齊墩果烷及熊果烷型五環三萜抗肝損傷作用及其構效關系研究

寧 娛，張 潤，鄒子軍，孫 洋，陳杰桃，林朝展*，熊天琴，祝晨蔯*

1廣州中醫藥大學臨床藥理研究所，廣州 501045;2廣州中醫藥大學中藥學院，廣州 510006

齊墩果烷型和熊果烷型五環三萜類化合物是廣泛存在于植物中的次生代謝產物，近年來的研究表明，該兩類成分具有較好的抗肝損傷活性［1，2］，可通過促進肝細胞再生，使壞死區迅速修復、降低肝組織炎癥反應、抑制膠原纖維增生等途徑，從而發揮保肝作用。目前已有齊墩果酸、甘草甜素等作為保肝藥物在臨床上分別用于急性黃疸型肝炎和病毒性肝炎的治療。因此，植物來源的三萜類化合物在開發保肝新藥方面顯示了巨大的潛在優勢。

已有文獻研究報道，紫珠屬(Callicarpa)、香茶菜屬(Isodon)植物中多含有三萜類成分［3，4］，而本課題組長期對上述2屬的3種廣東地區習用藥材枇杷葉紫珠、裸花紫珠和狹基線紋香茶菜中五環三萜化合物進行系統的分離鑒定研究，得到32個五環三萜類化合物［5，6］，采用葡萄糖氧化酶GO造氧化肝損傷細胞模型，檢測五環三萜類單體化合物對肝損傷細胞的保護活性，同時利用目前最常用的3D-QSAR方法——比較分子力場分析(Comparative Molecular Field Analysis，CoMFA)［7，8］研究三萜類化合物分子結構參數與氧化肝損傷細胞保護活性之間的三維定量關系，并建立相應的結構活性關系模型，以期為深入研究其保護機制、設計高活性保肝藥提供基礎。

1 儀器與材料

熔點用X6顯微熔點測定儀測定(北京泰克儀器有限公司);NMR用AVANCE AV 400超導核磁共振儀(瑞士Bruker)測定;TMS內標;MS用Agilent QQQ 1260-6460(液相色譜-質譜聯用儀)，Agilent公司(美國)。柱層析硅膠和薄層層析硅膠(青島海洋化工廠);所有分離用有機溶劑均為國產分析純(廣州化學試劑廠);反相硅膠:RP-C18(40～63 μm)。氘代試劑:吡啶(NORELL，USA)，甲醇和氯仿(Cambridge Isotope Laboratories，USA)。

實驗所用枇杷葉紫珠、裸花紫珠和狹基線紋香茶菜分別采自從化國家森林公園、海南臨高裸花紫珠種植基地和清遠狹基線紋香茶菜GAP種植基地，經廣州中醫藥大學藥用植物學教研室潘超美教授鑒定學名為馬鞭草科(Verbenaceae)紫珠屬(Callicarpa L.)植物枇杷葉紫珠(C．konchiana Makino)、裸花紫珠(C．nudiflora Hook.et Arn)和唇形科(Labiatae)香茶菜屬(Isodon)植物狹基線紋香茶菜(I．lophanthoides var．gerardianus)，憑證標本現保存于廣州中醫藥大學中藥學院藥物分析研究室(憑證標本:No.CKM071005;CNF081003;ILG080916)，晾干，粉碎成粗粉，備用。

2 提取與分離

取枇杷葉紫珠、裸花紫珠和狹基線紋香茶菜粗粉各10.0 kg，分別用甲醇(150～200 L)進行滲漉提取，將提取液減壓濃縮。將濃縮液混懸于6.0～10.0 L蒸餾水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進行萃取，將萃取液分別進行減壓濃縮得到各部位浸膏。每個乙酸乙酯部位運用硅膠柱色譜法進行分離，用氯仿-甲醇梯度洗脫，適當合并為若干個流份。根據流份的具體情況，再選用重結晶、硅膠柱色譜、反相硅膠柱色譜、葡聚糖凝膠Sephadex LH-20柱色譜等方法反復分離純化。分別得到五環三萜化合物1～32，純度經過HPLC面積歸一化法測定，均大于99%。

