；經3個周期的治療后，ADM聯合DCs疫苗組平均瘤重及平均瘤體積均小于ADM組、DCs疫苗組和對照組(P<0.05)，聯合治療組抑瘤率大于其它3組(P<0.05)，且血清IL-2、IL-12和IFN-γ水平明顯升高 (P<0.05)。結論ADM聯合腫瘤抗原致敏的DCs疫苗可增強動物的抗腫瘤免疫應答，能有效抑制荷宮頸癌小鼠腫瘤的生長。

樹突狀細胞； 阿霉素； 腫瘤免疫療法； 子宮頸癌

樹突狀細胞(dendritic cells, DCs)是1973年由Steinman和Cohn發現的，因為在它成熟時生出許多樹突樣或偽足樣突起而得名[1]，是目前所知唯一能激活初始T細胞的專職抗原提呈細胞(antigen presenting cells，APC)，具有強大激活CD8+細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T-lymphocyte, CTL)和CD4+輔助性T細胞(helper T-lymphocyte，Th)的能力，在免疫應答中居于中心地位，對機體克服腫瘤的免疫逃逸、增強機體對腫瘤的免疫清除等具有十分重要的作用。化療藥物治療是抗腫瘤的重要手段之一，化療藥物可引起腫瘤細胞死亡，而這些死亡(包括壞死或凋亡)的腫瘤細胞有可能致敏DCs。在探討化療誘發免疫原性瘤細胞凋亡時，發現蒽環類抗生素在體內和體外均能引起免疫原性細胞死亡，阿霉素(adriamycin，ADM)處理的腫瘤細胞激發細胞毒性免疫應答特別有效，這種應答是由DCs介導的[2]。本文將重點探索化療藥物ADM聯合DCs腫瘤疫苗對荷宮頸癌小鼠的聯合治療效應，觀察經ADM處理荷瘤小鼠后，對DCs抗腫瘤免疫應答是否具有增強作用。

材 料 和 方 法

1動物

昆明(Kunming, KM)小鼠，雌性，6～8周齡，18～20 g，由南昌大學醫學院實驗動物部提供。小鼠宮頸癌U14細胞是由化學致癌物甲基膽蒽誘發的未分化鱗狀細胞癌，在本研究室傳代保存，復蘇后常規傳代培養。

2主要試劑

RPMI-1640培養基、胎牛血清購自HyClone，重組小鼠粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(recombinant murine granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, rmGM-CSF)和重組小鼠白細胞介素 4(recombinant murine interleukin-4, rmIL-4)購自PeproTech，PE標記抗小鼠CD11c單克隆抗體、抗小鼠CD86單克隆抗體和FITC標記抗小鼠CD80單克隆抗體購自BioLegend，四甲基偶氮唑藍[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT]、胰蛋白酶和絲裂霉素C購自Sigma。阿霉素購自浙江海正藥業有限公司。酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)試劑盒購自Westang Bio-Tech。

3主要方法

3.1荷瘤小鼠模型的建立 小鼠宮頸癌U14細胞常規復蘇后傳代培養。取處于對數生長期的U14細胞，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)洗滌后，調整細胞濃度為1×1010cells/L，接種于小鼠右側腋窩皮下，每只0.1 mL (1×106cells)。

3.2反復凍融法提取腫瘤抗原 收集U14細胞，經液氮迅速冷凍后，立即放入37 ℃水浴中至剛剛融化，即再次放入液氮迅速冷凍，反復5次凍融循環獲得腫瘤細胞凍融裂解物, 10 000 r/min低溫離心20 min，上清用0.22 μm針頭濾器過濾，Lowry法測蛋白含量，-20 ℃保存。

