重金屬脅迫下芫荽生理及揮發性成分變化分析

魏金鳳，李光勇，王俊霞，康文藝*

1河南大學中藥研究所;2河南大學民生學院，開封 475004;3河南醫藥技師學院，開封 475008

芫荽為傘形科植物芫荽(Coriandrum sativum L.)的帶根全草［1］。又名香菜，香荽和胡荽等，一年生或兩年生草本，因其有濃郁香氣而得名。我國各地均有栽培，對磷肥的反應最為敏感，磷肥可提高種子精油的含量。芫荽味辛，性溫。歸肺、脾、肝經。主治風寒感冒，麻疹，痘疹透發不暢，食積氣滯，脘腹脹痛或嘔惡，此外，芫荽有升散止痛之功，又有解毒行散之能。芫荽全草及果實均可入藥，莖葉作蔬菜和調香料，有健胃消食作用;果入藥，有驅風、透疹、健胃、祛痰之效［2］。

國內外對使用不同提取方法所得揮發油的報道頗多，但還未見用固相微萃取技術提取芫荽揮發性成分的報道。前人的研究集中在芫荽揮發油體外抗菌和抗氧化活性方面。周凌霄等［3］對芫荽精油的研究表明，對大腸桿菌和白葡萄球菌的抑制作用。J.C.Matasyoh［4］等報道水蒸氣蒸餾法所得芫荽揮發油對G+金黃色葡萄球菌和芽孢桿菌以及G-埃希氏菌屬、沙門氏菌等顯示有顯著抑菌活性。另有研究發現，芫荽水提物可減輕抗原蟲藥物甲硝唑引起的基因毒害效應［5］。陸占國等［6］報道超聲波法和水蒸氣蒸餾法得到的芫荽莖葉精油具有明顯地清除亞硝酸鹽作用，水蒸氣蒸餾法［7］得到的精油亦具有很強的清除DPPH自由基能力，具有很好的抗氧化活性。

土壤系統中的重金屬污染與治理一直是國際上的難點與熱點研究課題［8］。受重金屬離子脅迫的植物可啟動多種機制提高對重金屬的抗性。從而降低重金屬離子對組織細胞的毒害。植物體內的潛在機制主要是通過避免重金屬離子在細胞內敏感位點大量積聚，并產生避免重金屬離子傷害作用的可溶性蛋白質，使植物增強傷害躲避能力和自我平衡能力。過去的研究大多只注重于單個污染物在土壤中的遷移及對植物生長的影響，隨著人們對環境問題的認識不斷深入，研究的重點也轉向多種污染物復合污染的研究。本實驗選擇的實驗材料芫荽不僅有食用價值，而且有藥用價值，因此研究重金屬污染對它的影響是十分有意義的，關系到食品安全及用藥安全。

1 材料與儀器

1.1 材料

芫荽種子(2011年4月，購于河南省開封市金明區市場)。

1.2 儀器

紫外分光光度計、離心機、水浴鍋、磁力攪拌器、酸式滴定管、電感耦合等離子體發射光譜儀(美國Perkin Elmer公司，Optima 2100 DV);6890 N型氣相色譜-5975型質譜聯用儀(美國安捷倫公司);手動固相微萃取進樣器和 65 μm聚二甲基硅氧烷(PDMS-DVB)萃取頭(美國Supelco公司);C6-C26正構烷烴標準品(美國Alfa Aesar公司)。

2 實驗方法

2.1 廢電池浸出液的制備

取華太5號鋅錳干電池若干節，破壞后按1∶20的固液比加入Hoagland營養液［9］，溶液用磁力攪拌器攪拌48 h，靜置1 d，再攪拌48 h后，靜置1 d用吸管取無色透明上清液待實驗使用，所得為浸出原液(以下稱原液)。以原液為基礎稀釋100、50、10倍后得到3個梯度質量分數的廢舊電池脅迫液。使用電感耦合等離子體發射光譜儀測得原液中Cr、Cd、Co、Ni、Zn、Mn 的含量依次為 8.8、7.4、13.6、7.8、478.4、144.2 mg/L。

