HPLC-UV-MS/MS法對金線蓮中黃酮類組分的鑒定和測定

鄭成鳳，潘裕添，蔡文燕，苑小寧，高 飛*

1閩南師范大學化學與環境科學系;2閩南師范大學菌物產業工程技術中心，漳州 363000

金線蓮［Anoectochilus roxburghii(Wall.)Lindl］為蘭科開唇蘭屬植物，為多年生珍稀中草藥，主要分布于我國福建、臺灣、云南等省，民間多用于治療支氣管炎、糖尿病、風濕性關節炎、小兒急驚風及小兒破傷風等疾病。金線蓮只能生于闊葉林下且常被樹葉遮蓋的陰濕地，對于生長的濕度、溫度、光度等因素極為苛求，并且自然繁殖成活率極低，野生金線蓮的資源蘊藏量很稀少。因此，近年來，國內很多學者開始通過組織培養育苗技術對金線蓮進行人工栽培［1］，及對組培和野生金線蓮中化學成分進行對比分析研究。金線蓮的主要活性成分為多糖和黃酮類化合物，并含有少量有機酸、生物堿和甾體等［2-4］。其中黃酮類物質水仙苷具有抗氧化、抗腫瘤、抗病毒等多種生物活性［5］。雖然，研究結果證實金線蓮中含有水仙苷成分［6］，但對其含量測定的研究鮮有報道。因此，本文運用高效液相色譜-紫外-質譜聯用法(HPLC-UV-MS)對金線蓮的醇提液中黃酮類化合物進行分離分析及含量測定，并對組織培養金線蓮和野生金線蓮中的水仙苷等黃酮類物質的含量進行比較分析，以期為組培金線蓮的質量控制提供依據。

1 儀器與材料

Agilent HPLC1200(含在線脫氣、四元泵、自動進樣器、柱溫箱和DAD檢測器)(美國安捷倫公司);Agilent 6320 Ion Trap LC/MSD(ESI離子源，美國安捷倫公司)。

福建金線蓮I、福建金線蓮II、臺灣金線蓮I和臺灣金線蓮II(均由潘裕添教授課題組培養提供);野生金線蓮(云南);水仙苷(異鼠李素-3-O-β-D-蕓香糖苷)、山奈酚和異鼠李素(純度≥98%，購自上海源葉生物科技有限公司);蘆丁(槲皮素-3-O-β-D-蕓香糖苷)和槲皮素(純度≥98%，購自國藥集團化學試劑有限公司);甲醇、乙醇和甲酸(分析純，西隴化工股份有限公司，均經實驗室重蒸提純);乙腈(色譜純，德國默克試劑);超純水(Milli-Q Gradient)。

2 實驗方法

2.1 檢測條件

質譜條件:離子源:ESI;檢測模式:負模式;霧化氣壓力(Nebulizer):35.0 psi;干燥氣流速(Dry Gas):12.0 L/min;干燥氣溫度(Dry Temp):325℃;掃描范圍為:50～1500 amu;毛細管出口電壓(Capillary Exit Voltage):-136.7 V;高壓毛細管(HV Capillary):3500 V;碎裂電壓(Fragmentation Amplitude):1.0 V;碎裂寬度(Fragmentation Width):4.00 m/z;碎裂時間(Fragmentation Time):40000 μs;碎裂延遲(Fragmentation Delay):0 μs。

液相色譜條件:保護柱:Eclipse XDB-C18Analytical Guard Column(4.6 × 12.5 mm，5 μm);色譜柱:ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6 × 150 mm，5 μm);流速:0.5 mL/min;柱溫:35℃;檢測波長:368 nm;進樣體積:10 μL;流動相:0.03%甲酸水溶液(A)，乙腈(B);梯度洗脫程序如下:0～10 min，20%(B);10～12 min，20% ～24%(B);12 ～20min，24%(B);20～25min，24% ～30%(B);25 ～48min，30%(B)。

2.2 金線蓮中黃酮類化合物的提取

將金線蓮全草冷凍干燥，粉碎，備用。準確稱取金線蓮樣品1.0000 g置于具塞三角燒瓶中，加入20.0 mL 80%乙醇溶液浸泡過夜(約24 h);次日，超聲15 min，靜置片刻，移取上清液，在殘渣中再加入20 mL 80%乙醇溶液超聲15 min，重復3次，合并4次上清液。過濾，減壓濃縮，以80%乙醇溶液定容至10 mL，得供試品溶液。經0.45 μm微孔濾膜過濾，備用。