3.3DCs的體外分離、培養和鑒定 在無菌條件下，從KM小鼠股骨和脛骨沖洗骨髓腔收集骨髓細胞，過200目鋼網，1 000 r/min 離心 5 min，棄上清，以Tris-NH4Cl處理2～3 min去除紅細胞，用PBS洗滌2次，RPMI-1640培養液洗1次后，將細胞懸于含rmGM-CSF(100 μg/L)和rmIL-4(100 μg/L)的含10% 胎牛血清的RPMI-1640完全培養液中(細胞濃度為1×109cells/L)培養。每2 d半量換液加全量細胞因子1次，第6 d時，用100 mg/L U14細胞凍融抗原刺激DCs 24 h，收集疏松貼壁細胞，流式細胞術檢測細胞CD11c、CD86和CD80的表達。倒置顯微鏡每日觀察細胞形態。

3.4ADM聯合DCs瘤苗的體內抗腫瘤效應 KM小鼠皮下接種1×106個腫瘤細胞。第7 d平衡各組腫瘤體積，將荷瘤小鼠隨機分為4組(n=6)：對照組(PBS組)、ADM組、DCs疫苗組和ADM聯合DCs治療組。各組實驗動物分別于接種腫瘤細胞后第 7、12、17 d給予相應治療：PBS 對照組小鼠注射 PBS 0.1 mL, ADM組按6 mg/kg注射0.1 mL ADM，DCs 疫苗組注射DCs 1×106個(0.1 mL)，聯合治療組在注射同劑量ADM后36 h注射相同劑量DCs。方法采用腫瘤周圍多點注射。觀察腫瘤生長情況。卡尺測量腫瘤的長徑 a和短徑 b，按V=1/2ab2算出腫瘤體積。接種腫瘤細胞第 21 d頸椎脫臼法處死動物，剝離腫瘤組織，濾紙吸干后稱重，計算抑瘤率。抑瘤率(%)=1-治療組腫瘤重量(或體積)/對照組腫瘤重量(或體積)×100%。總抑瘤率為重量及體積兩組抑瘤率的均數。

3.5ELISA 法檢測荷瘤小鼠血清中細胞因子的含量 荷瘤小鼠在頸椎脫臼法處死前，摘眼球取血，收集血清，ELISA檢測血清中 IL-12、IL-2和干擾素γ(interferon γ,IFN-γ)的水平，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

4統計學處理

用SPSS統計軟件對數據作統計分析，數據以均數±標準差 (mean±SD)表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1荷瘤小鼠模型

小鼠皮下接種腫瘤后1～4 d生長較緩慢，以后迅速增長，多數呈類似橢圓形生長，第7 d時，注射部位出現明顯質地較硬的結節，成瘤率達100%。

2DCs的形態學觀察

小鼠骨髓細胞培養24 h后，可觀察到部分細胞呈集落樣生長，胞體為圓形，第3 d可見部分細胞形態出現不規則，體積增大，且形成的集落變大，數量增多，懸浮細胞增多；培養4～6 d，懸浮細胞數量逐漸增多，細胞表面毛刺狀突起逐漸明顯；培養6 d加入腫瘤凍融抗原繼續培養24 h后，倒置顯微鏡下觀察細胞表面毛刺狀突起更加明顯，形成典型的DCs形態特征，見圖1。

Figure 1. Morphology of the DCs under inverted microscope.A: the 3rd day; B: the 5th day; C: the 7th day.

圖1倒置顯微鏡觀察DCs的形態

3DCs表型測定

小鼠骨髓細胞培養7 d后，用吸管輕吹板底，收集細胞。應用流式細胞儀檢測腫瘤抗原致敏的DCs，均高表達CD11c(74.37%±7.62%)、CD80(79.92%±6.58%)和CD86 (86.83%±7.31%)。

4荷瘤小鼠治療效果

小鼠皮下接種腫瘤細胞建立荷瘤小鼠模型后，全部成瘤。接種后前5 d腫瘤生長較緩慢，以后腫瘤體積迅速增長，第7 d平均體積約0.4 cm×0.4 cm×0.4 cm左右，給予第1次治療。接種腫瘤第17 d測量腫瘤體積，聯合治療組和ADM組小鼠腫瘤體積均小于對照組(P<0.05)，第21 d時腫瘤體積大小為 ADM聯合DCs疫苗組