2.2 幼苗的培養及脅迫

實驗于2011年4月開始進行，將芫荽種子均勻撒于裝土帶孔的托盤中，每天光照12 h，傍晚澆水1次，待種子發芽后將植株從盤中脫出，洗凈根系，移至裝有蛭石的小盆中，置于托盤中。植株在蛭石中適應至長勢穩定后，改用經Hoagland營養液稀釋不同倍數的廢舊電池脅迫液隔天進行脅迫處理。于每天上午9點澆灌脅迫液，隔天脅迫，共處理7次。脅迫開始后的第15 d，從植株上剪取中部莖段的葉片進行各項生理指標的測定。

2.3 測定方法

參照文獻［10］方法，考馬斯亮藍G-250法測定可溶性蛋白含量;硫代巴比妥酸(TBA)法測定過氧化物脂質MDA含量;愈創木酚法測定POD活性;氮藍四唑(NBT)還原法測定SOD活力;磺基水楊酸法測定游離脯氨酸含量;苯酚法測定可溶性糖含量。參照文獻［11］，高錳酸鉀滴定法測定CAT活力，丙酮-無水乙醇等體積混合法測定葉綠素含量。

2.4 實驗方案

芫荽幼苗在蛭石中長勢穩定之后開始處理，以Hoagland營養液為對照，廢舊電池原液用Hoagland營養液分別稀釋100倍、50倍和10倍3個梯度澆灌，每個處理重復3次。

2.5 揮發性成分的測定

2.5.1 揮發性成分的提取

將各試驗組芫荽在脅迫開始的第15 d拔出，洗凈根系，陰干。使用前先將SPME的萃取纖維頭在氣相色譜的進樣口老化10 min，老化溫度為250℃，載氣體積流量為1.0 mL/min。取各組陰干芫荽葉各0.7 g，置于5 mL的樣品瓶中，蓋上蓋子，插入65 μm PDMS萃取纖維頭，于80℃下頂空取樣30 min后，立即取出，在氣相色譜儀進樣口(250℃)，脫附1 min。

2.5.2 GC/MS分析條件

HP-5 MS石英彈性毛細管柱(30.0 m ×250 μm，0.25 μm);載氣為高純氦氣(99.999%)，流速為1.0 mL/min;進樣口溫度為250℃;色譜柱初始溫度50℃(保持1.0 min)，以3℃/min升溫至120℃(保持2 min)，最后以4℃/min升溫至210℃(保持10 min)。不分流進樣。

質譜條件:電離方式:EI源，電離能量70 eV;離子源溫度為250℃;四極桿溫度150℃;傳輸線溫度為280℃;四級桿溫度為150℃;電子倍增器電壓1765 V。質量掃描范圍為30～440 amu，譜圖檢索:采用RTLPEST3.L和NIST05.L進行檢索。

2.5.3 保留指數測定

按照文獻［12］，測定各組分的保留時間，計算出各組分的Kovats保留指數。

3 結果與分析

3.1 生理指標的變化

廢電池浸出液脅迫對芫荽幼苗滲透調節物質、活性氧系統、膜脂過氧化水平等的影響如圖1～3。

圖1 廢電池浸出液脅迫對芫荽幼苗葉片滲透調節物質含量的影響Fig.1 Effect of waste battery lixivium stress on contents of osmotic adjustment components of seedling leaves of C．sativum