2.3 對照品溶液的配制

準確稱取蘆丁、槲皮素、水仙苷、山奈酚和異鼠李素，分別以甲醇溶解配制成含蘆丁1.04 mg/mL、槲皮素1.10 mg/mL、水仙苷1.01 mg/mL、山奈酚1.02 mg/mL和異鼠李素1.02 mg/mL的單一對照品溶液。

精密稱取蘆丁0.00316 g、水仙苷0.00605 g、槲皮素0.00095 g、山奈酚0.00100 g和異鼠李素0.00105 g，以甲醇溶解定容至25 mL，得到對照品混合儲備液。分別精密移取對照品混合儲備液0.20、0.50、1.00、2.00、4.00、6.00 和 8.00 mL 置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋定容至10 mL，配制成不同濃度的對照品混合液。

3 結果與討論

3.1 金線蓮的黃酮類組分的確定

精密吸取各單一對照品溶液、對照品混合溶液和福建金線蓮I供試品溶液10 μL，按照2.1液相色譜和質譜檢測條件分別進行檢測分析。對單一對照品溶液和對照品混合溶液的色譜圖及其質譜圖進行比較，確定色譜峰2、5、8、9 和10(圖1-A)分別為蘆丁、水仙苷、槲皮素、山奈酚和異鼠李素。根據對照品混合溶液和福建金線蓮I供試品溶液中對應色譜峰的保留時間(見圖1)，以及相應峰的一級及其二級質譜碎片離子(見表1)，可確定該供試品溶液含有蘆丁、水仙苷、槲皮素、山奈酚和異鼠李素，進一步分析該供試品溶液的色譜圖和各色譜峰的一、二級質譜圖，可初步推測該供試品溶液還含有其他5種黃酮類物質，其對應色譜峰為1、3、4、6和7(見圖1-B)。

圖1 對照品溶液(A)和福建金線蓮I供試品(B)的HPLC色譜圖(368 nm)Fig.1 HPLC-UV(at 368 nm)chromatograms of mixed reference substances(A)and Fujian ARL-I sample(B)

表1 福建金線蓮I供試品的一級和二級質譜數據Table 1 MS and MS/MS data of Fujian ARL-I sample

圖2A～E分別為福建金線蓮I供試品溶液中1、3、4、6和7號色譜峰的一級和二級質譜圖。由圖2-A可知，1號峰的一級質譜圖中，基峰為［M-H］-離子峰，其質荷比m/z=639.2，可推測為異鼠李素-3，7-O-β-D-二葡萄糖苷的準分子離子峰;以639為目標離子，所得的兩個碎裂離子的質荷比分別為477.0 和 315.0，可推測為異鼠李素-3，7-O-β-D-二葡萄糖苷分別脫去一個和兩個葡萄糖基團的碎片離子［M-C6H10O5-H］-和［M-2C6H10O5-H］-，其結果與文獻［7］基本一致。由圖2-B可知，3號峰的一級質譜圖中，基峰為［M-H］-離子峰，其質荷比 m/z=463.2，可推測為槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷的準分子離子峰;以463為目標離子，所得碎片離子的m/z=300.9，為槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷脫去1個葡萄糖基團的［M-C6H10O5-H］-離子峰，實驗結果與文獻［4，8］相符合。由圖2-C可知，4號峰的一級質譜圖中，基峰m/z=593.2，可推測為山奈酚-3-O-β-D-蕓香糖苷的準分子離子峰［M-H］-;以593為目標離子，得到m/z=284.9的碎片離子，是山奈酚-3-O-β-D-蕓香糖苷裂解脫去蕓香糖基團后的［M-C12H20O9-H］-離子峰，實驗數據同文獻相一致［4，9］。由圖2-D 可知，6號峰的一級質譜中，基峰為m/z=447.3，可推測是山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷的準分子離子峰［M-H］-;以447為目標離子，所獲得碎片離子m/z=284.9，為山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷脫去1個葡萄糖基團的［M-C6H10O5-H］-離子，同時在低質量區出現了山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷特有的碎片離子峰 m/z=255.1和m/z=151，實驗結果與文獻相一致［8］。由圖2-E可知，7號峰的一級質譜圖中，基峰為［M-H］-離子峰，其質荷比m/z=477.1，推測為異鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷，以477為目標離子，其二級質譜所獲得的碎片離子的質荷比為314.1，為異鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷脫去一個葡萄糖自由基而產生的［M-C6H11O5-H］-離子，并且產生 m/z=357.0、285.1、271.0和151.0離子碎片，所得實驗數據與文獻相符合［7，10］。