5ELISA法檢測荷瘤小鼠血清中細胞因子的含量

ELISA檢測各實驗組小鼠血清，顯示聯合治療組荷瘤小鼠外周血血清中IL-2、IL-12和IFN-γ 高于ADM組、DCs治療組和對照組(P<0.05)，見圖3。

表1荷瘤小鼠不同時間皮下腫瘤體積

Table 1. The tumor volume of tumor-bearing mice at different time points(cm3. Mean±SD.n=6)

Group10d17d21dControl3.566±0.3985.492±0.7318.341±0.687DCs3.008±0.3673.914±0.7724.664±0.435*ADM2.297±0.2542.735±0.521*3.513±0.348*☆DCs+ADM2.138±0.3602.269±0.418*2.451±0.325*☆△

*P<0.05vscontrol；☆P<0.05vsDCs；△P<0.05vsADM.

Figure 2. The weight of tumor on tumor-bearing mice in different groups.Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group；☆P<0.05vsDCs；△P<0.05vsADM.

圖2各實驗組荷瘤小鼠腫瘤的重量

Figure 3. Production of cytokines in the serum of tumor-bearing mice.Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol；☆P<0.05vsDCs；△P<0.05vsADM.

圖3各組小鼠血清細胞因子水平

討 論

DCs作為一種專職抗原提呈細胞，能攝取、加工及處理抗原，并將抗原提呈給T細胞，啟動適應性免疫應答，從而誘導高效而特異的抗腫瘤免疫[3]。DCs通過酶解抗原，并以抗原肽-MHC復合物的形式表達于細胞表面，該復合物能被T細胞所識別，并能夠刺激初始T細胞增殖，激發特異性的細胞毒性作用。因此，以 DCs 為基礎的免疫療法在當今腫瘤治療中是最有價值的方法之一。

然而由于腫瘤患者體內腫瘤免疫抑制作用的影響，DCs處于失能狀態，難以激發機體有效的抗腫瘤免疫反應[4]，同時腫瘤細胞免疫原性低、宿主對腫瘤抗原缺乏反應是惡性腫瘤發生和發展的重要因素。目前DCs疫苗主要是通過人工合成某種已知抗原肽、核酸、腫瘤細胞等致敏自體DCs細胞制備而成，從而激活體內特異性細胞毒反應[5]，是以 DCs 為基礎腫瘤免疫治療的基本原理，然而單一的免疫治療效果并非如人們所期待的，近年來已有不少學者發現接受自體DCs疫苗治療的患者，病情有所加重，生存期縮短[6]，出現DCs功能抑制，引起機體對腫瘤抗原的免疫耐受并促進腫瘤生長[7]，表明DCs疫苗的臨床應用還存在許多亟待解決的問題[8]。

研究表明，免疫的最佳“危險信號”是漸進性壞死的腫瘤細胞或凋亡小體，這些細胞或小體可釋放腫瘤相關抗原[9]。化療藥物是抗腫瘤治療的重要手段之一，化療藥物可引起腫瘤細胞的死亡，其死亡方式包括壞死或凋亡。這些死亡的細胞或其產物可向DCs提供抗原。ADM在體內外都能誘導免疫原性瘤細胞死亡，而不影響DCs疫苗的免疫原性，且能增強其抗腫瘤作用[2]。本研究應用ADM聯合腫瘤抗原致敏的DCs疫苗，研究其對荷瘤小鼠的抗腫瘤免疫效應，結果顯示ADM聯合DCs疫苗治療后，能夠抑制荷瘤小鼠腫瘤的生長，血清IL-2、IFN-γ和IL-12水平也較其它對照組高。IL-2、IL-12和IFN-γ在機體抗腫瘤免疫中發揮重要作用，如IL-2和IL-12刺激自然殺傷細胞或CTL的殺瘤活性，IFN-γ具有較強的抗腫瘤和免疫調節作用。IL-2和IFN-γ均為 Th1細胞直接分泌，IL-12主要由DCs等專職APC產生，是CD4+Th0細胞向Th1細胞分化的主要誘導因子。IL-2是CD4+T和CD8+T細胞增殖和分化的因子。本實驗所檢測的細胞因子結果間接說明了聯合治療組小鼠機體的免疫系統已處于活化狀態[10]。

