線粒體功能不全在重癥休克發生中的作用*

王興民， 趙克森

(南方醫科大學廣東省醫學休克微循環重點實驗室，廣東 廣州 510515)

線粒體功能不全在重癥休克發生中的作用*

王興民， 趙克森△

(南方醫科大學廣東省醫學休克微循環重點實驗室，廣東 廣州 510515)

重癥休克是指休克的晚期, 在輸血補液及其它抗休克治療以后，病人生命仍難以搶救。它是世界范圍內致死、致殘的主要疾患之一。已證明休克時小動脈平滑肌細胞(arteriolar smooth muscle cells,ASMCs)ATP含量減少，引起ATP敏感鉀通道(KATP)開放和ASMCs超極化，是導致重癥休克血管反應性下降和頑固性低血壓的重要原因[1]。由于在輸血補液等治療后，低血壓病情仍不能改善,令人考慮到不僅是微循環障礙帶來的氧氣和養料供應不足，還可能與三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)生產的工廠線粒體的損傷和功能不全有關。本文就線粒體功能不全做簡要的介紹。

1 線粒體功能不全的概念

自1962年Luft報道首例線粒體呼吸鏈缺陷疾病以來，線粒體功能不全在細胞生物學領域被廣泛應用，但至今尚未有一個精確的定義。線粒體的主要功能是通過氧化磷酸化產生ATP，此外還包括活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)的生成和解毒，參與某些類型細胞凋亡，胞漿和線粒體基質中鈣的調節，代謝產物的合成和分解，細胞增殖與細胞代謝的調控，以及把亞細胞器運送到細胞內正確的位置等。從廣義來看，上述某一種異常均可稱為線粒體功能不全，但一般所指線粒體功能不全主要是指其能量生成功能障礙。線粒體功能不全涉及眾多疾病，如心血管疾病、糖尿病，非酒精性脂肪性肝炎、老年癡呆、巴金森氏病等[2]。本文僅就其在重癥休克發生中的作用作一綜述。

2 線粒體通透性轉變孔(mitochondrial permeability transition pore, mPTP)

mPTP開放是線粒體功能不全重要的發病原因。正常生理狀態下，mPTP呈低電導關閉孔狀；但在缺氧、疾病等病理狀態下，mPTP開放呈高電導開放狀態，是導致線粒體功能不全的主要機制之一。

2.1mPTP的結構 mPTP位于線粒體內膜與外面的結合處，其結構蛋白主要由外膜的電壓依賴性陰離子通道(voltage-dependent anion channel, VDAC)蛋白、內膜的腺苷酸移位酶(adenine nucleotide translocase，ANT)和基質中的親環素D(cyclophilin D，CyPD)組成，此外，還有一些影響mPTP開放的調節蛋白，其中包括近年查明的無機磷酸鹽載體(inorganic phosphate carrier，PiC)、糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β)、己糖激酶Ⅱ(hexokinase II，HKII)、去乙酰化酶sirtuin 3(SIRT3)和信號轉導子及轉錄激活子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3),見圖1[3]。

Figure 1. Schematic diagrams of the mPTP interacting with regulatory proteins.A: closed mPTP and its interaction with inhibitory factors (HKII, p-GSK-3β, SIRT3 and p-STAT3); B: open mPTP and its sensitization to Ca2+by binding of CyPD to PiC and by dissociation of HKII via VDAC phosphorylation by GSK-3β. Conformational change in the mPTP is induced by dissociation of HKII from VDAC and/or by binding of CyPD to PiC. MOM: mitochondrial outer membrane; IM: mitochondrial inner membrane; IMS: mitochondrial intermembrane space.

圖1調節蛋白作用于線粒體通透轉變孔的示意圖(引自文獻[3])

2.2mPTP開放的常見原因

2.2.1缺血缺氧 休克時能量耗竭能夠誘導mPTP開放，另外缺血缺氧后，線粒體經過無氧氧化生成大量乳酸，H+攻擊mPTP并誘導其開放，同時缺血缺氧時線粒體抗氧化能力下降，線粒體生成大量氧自由基攻擊并誘導mPTP開放[4-5]。

2.2.2氧化應激 線粒體在利用氧氣經生物氧化合成能量的過程中，約2%的氧氣會轉化為氧自由基，它主要發生在呼吸傳遞鏈中復合物I和III。正常情況下，氧自由基的合成和內源性清除劑(維生素C、維生素E、谷胱甘肽等)呈現動態平衡。在休克、缺血再灌注、氧化應激等病理情況下，這種平衡被打斷，大量氧自由基合成，攻擊線粒體(膜、核酸、蛋白等)，致使線粒體損傷和mPTP開放，損傷的線粒體合成更多的氧自由基[6-7]。用線粒體D-[3H]-2-deoxyglucose攝取技術查明mPTP開放見于再灌注時段，與此時大量的氧自由基產生有關。

2.2.3溶酶體受損 溶酶體在正常生命活動中發揮重要作用，在正常情況下參與殺菌和物質代謝等，但在病理情況下，如氧化應激，溶酶體膜通透性增加，溶酶體酶和其它凋亡因子釋放，導致線粒體受損，同時受損的線粒體合成大量的氧自由基攻擊溶酶體，形成一個循環。Zhao等[8-9]通過實驗證實了細胞凋亡的溶酶體-線粒體軸心的存在。