3 結構鑒定

本研究從枇杷葉紫珠、裸花紫珠和狹基線紋香茶菜三種藥用植物中總共分離得到32個三萜類化合物(見表1和表2)，該類成分大部分為三萜苷元，共有25個，只有7個以苷的形式存，分離的三萜類化合物分別屬于齊墩果烷型(10個):齊墩果酸(oleanolic aicd，1)、2α，3β，23-三羥基齊墩果烷-12烯-28-酸-O-β-葡萄 糖 酯 (2α，3β，23-trihydroxy-12-ene-28-oic-O-β-D-glucopyranoside，2)、2α，3β-二羥基-12-烯-28-齊墩 果 酸 (2α，3β-dihydroxyolean-12-ene-28-oic acid，3)、2α，3β，23-三羥基-12-烯-28-齊墩果酸(hyptatic acid，4)、2α，3β，19α，23-四羥基-12-烯-28-齊墩果酸(2α，3β，19α，23-tetrahydroxy-12-ene-28-oic-acid，5)、2α，3β，23，29-四羥基-12-烯-28-齊墩果酸(stachlic acid A，6)、常春藤皂苷元(hederagenin，7)、3-乙酰齊墩果酸(3-acetyl oleanolic acid，8)、2α，3β，19α，23-四羥基-12-烯-28-齊墩果酸-β-D-葡萄糖-(1→4)-β-D-葡萄糖酯 (2α，3β，19α，23-tetrahydroxyolean-12-en-28-oic acid-28-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-Dglucopyranoside，9)、3-O-β-D-葡萄糖-α-香樹脂醇苷(α-amyrin-3-O-β-D-glucopyranosides，10);熊果烷型(22個):3β-乙酰氧基熊果烷-12-烯-28醇(3β-acetoxy-28-hydroxyurs-12-ene，11)、α-香樹脂醇乙酸乙酯(α-amyrin acetate，12)、3β-乙酰氧基-12-烯-28 熊果酸(3β-acetoxy-28-oic acid-12-ene，13)、3β，19α-二羥基-12 烯-28 熊果酸(3β，19α-dihydroxyurs-12-ene-28-oic acid，14)、3β，19α-二羥基熊果烷-12 烯-24，28-二 醇 (3β，19α-dihydroxy-24，28-hydroxyurs-urs-12-ene，15)、2α，3β，19α-三羥基熊果烷-12 烯-24，28-二酸(2α，3β，19α-trihydroxy-urs-12-ene-23，28-dioic acid，16)、3-O-β-L-阿拉伯糖-19α-羥基熊果烷-12 烯-28-酸-甲酯(3-O-β-L-arabinopyranosyl-19α-hydroxy-urs-12-ene-28-O-acid methylester，17)、3-O-β-D-木糖-19α-羥基熊果烷-12 烯-28-酸-O-β-D-葡萄糖酯 (3-O-β-D-xylpyranosyl-19α-dihydroxyurs-12-ene-28-O-β-D-glycopranoside，18)、2α，3-O-β-D-葡萄糖醛酸-19α-羥基-12 烯-28-熊果酸(2α，3-O-β-D-glucuronide-19α-dihydroxyurs-12-ene-28-oic acid，19)、3-β-O-α-L-阿拉伯糖-19α-羥基熊果烷-12 烯-28-酸-β-D-葡 萄 糖 酯 (3-β-O-α-L-arabinopyranosyl-19αhydroxy-urs-12-ene-28-β-D-glucopyranoside oic acid，20)、2β，3β，19α-三羥基熊果酸(2β，3β，19α-trihydroxy-12-ene-28-ursolic acid，21)、熊果酸 (ursolic acid，22)、2α，3β，19，23-四羥基-12 烯-28-熊果酸(myrianthic acid，23)、坡模酸(pomolic acid，24)、2α，19α-二羥基熊果酸(2α，19α-dihydroxy-12-ene-28-ursolic acid，25)、2β-羥基熊果酸 (2α-hydroxy-12-ene-28-ursolic acid，26)、3-O-β-D-葡萄糖-α-香樹脂醇苷(α-amyrin-3-O-β-D-glucopyranoside，27)、α-香樹脂醇(α-amyrin，28)、2α，3α-二羥基熊果酸(2α，3α-dihydroxy-12-ene-28-ursolic acid，29)、2α，19α-二羥基熊果酸 (2α，19α-dihydroxy-12-ene-28-ursolic acid，30)、2α，3β，19，24-四羥基-12-烯-28-熊果酸(2α，3β，19，24-tetrahydroxy-12-ene-28-oic acid，31)、2α-O-乙酰熊果酸(2α-O-acetyl ursolic acid，32)。

