超聲輔助雙水相體系提取國槐葉黃酮

李彩霞，高海寧* ，張喜峰，張國強

1河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院;2甘肅省高校河西走廊特色資源利用省級重點實驗室，甘肅張掖 734000

黃酮類化合物是植物重要的次級代謝產(chǎn)物，廣泛存在于植物的各個器官，包括根、莖、葉、果實及花中。研究發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物具有抗氧化、抗感染、抗腫瘤［1-3］、抗病毒［4］、保肝［1，2］等多種生理功能，因而黃酮被稱為“第七類營養(yǎng)素。由于黃酮具有很好的醫(yī)藥保健等功能，因此近年來植物中黃酮的提取及活性已經(jīng)成為人們研究的熱點。

國槐(Sophora japonica L.)為豆科槐屬的落葉喬木，別名槐樹、中國槐、槐米樹等。國槐國內(nèi)種植范圍廣，資源豐富，是綠化樹，行道樹，蜜源樹的優(yōu)良品種之一，國槐葉每年秋季脫落后，全部被廢棄或者置于路旁，利用率很低，造成資源的巨大浪費。近年來，國槐中生物活性物質(zhì)的已引起了國內(nèi)許多研究者的重視，龔盛昭等［3］從槐米中對蘆丁和黃酮類物質(zhì)進行了提取;叢艷波等［4］用微波輔助提取法對槐角總異黃酮工藝進行了研究，對國槐葉的研究多限于黃酮的提取及含量測定［5，6］，而未涉及到黃酮提取工藝的系統(tǒng)研究。

傳統(tǒng)的提取方法如溶劑浸提法，不僅提取不完全，耗時，而且溶劑浪費嚴重。超聲波提取法具有空化效應(yīng)、粉碎作用，對植物細胞有破壞現(xiàn)象，能使所提取物質(zhì)很好的溶于溶劑中，具有提取時間短、產(chǎn)率高、無需加熱等優(yōu)點［7］。雙水相萃取是一種溫和的新型分離技術(shù)，因其成相時間短、活性成分保持好、過程容易放大、生物親和性好等優(yōu)點已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于重金屬離子、食品化工、植物有效成分的分離［8］?；诖耍緦嶒炓試比~為材料，采用超聲波輔助乙醇-硫酸銨雙水相體系提取黃酮，通過單因素試驗和BB設(shè)計及響應(yīng)面分析對槐葉黃酮提取條件進行優(yōu)化，其目的為槐葉活性成分的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

國槐葉，2011.10.7采自河西學(xué)院，洗凈陰干，粉碎冷藏備用。

1.2 試劑

蘆丁，美國Sigma公司;無水乙醇、硫酸銨、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 主要儀器

FZ102微型植物試樣粉碎機(河北黃驊新興電器廠);KQ-250B超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);S24分光光度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司);AP-9925無油真空泵(天津奧特塞恩斯儀器有限公司);AE200電子分析天平(Mettler Toledo公司)。

2 方法

2.1 乙醇-硫酸銨雙水相體系制備

乙醇-硫酸銨雙水相體系制備參閱文獻［9］。在水溶性無水乙醇中加入硫酸銨，利用硫酸銨的鹽析作用形成雙水相體系，通過改變無水乙醇與蒸餾水的比例和硫酸銨的用量來控制雙水相體系的形成。本文選取的雙水相體系乙醇與水的初始體積之比為0.76，硫酸銨用量為0.23 g/mL，即30%(w/w)的乙醇和20%(w/w)硫酸銨組成雙水相體系。

2.2 黃酮的提取及含量測定

2.2.1 標準曲線的繪制

黃酮測定參閱文獻［10］，蘆丁標準溶液的配制，準確稱取干燥至恒重蘆丁標準品20 mg;加入10 mL70%的乙醇置于水浴鍋中微熱使之溶解，冷卻，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中定容。蘆丁標準品的濃度為0.2 mg/mL，冷藏備用。精確吸取蘆丁標準溶液0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mL，分別置于10 mL棕色容量瓶中，加入5% 亞硝酸鈉溶液0.30 mL，搖勻，靜置6 min，加入10%硝酸鋁溶液0.30 mL，搖勻，靜置6 min，加入4%氫氧化鈉溶液4.00 mL，用30%的乙醇定容，搖勻，靜置15 min，以試劑空白作參比，在波長510 nm處測定吸光度。以吸光度為橫坐標、蘆丁含量為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為:Y=1.1905X-0．0118 ，R2=0.9990，其中X代表吸光度，Y代表蘆丁含量(mg)。