2.2.4線粒體鈣超載 正常生理情況下，線粒體內的鈣濃度處于穩態，一些有害因素破壞這種穩態，出現線粒體內鈣分布異常或鈣超載[10]。線粒體KATP抑制劑5-羥基癸酸鹽通過抑制K+攝取，促進線粒體鈣超載，誘導mPTP開放[11-13]，使線粒體合成ATP的功能受到抑制，啟動細胞凋亡程序。

2.2.5凋亡誘導因子 凋亡誘導因子能夠誘導mPTP開放及線粒體受損，它們包括：(1)內源性：Bax、caspase-3、caspase-9等[14]；(2)外源性：蒼術苷(atractyloside, ATR)等[15]。

2.3mPTP開放引起的后果

2.3.1線粒體腫脹 在病理狀態下，mPTP開放，正常不能通過線粒體膜的<1.5 kD的小分子物質(如H+、代謝產物等)自由通過，但大分子蛋白不能通過，從而引起線粒體內膠體滲透壓增加，線粒體內水分含量增加，于是線粒體出現腫脹和結構破壞[16-18]。

2.3.2線粒體跨膜電位降低 正常線粒體處于電壓內負外正的極化狀態，是由質子泵將H+由內膜泵出到膜間隙所致。這種電勢差是線粒體合成ATP必備的電壓驅動力。在mPTP開放時，因為小分子物質(如H+)可以自由出入線粒體，這時線粒體內外的電荷梯度減小，線粒體跨膜電位降低[2，16]。

2.3.3細胞內ATP含量減少 呼吸鏈復合物V(ATP合成酶)是在線粒體膜間隙存在H+濃度梯度的條件下，促使ADP磷酸化合成ATP。前已述及當mPTP開放時，這種質子梯度被破壞，線粒體跨膜電位降低，于是抑制ATP生成[19]。

2.3.4 凋亡蛋白的釋放 在通透轉變孔開放時，線粒體內的細胞色素C、凋亡誘導因子(apoptosis-inducing factor, AIF)等凋亡物質釋放，啟動細胞凋亡程序，誘導細胞凋亡[16]。

2.3.5細胞病性缺氧(cytopathic hopoxia) mPTP開放最終帶來線粒體功能障礙，這時組織中能量減少并非來自呼吸、血液、循環紊亂引起的缺氧，而是由于線粒體損傷使ATP合成障礙所致，此時細胞能量代謝障礙是由細胞本身內在的原因引起，因此被稱為“細胞病性缺氧”[15，20-21]。

3 判定線粒體功能不全的指標

目前已建立的細胞內原位測定線粒體功能的方法避免了分離線粒體帶來的損害，常用的方法有以下幾種：

3.1mPTP狀態 通常采用鈣黃綠素(calcein)-氯化鈷(CoCl2)技術判斷mPTP的開放狀態。鈣黃綠素乙酰氧基甲酯(calcein acetoxymethyl ester, calcein-AM)易進入細胞和線粒體，進入細胞質被細胞內的酯酶切離，產生有綠色熒光的鈣黃綠素，細胞漿內的鈣黃綠素易被鈷離子淬滅。正常情況下，鈷離子不能穿透線粒體膜，但在mPTP開放時，鈷離子可以自由進入線粒體，淬滅線粒體內的鈣黃綠素熒光，因此可以通過分析線粒體內的鈣黃綠素熒光強度評價mPTP開放的程度[3]。

3.2線粒體跨膜電位 常用的評價方法是JC-1熒光探針法，JC-1是一種電位敏感性熒光探針，在正常線粒體以聚合體形式存在，發橘紅色熒光，提示線粒體處于極化狀態；在疾病等情況下，JC-1以單體形式存在，發綠色熒光，提示線粒體去極化，跨膜電位減低[3]。MitoTracker Red、rhodamine、DiOC6等也可被用于評價線粒體膜電位[22-24]。

3.3細胞內ATP含量 它是線粒體功能評價的直接指標。常規使用CellTiter-Glo螢光素酶生物發光法，檢測細胞內ATP含量[21]。休克時細胞內ATP含量減少可以來自氧氣和營養基質供應不足，也可來自線粒體本身病變，帶來ATP生成減少。因此要參考線粒體形態和代謝的其它指標變化才能最終判定線粒體功能不全。

3.4線粒體細胞色素C氧化酶活性 細胞色素C氧化酶是線粒體生物氧化合成ATP的過程中必須的酶，其活性反映線粒體生物氧化的能力。通常使用細胞色素C氧化酶的單克隆抗體和免疫捕獲法測定其活性，已用于評價膿毒血癥的嚴重程度和預后[16,25]。

3.5線粒體超微結構變化 線粒體超微結構正常是線粒體功能發揮的基礎。用常規超薄切片和四氧化鋨染色，電鏡下可見線粒體腫脹、增大，基質透明，嵴斷裂、消失，說明線粒體存在器質性損傷[16]。

