腺苷A2A受體激動劑CGS21680對脂多糖誘導的小鼠急性肺損傷的保護作用*

盧 芳， 周伶萍， 吳慶國， 劉艷玲， 徐紅蕾

(溫州醫學院附屬第一醫院呼吸內科，浙江 溫州 325000)

腺苷A2A受體激動劑CGS21680對脂多糖誘導的小鼠急性肺損傷的保護作用*

盧 芳， 周伶萍， 吳慶國， 劉艷玲， 徐紅蕾△

(溫州醫學院附屬第一醫院呼吸內科，浙江 溫州 325000)

目的探討腺苷A2A受體激動劑對脂多糖(LPS)誘導的急性肺損傷(ALI)小鼠的作用。方法采用LPS(10 mg/kg)氣管內注射6 h后的ALI小鼠模型。實驗動物隨機分為生理鹽水對照組、ALI組、CGS21680治療組和CGS21680對照組。測定各組6 h后肺濕重/干重比值(W/D)。比色法測定各組肺組織中髓過氧化物酶(MPO)活性。Western blotting分析各組肺組織中細胞間黏附分子1(ICAM-1)和血管細胞黏附分子1(VCAM-1)的表達。酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測各組小鼠血清中單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)的濃度。觀察各組肺組織病理改變。結果ALI組肺W/D、MPO活性、ICAM-1及VCAM-1表達和MCP-1濃度均較對照組顯著升高。CGS21680治療組前述各項指標較ALI組有顯著下降。CGS21680組較對照組各項指標無顯著差異。肺組織病理顯示，ALI組可見肺間質明顯充血水腫，大量炎癥細胞浸潤，部分肺泡腔內可見紅細胞。CGS21680治療組可顯著改善肺組織的病理變化。結論腺苷A2A受體激動劑CGS21680可明顯減輕LPS誘導的ALI小鼠肺組織的炎癥反應及肺組織水腫，提示腺苷A2A受體激動劑在急性肺損傷中具有保護作用。

急性肺損傷； 脂多糖類； 受體，腺苷A2A

急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是各種直接或間接肺損傷因素導致的急性呼吸衰竭，嚴重者可發展為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)，臨床上表現為肺部彌漫性滲出和難以糾正的低氧血癥，并排除左心衰竭導致的肺充血水腫[1]。目前大量研究表明，體內失控性釋放的大量促炎介質如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白細胞介素8(interleukin-8，IL-8)、黏f附分子、趨化因子以及抗炎介質如白細胞介素10(interleukin-10，IL-10)的相對減少與ALI的發病密切相關[2]。其死亡率約為35%～60%[1]，治療手段有限。腺苷是一內源性嘌呤核苷，于1927年在心臟的研究中發現[3]。生理狀態下細胞外的腺苷濃度較低，濃度為納摩爾級，但在炎癥或缺血缺氧組織中，其濃度能夠增加到生理濃度的100倍[4]。腺苷是通過特異性的細胞表面受體發揮作用，研究已證實腺苷受體包括A1、A2A、A2B、A3四種亞型，均為G蛋白偶聯受體，不同的受體發揮其不同的生理作用[5]。其中，腺苷A2A受體廣泛分布于中樞神經系統、脾臟、白細胞以及血小板，在肺內也有中等量表達。目前已有大量研究認為，腺苷A2A受體的激活與抗炎作用密切相關。但腺苷A2A受體在急性肺損傷中的研究較少。基于此，我們建立了脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導的小鼠急性肺損傷模型，研究腺苷A2A受體激動劑CGS21680對小鼠急性肺損傷的作用。

材 料 和 方 法

1材料

1.1動物 健康雄性BALB/c小鼠24只，7～14周齡，體重16～25 g，由溫州醫學院實驗動物中心提供。

1.2藥品與試劑 大腸桿菌LPS(O55：B5)購于Sigma，CGS21680購于Tocris,髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)測定試劑盒購于南京建成生物工程公司，小鼠血清中單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein 1，MCP-1)ELISA試劑盒以及細胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule 1，ICAM-1)抗體和血管黏附分子1(vascular adhesion molecule 1，VCAM-1)抗體均購自武漢博士德公司，β-actin抗體購自聯科生物技術有限公司。