對于腫瘤細胞抗原的最適提呈，不僅需要尚未成熟的DCs對凋亡細胞的吞噬，且需要DCs通過與凋亡腫瘤細胞或其產物接觸從而活化和成熟[11-12]。DCs與凋亡小體接觸后，提供腫瘤相關抗原及活化/成熟的環境。研究表明，DCs注入到荷高自發凋亡率腫瘤的機體后，或DCs注入結合凋亡誘導治療后，可誘導抗腫瘤應答的產生[13]。本實驗結果亦證實了體外誘導成熟的DCs聯合化療藥物能抑制腫瘤的生長，并刺激抗腫瘤免疫應答反應。ADM處理荷瘤小鼠后，死亡的腫瘤細胞有可能被髓細胞樣的和漿細胞樣的DCs高效率吞噬，從而誘導抗腫瘤免疫應答必需的抗原特異性CTL。研究發現，ADM可增加胃癌細胞熱休克蛋白70的表達以及DCs對腫瘤細胞組分的攝取從而上調DCs分泌IL-12[14]。ADM處理的腫瘤細胞抗原沖擊的DCs對T細胞刺激后，亦可引起IFN-γ釋放增加，在本實驗中得到證實。據報道，疫苗接種前一次性或反復給予ADM不會阻礙肽沖擊DCs和可溶性抗原疫苗的免疫原性；這種結合療法可誘導有效的T細胞反應[2]。DCs作為APC用于腫瘤生物治療發揮了一定的療效，但腫瘤機體內DCs數量少，功能缺陷，應用化療藥物和體外特異性腫瘤抗原致敏的DCs對腫瘤患者進行聯合治療，為DCs的應用及腫瘤治療提供了研究思路與理論依據。

[1] Steinman RM, Cohn ZA. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution[J]. J Exp Med, 1973, 137(5):1142-1162.

[2] Casati A, Zimmermann VS, Benigni F, et al. The immunogenicity of dendritic cell-based vaccines is not hampered by doxorubicin and melphalan administration[J]. J Immunol, 2005, 174(6):3317-3325.

[3] 劉玉昆，劉梅蘭，王蘊慧,等.母胎界面樹突狀細胞CCL17和CCL22表達在母胎免疫耐受中的作用[J].中國病理生理雜志，2012，28(6)：1061-1065.

[4] 梅林航,劉小孫,于吉人. 漿細胞樣樹突狀細胞與實體腫瘤免疫逃逸[J]. 現代免疫學, 2011, 31(3):262-265.

[5] Duios B, Lamy PJ, Chemin K, et al. Measles virus exploits dendritic cells to suppress CD4+T-cell proliferation via expression of surface viral glycoproteins independently of T-cell trans-infection[J].Cell Immunol, 2001, 214(2):173-183.

[6] Wobser M, Voigt H, Houben R, et al. Dendritic cell based antitumor vaccination: impact of functional indoleamine 2, 3-dioxygenase expression[J]. Cancer Immunol Immunother,2007,56(7):1017-1024.

[7] 韓超峰, 曹雪濤. 腫瘤誘導的樹突狀細胞功能缺陷及其機制[J].中國腫瘤生物治療雜志,2005, 12(2): 89-93.