4 線粒體功能不全的防治

線粒體功能不全是影響重癥休克發生和預后的重要因素，因此防治線粒體功能不全就成為治療重癥休克的一個新靶點。線粒體功能不全的防治主要從以下幾方面進行,見表1[26]。

表1 重癥休克治療的線粒體靶點[26]

4.1改善營養供應 影響糖代謝和脂質代謝的一些物質，如丙酮酸、葡萄糖、輔酶Q10等，它們能增強線粒體的氧化磷酸化功能，增加ATP產生。但作用是非特異的，對引起線粒體損傷的因素(ROS、鈣超載、mPTP開放等)無直接影響，尚不能屬于線粒體保護劑，雖然丙酮酸已證明有一定的抗氧化活性。

4.2減輕氧化應激 白藜蘆醇通過螯合氧化反應所需的二價鐵降低氧化應激，又能夠抑制線粒體復合物III減少氧自由基生成，發揮線粒體保護作用[26-27]。我室研究的抗休克新藥虎杖苷(白藜蘆醇苷)已證明既有改善微循環增加營養物質供應的作用，又有減少氧自由基合成防治休克線粒體損傷的作用[17-18，28]。

4.3抑制mPTP開放 環孢素A作用于mPTP的亞單位CyPD,降低mPTP對Ca2+敏感性，抑制CyPD與PiC的結合，從而抑制mPTP開放，發揮保護線粒體作用[29]。環孢素A是較早確定的線粒體保護劑，目前研究的方向是不具有免疫抑制副作用的環孢素類化合物。白藜蘆醇不僅能抑制氧自由基生成和螯合二價鐵抑制氧化反應，發揮保護溶酶體作用，從而抑制溶酶體酶和凋亡因子釋放及隨后線粒體損傷的作用，而且能通過磷酸化GSK-3β，抑制mPTP開放[30]。

4.4調節離子通道 線粒體鈣超載會引起mPTP開放和隨后的線粒體功能不全[9-10]，鈣通道抑制劑釕紅能夠通過抑制線粒體鈣超載而抑制mPTP開放,起保護線粒體作用[11]。線粒體ATP敏感性K+通道開放劑二氮嗪通過誘導 K+攝取，抑制鈣超載，達到抑制mPTP開放的目的[12-13]。

已證明重癥休克時，線粒體功能不全使平滑肌細胞中ATP生成減少，它是引起血管收縮反應下降和頑固性低血壓的原因之一(圖2)，用外源性誘導因子蒼術苷引起ASMCs線粒體損傷，亦可導致血管平滑肌收縮反應降低[19]。治療時除了改善微循環以外，應用線粒體保護劑(白藜蘆醇、虎杖苷或環孢素A)可以改善休克時線粒體形態、代謝、及機能的變化，促使重癥休克時頑固性低血壓恢復，有助于提高動物的存活率[1，17-18]，為重癥休克的救治提出新思路。但線粒體功能不全發病機制和有效的保護藥物，尚待進一步臨床驗證。

Figure 2. A tentative scheme of the role of mitochondrial dysfunction in arteriolar smooth muscle cells (ASMCs) in the genesis of low vasoreactivity in hemorrhagic shock. cGMP: cyclic guanosine monophosphate; CsA: cyclosporine A; iNOS: inducible nitric oxide synthase; L-Ca: L-type calcium channel; NE: norepinephrine.

圖2小動脈平滑肌細胞線粒體功能不全引起失血性休克低血管反應性的示意圖(引自文獻[1])

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Roleofmitochondrialdysfunctioningenesisofsevereshock

WANG Xing-min, ZHAO Ke-sen

(GuangdongProvincialKeyLaboratoryofShockandMicrocirculationResearch,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China.E-mail:kszhao@ymail.com)

The high mortality is a leading element of human health that follows severe shock even after blood transfusion and other anti-shock therapy. Therefore, to find out the mechanism of high mortality in severe shock is very critical. As a hotspot in recent years, mitochondrial function has important value in the genesis of many diseases, such as cardiovascular diseases, diabetes mellitus, Alzheimer disease, Parkinson disease, nonalcoholic steatohepatitis and so on. Mitochondrial dysfunction often takes place in relation to the opening of mitochondrial permeability transition pore with intracellular low ATP content in severe shock. The consequence of intracellular low ATP content may lead to the dysfunction of various organs with difficult treatment of severe shock. Therefore, protection against mitochondrial damage is a novel approach for treatment of severe shock. This article summarizes the concept, pathogenesis, detection variables and treatment of mitochondrial dysfunction in severe shock.

線粒體通透轉變孔； 線粒體功能不全； 重癥休克; 三磷酸腺苷

Mitochondrial permeability transition pore; Mitochondrial dysfunction; Severe shock; Adenosine triphosphate

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.04.033

1000-4718(2013)04-0757-05

2012- 09- 26

2012- 12- 30

國家自然科學基金資助項目(No.30672179；No.30971202); 國家科技重大專項(No.2011ZX09101-002-08)；廣東省重大科技專項(No. 2011A080502012)

△ 通訊作者 Tel: 020-61648232; E-mail: kszhao@ymail.com