2.2.2 黃酮的提取及含量測定

稱取1.00 g干燥國槐葉粉末，按一定料液比加入到不同醇水比和分相鹽濃度配制的乙醇-硫酸銨雙水相體系中，在一定溫度和一定時間下超聲提取，用分液漏斗分離，上相置于25 mL容量瓶中，并用70%的乙醇定容至刻度。根據(jù)標準曲線制作方法測定提取液的吸光度，通過回歸方程計算提取液中黃酮含量。計算公式如下:

C:提取液中黃酮含量(mg)，V:總樣品體積(mL)，W:樣品重量(g)，V:測定樣品體積(mL)N:稀釋倍數(shù)。

2.3 試驗設(shè)計

2.3.1 單因素試驗

分別以超聲提取溫度、超聲時間、料液比為影響因素，以黃酮含量為考察指標，以確定相關(guān)因素對國槐葉黃酮提取的影響。

2.3.2 BB試驗設(shè)計及響應(yīng)面分析

在單因素試驗基礎(chǔ)上，以影響國槐葉黃酮提取溫度、超聲時間、料液比3個因素為自變量，作3因素3水平的試驗，因素水平編碼見表1。

表1 Box-Behnken試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken analysis

2.4 數(shù)據(jù)處理

本研究采用Excel 2003進行數(shù)據(jù)處理，Origin7.5軟件作圖，Design Expert8.0軟件進行統(tǒng)計分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗

3.1.1 溫度對國槐葉黃酮含量的影響

準確稱取樣品1.00 g，置于乙醇-硫酸銨雙水相體系中，在料液比為 1∶30，分別在 30、40、50、60、70℃的溫度下，超聲提取20 min，測定提取液中黃酮含量，結(jié)果如圖1所示。從圖1可以看出，隨著超聲提取溫度的升高，黃酮含量增加，當(dāng)超聲溫度超過40℃時，黃酮含量逐漸降低。超聲溫度低導(dǎo)致黃酮不能完全溶出，而溫度升高，提取液黏度減小，擴散系數(shù)增加，促使提取速度加快，但是溫度過高會造成溶劑的浪費，同時黃酮化合物分解，其次雜質(zhì)大量溶出［11］，給后續(xù)的濃縮純化增加難度，因此確定40℃為國槐葉黃酮提取最佳條件。

3.1.2 時間對國槐葉黃酮提取的影響

準確稱取樣品1.00 g，置于乙醇-硫酸銨雙水相體系中，在溫度為40℃，料液比為1∶30，分別超聲提取 10、20、30、40、50、60 min，測定提取液中黃酮含量，結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，黃酮含量在10～20 min時逐漸增高，而后隨時間延長逐漸降低。其原因是超聲時間過長會提高溫度，對黃酮類化合物活性成分造成損失;另一方面提取時間較長，造成黃酮類化合物的氧化。因此綜合分析，乙醇-硫酸銨雙水相體系超聲提取國槐葉黃酮以20 min為宜。

圖1 溫度對黃酮含量的影響Fig.1 Effects of temperature on contents of flavonoids flavonoids

圖2 時間對黃酮含量的影響Fig.2 Effects of time on contents of flavonoids

圖3 料液比對黃酮含量的影響Fig.3 Effects of liquid-to-material ratio on contents of flavonoids

3.1.3 料液比對國槐葉黃酮含量的影響

準確稱取樣品1.00 g，分別按料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 置于乙醇-硫酸銨雙水相體系中，在溫度40℃，超聲提取20 min，測定提取液中黃酮含量，結(jié)果如圖3所示。從圖3可以看出，黃酮含量隨料液比的增大而緩慢增高，當(dāng)料液比為1∶40時，黃酮含量達3.65%，在1∶50時黃酮含量為3.82%，從這個數(shù)據(jù)來看，再次增大料液比，黃酮溶出不顯著。在植物細胞內(nèi)，黃酮類化合物都是以苷鍵、酯鍵等疏水鍵與蛋白質(zhì)、多糖等結(jié)合，要將黃酮浸出，首先溶劑要進入細胞內(nèi)破壞疏水鍵。所以料液比較小，溶劑滲透并擴散到細胞內(nèi)的速度以及黃酮化合物向溶劑中擴散的速度小，料液比太大，雖然有利于溶劑進入細胞內(nèi)破壞疏水鍵，利于黃酮化合物向溶劑中擴散，但溶劑用量過大會造成分相鹽用量增加，不僅耗費大量的溶劑和銨鹽，也給后續(xù)處理帶來不必要的麻煩。綜合考慮，超聲輔助雙水相提取國槐葉黃酮的料液比選1∶40較為適宜。

3.2 BB試驗設(shè)計及響應(yīng)面分析

3.2.1 Box-Behnken試驗結(jié)果與方差分析

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，按照Box-Behnken中心組合試驗方案進行3因素3水平試驗，試驗結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Box-Behnken design and results