4 三萜類成分體外抗肝損傷活性研究

對上述分離得到的齊墩果烷型及熊果烷型五環三萜成分，采用葡萄糖氧化酶GO體外致肝損傷模型進行保肝作用觀察。

根據32個藥物的溶解性，選用相應的溶劑，制備成1000 μg/mL的母液，實驗時，用含10%胎牛血清的培養液稀釋成濃度為 1、10、50、100 μg/mL 的溶液，現用現配。取凍存的L02細胞于37℃水浴鍋中快速搖溶，在超凈工作臺中，移入離心管中，并加入新鮮含10%胎牛血清的RPMI-1640，吹打成細胞懸液，1000 rpm離心3 min，棄上清，細胞沉淀加入新鮮含10%胎牛血清的RPMI-1640，吹打成細胞懸液，接種于培養瓶中，放于5%CO2、濕度95%、37℃條件的培養箱中培養。待細胞達培養瓶底面積分數80% ～90%融合后用PBS洗滌1次，加入0.25%的胰酶適度消化，再加入含10%胎牛血清培養基終止消化，吹打成細胞懸液。1000 rpm離心3 min，棄上清，按1∶3比例傳代。正常細胞對照組、正常細胞模型組、0.1%生理鹽水溶劑對照組、0.1%生理鹽水溶劑模型組、0.1%DMSO溶劑對照組、0.1%DMSO溶劑模型組、32個藥物組。每組設6個復孔。培養好的L02細胞，用0.25%的胰酶適度消化，用新鮮含10%胎牛血清的RPMI-1640吹打成單個細胞懸液，調整細胞密度為5×105/mL，接種到96孔培養板中，放置于37℃、5%CO2的培養箱中培養。24 h之后，吸出舊培養液，加入不含胎牛血清的 RPMI-1640，進行同步化。24 h之后加入相應的各組含藥培養液培養。培養12 h后，模型組及藥物組加入葡萄糖氧化酶GO(終濃度為100 mU/mL)造成氧化應激模型。于GO作用4 h后，每孔加入20 μL MTT溶液，繼續于培養箱中培養4 h后終止培養。小心吸棄孔內上清液，每孔加入 DMSO 150 μL，振蕩10min，溶解結晶物，在酶標儀上490 nm處測定各孔的吸光值(A)。實驗數據以均數+標準差(±s)表示，采用SPSS13.0統計分析軟件處理，顯著性檢驗采用t檢驗，P＜0.05時為差異有統計學意義。與正常細胞對照組比較，0.1生理鹽水溶劑對照組及0.1 DMSO溶劑對照組的吸光值沒有差異。與對照組比較，相應的模型組的吸光值均顯著降低(P＜0.01)。與0.1%生理鹽水溶劑模型組比較，Urosanetype三萜較Oleane-type三萜的保肝活性明顯增強，多羥基取代都使得化合物的保肝活性顯著升高。

圖1 齊墩果烷母核Fig.1 Chemical structures of Oleane-type triterpenoids

表1 齊墩果烷型三萜類化合物Table 1 Structure，experimental and calculated activity values of Oleane-type triterpenoids