由圖1可以看出，隨著廢電池浸出液稀釋倍數的減小，滲透調節物質可溶性糖、脯氨酸和可溶性蛋白含量均呈先升后降的趨勢，可溶性糖和游離脯氨酸均在稀釋100倍組含量達到最大值，分別為對照組的1.24倍、4.30倍，之后迅速下降。可溶性蛋白含量在稀釋50倍組含量達到最大值，為對照組的1.25倍，稀釋10倍組稍有下降。一般認為，重金屬脅迫下植物體內碳水化合物代謝紊亂，蛋白質的代謝變化也將在一定程度上直接反映植物對重金屬脅迫的抗性適應能力大小，細胞內可溶性脅迫蛋白含量增加可以使植物組織細胞減輕傷害，也可參與滲透調節。總觀上圖，不同濃度廢電池浸出液處理組的滲透調節物質中，可溶性糖和脯氨酸含量變化較為明顯，說明芫荽幼苗中可溶性糖和脯氨酸對重金屬脅迫響應靈敏，芫荽通過積累這些小分子有機化合物，降低植物體內滲透勢，增強植物組織和體細胞的滲透調節能力，以利于逆境脅迫下維持植物體正常生長所需水分，穩定生物大分子結構，抵抗重金屬脅迫，在一定程度上減弱重金屬對植物體的毒害效應，提高抗逆性，是芫荽適應重金屬脅迫的重要機制之一。由圖1看出，各濃度電池浸出液脅迫后，脯氨酸含量均高于對照組，但污染濃度較高時，脯氨酸及可溶性糖積累量卻與受脅迫濃度呈負相關。說明脅迫液濃度增加至一定程度時，幼苗抗重金屬污染能力將有所減弱。

圖2 廢電池浸出液脅迫對芫荽幼苗葉片活性氧系統CAT、SOD活力的影響Fig.2 Effect of waste battery lixivium stress on CAT and SOD activities of seedling leaves of C．sativum

圖3 廢電池浸出液脅迫對芫荽幼苗葉片POD活力及MDA含量的影響Fig.3 Effect of waste battery lixivium stress on MDA content and POD activity of leaves of C．sativum

活性氧系統及膜脂過氧化水平是植物抗逆性的重要指標。植物膜保護的三大酶系—SOD、POD和CAT是細胞中防止ROS過量產生的重要抗氧化酶系統［13］。由圖2、3可以看出，在廢電池浸出液脅迫誘導下，芫荽幼苗葉片中SOD、POD活性變化趨勢一致，隨著電池浸出液稀釋倍數的減小，即重金屬污染程度的上升，二者活性比對照組明顯增加，在稀釋50倍組，活性達到最大值，分別為對照組的3.15倍、6.04倍，再減小稀釋倍數至10倍，SOD、POD活力分別下降至對照組的2.47倍、3.94倍，仍顯著高于對照組。CAT活力在稀釋100倍組最大，為對照組的1.32倍，隨著稀釋倍數的減小，CAT活力依次為對照組的107%、96.41%。抗氧化酶系統中，SOD是防御活性氧的關鍵酶，能夠歧化超氧陰離子自由基為O2和H2O2，而POD和CAT則催化H2O2形成H2O和 O2，只有 SOD、POD、CAT三者協調一致，才能使植物體內活性氧自由基維持在較低的水平，使植物進行正常的生長和代謝。在廢電池浸出液復合重金屬污染條件下，芫荽葉片中的SOD、POD活性隨著稀釋倍數的減小，污染程度的加深，活性明顯增加，說明這兩種酶在芫荽幼苗對復合重金屬的抗性中起到主要作用。MDA含量受SOD和POD協同控制，是反映膜脂過氧化水平的重要指標之一，能與細胞內各種成分發生反應，引起酶與質膜損傷，MDA含量變化與膜透性變化呈正相關，反映植物受逆境傷害的程度［14］，電池浸出液稀釋 100倍、50倍、10倍組的MDA含量分別是對照組的165.82%、112.03%、105.91%。MDA含量總體呈增加趨勢，說明在復合重金屬脅迫下抗氧化酶活性有所增加，但芫荽幼苗的質膜在一定程度上受損。