通過分析不同來源的金線蓮供試品溶液的HPLC色譜和質譜圖，發現所含黃酮類化合物不盡相同(見表2)，其中以福建金線蓮I、福建金線蓮II和臺灣金線蓮II含黃酮類化合物成分最豐富。

3.2 HPLC-UV方法學考察

3.2.1 標準曲線

分別精密吸取不同濃度的對照品混合液10 μL，按照2.1的液相色譜條件進行測定。以對照品的濃度(C，μg/mL)為橫坐標(X)，液相色譜峰的平均峰面積(A，mAU)為縱坐標(Y)，繪制標準曲線，其回歸方程、相關系數、線性范圍及檢測限見表3。結果表明這些化合物在對應的濃度范圍內，其峰面積值和濃度呈現出良好的線性關系。

圖2 福建金線蓮I供試品中未知組分的一級、二級質譜圖Fig.2 MS and MS/MS spectra of unknown components of Fujian ARL-I sample

表2 金線蓮樣品中黃酮類化合物的組分Table 2 Components of flavonoids of ARL samples

表3 對照品的線性回歸方程和檢測限(n=8)Table 3 The regression equations and LOD for five reference substances(n=8)

3.2.2 精密度

取對照品混合液10 μL，連續進樣6次，按照2.1的色譜條件進行測定。蘆丁、槲皮素、水仙苷、山奈酚和異鼠李素的色譜峰面積的RSD(相對標準偏差)和保留時間的RSD均小于0.50%，表明儀器的精密度良好。

3.2.3 穩定性

取福建金線蓮I供試品，室溫環境下分別在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h、36 h、48 h 時進樣10 μL進行測定，各黃酮類組分的色譜峰面積的RSD均小于1.87%，表明供試品溶液在48 h之內穩定性良好。

3.2.4 回收率

取福建金線蓮I樣品6份，分別加入3個不同濃度的對照品混合液(每個濃度2份)，按照2.1的色譜條件測定，計算平均回收率，結果見表4，蘆丁、槲皮素、水仙苷、山奈酚和異鼠李素回收率均在98～106%范圍內，符合國家藥典要求。

表4 福建金線蓮I的回收率(n=3)Table 4 Recoveries of the five flavonoids in Fujian ARL-I(n=3)

3.3 樣品的測定

將福建金線蓮I、福建金線蓮II、臺灣金線蓮I、臺灣金線蓮II和野生金線蓮樣品分別按照2.2方法制成供試品溶液，在2.1的色譜條件進行測定，以外標法計算蘆丁、水仙苷、槲皮素、山奈酚和異鼠李素的含量(見表5)。結果表明福建金線蓮I、II包含了野生金線蓮的黃酮類成分，且含量較高，故以福建組培金線蓮代替野生金線蓮是可行的。而臺灣組培金線蓮所含黃酮類組分和含量同野生金線蓮相差較大，說明該組培方法有待進一步優化和改善。

表5 金線蓮樣品中5種化合物的含量(n=2)Table 5 Content of five compounds detected in five samples of ARL(n=2)

4 結論

根據高效液相色譜-質譜聯用法、二級質譜碎片離子提供的信息和相關文獻報道，確定出金線蓮中含有10種黃酮類組分;異鼠李素-3，7-O-β-D-二葡萄糖苷、蘆丁、槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-β-D-蕓香糖苷、水仙苷、異鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷和異鼠李素為共有組分，其中水仙苷的含量最為豐富。實驗結果還表明，組培福建金線蓮比野生金線蓮含有的黃酮類組分多且含量大，有替代野生金線蓮潛力。本研究所建立的方法簡便快捷，選擇性好，可為金線蓮組織培養質量控制提供依據。

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