5 OH OH CH2OH CH3 OH CH3 COOH H 1.258 0.099 0.239 -0.140 6 OH OH CH3 CH2OH H CH2OH COOH H 2.365 0.374 0.341 0.033 7 H OH CH2OH CH3 H CH3 COOH H 35.522 1.550 1.646 -0.096 8 H OCOCH3 CH3 CH3 H CH3 COOH H 64.35 1.808 1.798 0.010 9 OH OH CH3 CH2OH OH CH3 COOGlu OH 56.332 1.751 1.675 0.076 10 H O-Glu CH3 CH3 H CH3H H ＞100 2.000 1.992 0.088

圖2 熊果烷母核Fig.2 Chemical structures of Urosane-type triterpenoids

表2 熊果烷型三萜類化合物結構、活性數據及預測結果Table 2 Structure，experimental and calculated activity values of Urosane-type triterpenoids

5 三萜類成分三維定量構效關系的研究

本文采用Tripos公司的SYBYL 1.3分子模擬軟件包完成所有分子模型構建和統計分析工作。如無特殊說明，所選參數均為默認值。本文研究的32個三萜類化合物的保肝活性數據(IC50)來源于體外保肝實驗，見表1，活性數據形式經過負對數變換(pIC50=-lgIC50)，這種變換不影響模型的內在規律。隨機選擇4個化合物作為測試集，用來檢驗模型的預測能力，其余化合物為訓練集。

第一步，活性構象確定。由于CoMFA研究涉及到化合物分子的三維結構，因此確定活性構象是CoMFA研究的關鍵步驟。先用sybyl x1.3軟件中sketch molecule構建化合物，然后以分子力學程序Minimize進行能量優化，優化過程中采用Powell能量梯度法、Tripos力場、Gasteiger-Hckel電荷，迭代1000次，能量收斂限定為0.005 kj/mol，得到優化分子結構，建立分子庫。

第二步，分子疊合。是CoMFA方法中的關鍵一步，對于所建立的三維構效關系模型質量有重要影響。當活性構象確定后，一般根據一定的規則，如藥效團、力場、公共骨架等進行分子疊合，使每個分子采用具有最大力場相似性的空間取向進行計算。本研究選擇活性最好的化合物31為模板分子，用A-lign Database進行骨架疊合，見圖3。

第三步，CoMFA模型的構建。將重疊好的分子置于自動生成的三維網格中，網格包含所有分子，并且在 X、Y、Z軸方向至少延伸0.4 nm。用一個sp3雜化的正碳原子探測每個格點上的立體場與靜電場能，利用偏最小二乘法(PLS)建立模型，首先用SAMPLS方法做LOO(Leave-one-out)交叉驗證，得到最佳主成分數和交叉驗證系數q2。然后在最佳主成分數下做非交叉驗證，建立相應的CoMFA模型。隨后，采用SteDev* Coeff方法顯示三維等值圖，直觀地反映出立體場和靜電場對活性的影響。

圖3 化合物的分子疊合圖Fig.3 Superimposition map of compounds

6 結果與討論

本文以28個化合物為訓練集，在自動生成的網格上，以sp3雜化的正碳原子為探針，計算分子在每個格點上的立體場和靜電場(相應的立體作用能與靜電作用能的閾值均用默認值)，交叉驗證相關系數q2為0.719，最佳主成分數為6;由最佳主成分數進行非交叉驗證得到常規相關系數γ2為0.976;標準方差(SEE)為0.124，數據組之間的平均平方誤差與數據組內部的平均平方誤差的比值(F)為142.001，立體場和靜電場的貢獻值分別為86.7%%和13.3%，表明空間效應是主要的影響因素。一般認為，q2大于0.5時，所得模型具有可信的預報能力，非交叉驗證的常規相關系數大于0.9時，表明模型有很好的自身一致性。本模型 q2達到0.719，γ2達到0.976，說明該模型具有較好的預測能力和自身一致性。由CoMFA模型預測的各化合物活性及其與實驗值的殘差見表1。預測值與實驗值的相關分析圖見圖4。