2方法

2.1動物模型建立與分組 采用完全隨機設計方法將小鼠分為4組，每組6只小鼠。ALI組：氣管內注入LPS 10 mg/kg后，腹腔內注入等體積載體溶液(DMSO+NS)。CGS21680治療組：氣管內注入LPS后，腹腔內注入CGS21680 (DMSO溶解后用NS稀釋)0.5 mg/kg。CGS21680對照組：在氣管內注入等體積的生理鹽水后，腹腔注射CGS21680 0.5 mg/kg。生理鹽水對照組，氣管內注入等體積的生理鹽水后，腹腔內注入等體積的載體溶液。各組小鼠均在致傷6 h后處死。

2．2肺濕重/干重比值(wet weight/dry weight，W/D)測定 取右上肺稱肺濕重后，將肺組織置于70 ℃烤箱內烘干72 h至完全脫水，稱量肺干重，計算肺W/D，以估計肺組織水腫程度。

2．3MCP-1的測定 各組動物致傷6 h后，經眼眶采血，留取血清置-80 ℃冰箱凍存。采用ELISA測定血清中MCP-1的含量。

2．4測定中性粒細胞MPO的活性 通過供氫體鄰連茴香胺供氫后生成黃色化合物，在460 nm處通過比色測定此產物的生成量，從而推算出MPO的活性。

2．5肺組織血管內皮細胞ICAM-1和VCAM-1蛋白表達的測定 取小鼠肺組織，勻漿，分離細胞膜漿蛋白，測定蛋白濃度，在12%SDS-PAGE中分離相等量蛋白，電轉染到PVDF膜。Western blotting分析ICAM-1和VCAM-1的表達，以β-actin抗體作為對比。

2．6病理學檢查 留取右下肺，固定于10%甲醛液中，進行石蠟切片及常規HE染色，觀察光鏡下肺組織形態學變化。

3統計學處理

SPSS統計分析軟件進行統計學分析。數據用均數±標準差(mean±SD)表示。各組均數數據先行方差齊性檢驗。樣本均數的比較采用方差分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1CGS21680對肺含水量的影響

ALI組肺W/D比值較NS對照組明顯升高，其差異有統計學意義(P<0.05)，表明出現肺水腫。CGS21680治療組較ALI組有顯著降低，但仍高于NS對照組，其差異有統計學意義(P<0.05)。NS對照組與CGS21680對照組W/D值無顯著差異，提示CGS21680能減少急性肺損傷中肺的含水量，見表1。

2CGS21680對血清中MCP-1的影響

從表1可以看出，ALI組較NS對照組MCP-1的水平顯著升高(P<0.05)，CGS21680治療組較ALI組有顯著降低(P<0.05)，但仍高于NS對照組，CGS21680對照組與NS對照組相比差異無統計學意義。

3CGS21680對肺組織中MPO蛋白的影響

從表1可以看出，ALI組較NS對照組MPO的水平顯著升高(P<0.05)，CGS21680治療組較ALI組有顯著降低，但仍高于NS對照組(P<0.05)，CGS21680對照組與NS對照組相比差異無統計學意義。

4CGS21680對肺組織中的ICAM-1和VCAM-1蛋白表達的影響

從圖1及表2可以看出，ALI組較NS對照組ICAM-1和fVCAM-1蛋白的表達水平顯著升高(P<0.05)，CGS21680治療組較ALI組有顯著降低(P<0.05)，CGS21680對照組與NS對照組相比差異無統計學意義。

表1腺苷受體激動劑CGS21680對LPS誘導的急性肺損傷小鼠炎癥的影響

Table 1. Effect of adenosine A2Areceptor agonist CGS21680 on inflammation of acute lung injury (ALI) mice induced by lipopolysaccharide(LPS)(mean±SD.n=6)

GroupLungW/DMCP-1(ng/L)MPOactivity[U/(gwettissue)]NS4.20±0.9039.51±22.571.35±0.35ALI5.57±0.97*259.00±110.75*2.56±0.79*CGS21680+LPS5.12±0.64#156.47±84.09#2.01±0.58#CGS216804.23±0.6524.93±12.541.48±0.36

*P<0.05vsNS；#P<0.05vsALI.

Figure 1. Effects of CGS21680 on VCAM-1 and ICAM-1 protein expression in lung tissues detected by Western blotting.