[8] Osada T, Clay TM, Woo CY, et al. Dendritic cell-based immunotherapy[J]. Int Rev Immunol, 2006, 25(5-6):377-413.

[9] 周忠信, 呂明德, 殷曉煜, 等. 微波消融后瘤內注射未成熟樹突狀細胞對細胞毒性 T淋巴細胞殺傷活性的影響[J].中國病理生理雜志, 2008,24(4):772-776.

[10] Reinhard G, M?rten A, Kiske SM, et al. Generation of dendritic cell-based vaccines for cancer therapy[J].Br J Cancer, 2002, 86(10):1529-1533.

[11] 袁婷婷,劉艷榮. 樹突狀細胞生物學研究進展[J]. 中國實驗血液學雜志, 2010, 18(4):1074-1078.

[12] Feng H, Zeng Y, Graner MW, et al. Exogenous stress proteins enhance the immunogenicity of apoptotic tumor cells and stimulate antitumor immunity[J]. Blood, 2003, 101(1):245-252.

[13] Choi GS, Lee MH, Kim SK, et al. Combined treatment of an intratumoral injection of dendritic cells and systemic chemotherapy (Paclitaxel) for murine fibrosarcoma[J]. Yonsei Med J,2005, 46(6): 835-842.

[14] Zheng H, Li Z. Cutting edge: cross-presentation of cell-associated antigens to MHC class Ⅰ molecule is regulated by a major transcription factor for heat shock proteins[J]. J Immunol, 2004, 173(10):5929-5933.

Effectofadriamycincombinedwithsensitizeddendriticcellsoncervicaltumor-bearingmice

ZENG Xiao-ping2, WANG Hong-mei1, HUANG Yong-hong1, ZHOU Xiao-yan1, CAI Zhen-yu1, XU Fang-yun1

(1DepartmentofPathophysiology,2DepartmentofImmunology,BasicMedicalCollegeofNanchangUniversity,Nanchang330006,China.E-mail:wanghongmay@hotmail.com)

AIM: To explore the immunotherapeutic effect of adriamycin (ADM) combined with frozen-thawed antigen-sensitized dendritic cells (DCs) on cervical tumor-bearing mice.METHODSThe U14 cervical cancer model of Kunming mice was established by subcutaneous implantion of U14 cells in axillary fossa. DCs vaccine was prepared by U14 cervical cancer cell frozen-thawed antigen-sensitized mouse bone marrow-derived DCs. Mature phenotype of sensitized DCs was identified by flow cytometry. Tumor-bearing mice were randomly divided into 4 groups and treated for 3 cycles with PBS (control), DCs vaccine, ADM and ADM combined with DCs vaccine, respectively. The tumor volume was evaluated. The tumor weight and the levels of interleukin-2 (IL-2), IL-12 and interferon γ (IFN-γ) in the serum were determined by ELISA on the 21st day.RESULTSCancer cell frozen-thawed antigen-sensitized DCs had higher expression levels of CD11C, CD80 and CD86. The volume and weight of the tumor in ADM combined with DCs vaccine group were less than those in ADM group, DCs vaccine group and control group. The tumor inhibitory rate in combination group was higher than that in the other 3 groups. Compared with the other 3 groups, the serum levels of IL-2, IL-12 and IFN-γ in combination group significantly increased.CONCLUSIONADM combined with tumor antigen-sensitized DCs vaccine can strengthen the animal antitumor immune response and effectively inhibit the growth of tumor in cervical tumor-bearing mice.

Dendritic cells; Adriamycin; Tumor immunotherapy; Uterine cervical neoplasms

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.04.028

1000- 4718(2013)04- 0734- 05

2012- 09- 07

2013- 03- 08

江西省教育廳基金資助項目(No.GJJ08086)；江西省衛生廳基金資助項目(No.20072015)

△通訊作者 Tel: 0791-88608348； E-mail: wanghongmay@hotmail.com