圖4 CoMFA模型預測活性與實驗活性之間的關系Fig.4 Predicted and experimental pIC50for the CoMFA model

圖5為較為理想的CoMFA模型三維等值圖，從疊合分子周圍空間可看出化合物的各種不同場對活性的影響。立體場分布圖(5A)中，在綠色區域引入大體積取代基或在黃色區域減小取代基的體積有利于化合物活性的提高，靜電場分布圖(5B)中，在藍色區域引入正電性基團或在其紅色區域引入負點性較大的基團將有利于化合物活性增加，分析可得Urosane-type三萜較Oleane-type三萜的保肝活性明顯增強;在3、19、20、23和24等5個取代位置添加帶負電荷的基團如-OH，則使化合物的保肝活性明顯提高;如在這些位置引入疏水性較強的基團如-CH3等，則可能使化合物的保肝活性降低。在19和23兩個位置上接入-OH化合物比其他位置接上-OH的化合物保肝活性明顯要好。該結論同藥理活性實驗結果一致，進一步說明本文所建立的CoMFA模型具有較好的預測能力。

綜上所述，本文對32個五環三萜類化合物進行的3D-QSAR研究，構建了一個預測能力較強的CoMFA模型，其交叉驗證系數q2為0.719，非交叉驗證系數γ2為0.976，統計方差比F=142.001，影響藥效立體場的靜電場貢獻分別為86.7%%和13.3%，表明空間效應是主要的影響因素。以上研究結果說明Urosane-type三萜可以作為保肝藥的候選先導化合物，為后續深入進行具有針對性的局部結構改造和優化提供較為理想的模板，有望開發出具有更高保肝活性的化合物。

圖5 CoMFA模型等值圖Fig.5 Contour maps of the CoMFA model

1 Zhou ZY(周志勇)，Yuan D(袁丁).Progress in studies on pharmacological effect of oleanolic acid.China J Hospit Pharm(中國醫院藥學雜志)，2008，28:2031-2032.

2 Xiong XJ(熊筱娟)，Chen W(陳武)，Xiao XH(肖小華)，et al．The comparative protective effect of ursolic acid and oleanolic acid on experimental liver injury in mice.J Jiangxi Normal Univ(江西師范大學學報)，2004，28:541-543.

3 Pan P(潘萍)，Sun QS(孫啟時).Chemical constituents of Callicarpa macrophylla Vahl..J Shenyang Pharm Univ(沈陽藥科大學學報)，2006，23:565-567.

4 Ren FZ(任鳳芝)，Qu HH(屈會化)，Luan XH(欒新慧)，et al．Studies on the chemical constituents of Callicarpa bodinieri Levl.Nat Prod Res Dev(天然產物研究與開發)，2000，13:33-34.

5 Lin CZ(林朝展)，Zhu CC(祝晨蔯)，Deng GH(鄧貴華)，et al．Studies on the chemical constituents of Callicarpa kochiana.J Chin Med Mater(中藥材)，2010，33:897-900.

6 Deng JW(鄧潔薇)，Zhang CX(張翠仙)，Lin CZ(林朝展)，et al．Analysis of chemical constituents from Isodon lophanthoides var.gerardianus(part I).Tradit Chin Drug Res Clin Pharm(中藥新藥與臨床藥理)，2009，20:551-553.

7 Wu XY(伍小云)，Zhang JJ(張嘉杰)，Wu SG(吳曙光).Three dimensional quantitive structure activity relationship of VEGFR-2 tyrosine inhibitors.Acta Sci Nat Univ SunYatSeni(中山大學學報)，2010，49:529.

8 Li JB(李嘉賓)，Xuan WS(宣文勝)，Niu J(牛菊)，et al.Synthesis，biological evaluation and 3D-QSAR study of 1-(1.4-benzodioxan-2-ylcaronyl)-4-aryloxyalkyl-piperazines as α1-adrenoceptor antagonists.J China Pharm Univ(中國藥科大學學報)，2010，41:499-504.