圖1CGS21680對VCAM-1和ICAM-1蛋白表達的影響

表2CGS21680對VCAM-1和ICAM-1蛋白表達的影響

Table 2. Effects of CGS21680 on VCAM-1 and ICAM-1 protein expression in lung tissues(mean±SD.n=6)

GroupVCAM-1ICAM-1NS290.43±10.89289.34±14.81ALI710.55±46.14*580.10±15.58*CGS21680+LPS520.53±36.28#383.78±14.73#CGS21680298.43±16.16293.86±13.66

*P<0.05vsNS；#P<0.05vsALI.

5CGS21680對肺組織病理變化的影響

光鏡下見NS對照組(圖2A)和CGS21680組(圖2C)肺組織結構清晰，肺泡腔及支氣管腔未見炎癥細胞及滲出物。ALI組(圖2B)可見點、片狀出血，大量中性粒細胞浸潤，肺泡間隙邊緣有輕度的透明膜存在，顯示明顯的炎癥和輕度的肺水腫現象，肺泡間隔明顯增厚，肺泡腔變窄。CGS21680治療組(圖2D)較模型組上述病理變化有明顯改善。

Figure 2. Effect of adenosine A2Areceptor agonist CGS21680 on lung histopathological changes in ALI mice induced by LPS(HE staining,×400).A：NS group；B：ALI group；C：CGS21680 group；D：CGS21680+LPS group.

圖2CGS21680對LPS誘導的急性肺損傷小鼠肺組織病理學的影響

討 論

ALI/ARDS是由各種肺內或肺外因素導致的肺泡毛細血管內皮細胞以及肺泡上皮細胞嚴重受損[6]，引起肺部彌漫性的滲出，肺泡蛋白沉積，導致臨床上難以糾正的嚴重的呼吸窘迫。目前已有大量研究表明急性肺損傷是由于機體炎癥反應失控導致的臨床綜合征，主要以促炎因子明顯升高，抑炎因子的下降以及凝血纖溶系統失衡為特征。參與這些炎癥反應的細胞包括中性粒細胞、單核巨噬細胞、毛細血管內皮細胞、淋巴細胞等。其中中性粒細胞、單核巨噬細胞等在急性肺損傷中發揮了重要作用[2]。但我們的前期研究認為毛細血管內皮細胞可能是敗血癥中炎癥反應的主要靶點[7]。所以我們推測在急性肺損傷中，毛細血管內皮細胞損傷后分泌大量黏附分子(ICAM-1和VCAM-1)、趨化因子(MCP-1)等，從而促進中性粒細胞、巨噬細胞等炎癥細胞向炎癥部位聚集，在敗血癥導致的急性肺損傷中可能發揮更為重要的作用，

腺苷來源于腺嘌呤核苷酸的分解代謝，在機體缺血缺氧、急性或者慢性炎癥情況下大量生成。腺苷通過結合腺苷受體發揮作用。腺苷受體有A1、A2A、A2B、A3四種亞型，其中腺苷A2A受體基因定位于22q11．2，主要通過偶聯霍亂毒素敏感的GS蛋白活化腺苷酸環化酶，提高細胞內cAMP的濃度發揮作用。腺苷A2A受體分布廣泛，在紋狀體、心、肺、肝、腎等組織均有表達，而在細胞上，如淋巴細胞、中性粒細胞、小膠質細胞、單核巨噬細胞、血小板、內皮細胞、成纖維細胞、自然殺傷細胞等，也呈高水平表達。Kumar等[8]研究認為，腺苷A2A受體活化能夠抑制中性粒細胞黏附血管內皮并向炎癥組織浸潤，抑制氧自由基的形成，抑制內皮細胞活化，抑制單核巨噬細胞的增殖分化以及炎癥因子的分泌而起到抗炎作用。大量研究證實，腺苷A2A受體的激活能明顯減輕敗血癥的臟器損害，在胃腸炎、急性肝炎、腎小球腎炎方面也發揮有力的保護作用，但其在中樞神經系統方面的作用既有保護作用又能加重損傷。