3.2 芫荽葉片中揮發性成分的測定

按2.5所述實驗方法和條件，對固相微萃取法提取的芫荽葉揮發性成分進行GC/MS分析，計算機質譜數據系統檢索(RTLPEST3.L和NIST05.L)，面積歸一化法確定各成分的百分含量，各組分按照從氣相色譜HP-5MS柱中流出的順序，結果見表1。

表1 不同脅迫處理對芫荽葉中揮發性成分及含量的影響Table 1 Effect of waste battery lixivium stress on the volatile components of C．sativum leaves

由表1可以看出，芫荽葉的揮發性成分主要以不飽和脂肪酸酯、飽和烷烴、醛、醇為主。與索氏提取［15］和超聲提取［6］所得精油成分有較大差別。其中異戊醛、壬烷、癸酸甲酯、n-棕櫚酸僅在廢電池浸出液脅迫組中檢測到，說明芫荽幼苗在電池浸出液復合污染條件下，通過自身代謝的調節，合成新的揮發性成分。4，5-二(甲氨基)芴在對照組及稀釋100倍組檢測得到，稀釋50倍及10倍組，檢測不到該組分。2，2，4-三甲基-1，3-戊二醇二異丁酸酯含量最高(對照組為13.36%)，在受到輕微重金屬污染下(稀釋100倍組)，含量有所升高，為對照組的118.10%，隨著重金屬污染程度的加深，含量下降，稀釋10倍組，該組分含量為對照組的75.30%。亞油酸甲酯和亞麻酸甲酯含量的變化均在稀釋50倍組達到最大值，分別為對照組的112.66%、150.70%。由此可知，芫荽幼苗在重金屬污染調節下，揮發性成分的種類及含量會發生一定的變化，從而可能影響芫荽精油的抗菌、抗氧化等生物活性。

4 結語

本文對廢電池浸出液脅迫下的芫荽幼苗從生理及揮發性成分兩個方面綜合評價復合重金屬污染對芫荽食用和藥用價值的影響。試驗選擇開始脅迫后第15 d測定芫荽葉片中生理指標的變化，在于此時處于幼苗期的芫荽，不同稀釋倍數重金屬溶液脅迫組表觀差異明顯，與對照組相比，隨著脅迫程度加深，芫荽葉片顏色由嫩綠逐漸轉為深綠，葉片萎蔫，葉面積減小，葉片生長受阻。芫荽在受到重金屬脅迫時，通過主動積累各種滲透調節物質來抵抗逆境，如芫荽葉中可溶性糖、脯氨酸和可溶性蛋白含量在受到輕度脅迫時含量升高，亦由本課題組對荊芥的脅迫研究結果中加以證明［16］。細胞內酶系統總的變化趨勢為合成酶類活性下降，而水解酶類及某些還原酶類活性增高。植物受到輕中度逆境脅迫時，保護酶體系的主要酶類超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)活性上升，重度逆境脅迫時，其活性將有不同程度下降［17］。本研究發現，在適度的廢電池浸出液脅迫條件下(稀釋100倍)，芫荽幼苗抗氧化酶活性增高，清除活性氧的能力增強;隨脅迫液濃度上升，抗氧化酶活性有下降趨勢，且呈濃度依賴性，導致幼苗抵御活性氧能力減弱，表明芫荽幼苗具有一定的抗重金屬污染能力。另外，某些揮發性成分在對照組中檢測不到，卻在受重金屬脅迫的芫荽幼苗葉片中檢測出來。廢舊電池浸出液中含有多種重金屬離子，復合作用十分復雜，可能因植物組織或部位不同，重金屬濃度和比例不同，引起表觀生理指標及揮發性成分含量變化。這些成分含量的變化表明，芫荽生長在受到較低濃度重金屬離子脅迫時，機體內部通過自身代謝的調節抵御逆境，及某些特定酶的參與，進而引起芫荽揮發油中具有天然活性的揮發性成分的變化，其藥用價值是否隨之受影響及影響的大小，有待進一步深入的研究。

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