CGS21680是腺苷A2A受體的高效激動劑。在對鼠的一系列體內研究中，CGS21680被證實能減輕通氣相關性肺損傷[9]，能預防創傷/失血性休克導致的肺損傷[10]，能減輕角叉菜膠誘導的胸膜炎模型中的肺損傷[11]。此外，腺苷A2A受體激活還能增加小鼠肺泡中液體的清除[5]。但在LPS誘導的急性肺損傷中，在急性肺損傷毛細血管內皮細胞的功能方面，關于腺苷A2A受體的影響研究較少。本實驗采用LPS氣管內注入，結果顯示LPS組相比于生理鹽水對照組，ICAM-1、VCAM-1以及MCP-1的表達明顯升高，肺組織病理顯示肺組織中大量中性粒細胞浸潤，肺泡內水腫液積聚，間質充血水腫，表明造模成功。CGS21680治療組能夠顯著降低LPS誘導的急性肺損傷小鼠早期的ICAM-1、VCAM-1(間接反映毛細血管內皮細胞損傷)以及MCP-1(反映急性炎癥過程中趨化因子的變化)的水平，降低中性粒細胞的肺組織浸潤(MPO活性間接反映中性粒細胞浸潤程度)，減少肺泡內液體的積聚(間接反映毛細血管內皮細胞的機械性損傷)。肺組織病理同樣顯示CGS21680治療組肺損傷程度較LPS組明顯減輕。LPS是通過結合Toll樣受體4，激活NF-κB途徑導致的系統性炎癥綜合征。楊紅等[12]研究認為LPS是通過損傷肺血管內皮細胞導致急性肺損傷。Murphree等[13]在體外腹膜內巨噬細胞研究中發現，在LPS刺激細胞后，細胞表面腺苷A2A受體數量增加約290倍，通過腺苷A2A激動劑ATL146e干預后，TNF-α釋放明顯減少，提示NF-κB途徑能誘導腺苷A2A受體的生成。所以我們推測，激活腺苷A2A受體是通過抑制NF-κB途徑，抑制毛細血管內皮細胞的損傷，從而抑制中性粒細胞以及巨噬細胞等炎癥細胞的促炎效應，從而發揮抗炎及肺保護作用，但其具體的機制需要在以后的研究中進一步明確。值得注意的一點是，腺苷A2A受體的激活是過度炎癥的機體負反饋調節，其過度激活可能導致機體的免疫保護作用受到限制，繼而導致入侵病原體的擴散，最終加重肺損傷。故腺苷A2A受體的作用需要在以后的研究中進一步明確。

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ProtectiveeffectofadenosineA2AreceptoragonistCGS21680onmicewithlipopolysaccharideinducedacutelunginjury

LU Fang, ZHOU Ling-ping, WU Qing-guo, LIU Yan-ling, XU Hong-lei

(DepartmentofRespiratory,theFirstAffiliatedHospitalofWenzhouMedicalCollege,Wenzhou325000,China.E-mail:xfhl2000@163.com)

AIM: To investigate the effect of adenosine A2Areceptor agonist on mice with acute lung injury (ALI) induced by lipopolysaccharide (LPS).METHODSThe mouse model of ALI was established by intraperitoneal injection of LPS. The mice were randomly divided into saline control group, ALI group, CGS21680 treatment group and CGS21680 control group. Six hours after LPS injection, the mice were sacrificed. The ratio of pulmonary wet weight to dry weight (W/D) was measured to assess the extent of pulmonary edema. Neutrophil infiltration was assayed by determining the myeloperoxidase(MPO) activity in lung tissues.The expression of intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) and vascular cell adhesion molecule 1(VCAM-1) was detected by Western blotting. The level of monocyte chemoattractant protein 1 (MCP-1) in the serum was examined by ELISA. The pathological changes of the lung were observed.RESULTSThe lung W/D, MPO activity, the expression of ICAM-1 and VCAM-1 intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) and vascular cell adhesion molecule 1(VCAM-1)，and the concentration of MCP-1 in ALI group were significantly higher than those in control group. All indexes reduced significantly in CGS21680 treatment group as compared with ALI group. No statistical difference between CGS21680 group and control groups was observed. Marked pulmonary interstitial hyperemia, edema, and infiltration of a large number of inflammatory cells and red blood cells were observed in some alveolar space in ALI group. Treatment with CGS21680 greatly improved the pathological changes of the lung tissues.CONCLUSIONAdenosine A2Aagonist CGS21680 has a protective effect on mice with acute lung injury.

Acute lung injury; Lipopolysaccharides; Receptors,adenosine A2A

R563

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.04.029

1000- 4718(2013)04- 0739- 05

2012- 10- 15

2013- 03- 01

浙江省自然科學基金資助項目(No. LY12H01001)

△通訊作者 Tel： 0577-55579275; E-mail： xfhl2000@163.com