將表2試驗數(shù)據(jù)采用Design Expert8.0軟件進行多元回歸分析，得到國槐葉黃酮含量(Y)與溫度(X1)、超聲時間(X2)和料液比(X3)之間的函數(shù)關(guān)系:

為了說明回歸方程的有效性及各因素對國槐葉黃酮含量影響的程度，對回歸方程進行方差分析，結(jié)果見表3。

從表3可以看出，料液比的一次項對黃酮含量影響極顯著(P＜0.01)，料液比二次項對黃酮含量影響較顯著(P＜0.05)，其它項影響不顯著?；貧w模型對黃酮含量影響較顯著(P＜0.05)，失擬項檢驗(P＞0.05)不顯著，說明未知因素對試驗結(jié)果干擾小，模型成立，此模型的決定系數(shù)R2為89.00% ，表明方程擬合較好，能夠較好的反映國槐葉黃酮含量與溫度、超聲提取時間和料液比之間的關(guān)系，各具體試驗因子對響應(yīng)面值的影響不是簡單的線性關(guān)系，根據(jù)表3中F值的大小可以判斷各因素對黃酮含量影響的強弱，F(xiàn)值越大，影響作用越強［11］。各個因素對黃酮含量影響大小的次序為:料液比＞超聲時間＞超聲溫度，其中料液比對黃酮提取率的影響較大。

表3 回歸方程方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

3.2.2 響應(yīng)面分析與優(yōu)化

響應(yīng)面圖能夠比較直觀的反映各因素之間的交互作用，通過多元回歸方程做響應(yīng)面及等高線圖，結(jié)果見圖4。

由圖4A可知，黃酮含量隨著溫度和時間的增高而快速提高并趨于平穩(wěn)。從等高線可以看出，等高線呈圓形，兩者交互作用不顯著，溫度在0～0.5水平即溫度在40～45℃之間，時間在0～0.5水平即20～25 min之間響應(yīng)值較高，超過25 min，黃酮含量趨于平緩。

由圖4B可知，黃酮含量隨著料液比和溫度的增大而增大，料液比曲面較陡，而溫度的變化趨勢比較平緩，說明料液比對黃酮含量影響較大。溫度在0～0.5水平即溫度在40～45℃之間，料液比在0.0～0.5水平即1∶30～1∶40之間響應(yīng)值較高 。

由圖4C可知，黃酮含量隨著料液比和時間的增高而快速提高并趨于平穩(wěn)，料液比曲面較陡，而時間的變化趨勢比較平緩。時間在0.0～0.5水平即20～25 min之間，料液比在0.0～0.5水平即1∶30～1∶40之間黃酮含量較高，表明料液比對國槐葉黃酮的含量有顯著的影響。

圖4 各因素對黃酮含量影響的響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface plots of effect of various factors on flavonoids

3.3 最佳工藝確定及驗證試驗

通過Design Expert8.0軟件對回歸方程進行分析，得到超聲輔助雙水相提取國槐葉黃酮的最佳工藝，經(jīng)模型優(yōu)化最佳條件編碼值:X1為0.148、X2為0.081、X3為0.493，即提取溫度為41.48℃、時間為20.81 min、料液比為1∶39.86。考慮到實際試驗的可操作性，將最佳工藝調(diào)整為超聲時間21 min，溫度取41℃，液料比取1∶40，預(yù)測得國槐葉黃酮含量為3.94%。

對優(yōu)化的提取工藝進行驗證試驗，結(jié)果如表4。優(yōu)化工藝測得黃酮含量為3.84%，相對標準偏差為1.19%，模型預(yù)測值為3.94%，實測值與預(yù)測值非常接近，說明該方程與實際情況擬合很好，充分驗證了所建模型的正確性，證實了該模型的有效性。同時也說明了響應(yīng)面分析法適用于超聲輔助雙水相體系提取國槐葉黃酮參數(shù)的優(yōu)化。

表4 最佳工藝條件驗證結(jié)果(n=5)Table 4 Validation results of optimal extraction conditions(n=5)

4 結(jié)論

4.1 本研究通過單因素試驗和Box-Behnken中心組合設(shè)計及響應(yīng)面分析，研究了超聲輔助雙水相體系提取國槐葉黃酮的最佳工藝。結(jié)果表明，在乙醇質(zhì)量分數(shù)為30%，硫酸銨為20%的雙水相體系中，國槐葉黃酮提取的最優(yōu)條件為:超聲溫度41℃、超聲時間21 min、料液比1∶40，實測值為3.84%，模型預(yù)測值為3.94%，實測值與預(yù)測值非常接近，證實了該模型的有效性。該方法與常規(guī)提取相比較，提取時間短、試劑用量少、黃酮提取率高，提取溫度低有利于熱敏成分的保持，在生物活性成分的提取分離領(lǐng)域展現(xiàn)了良好的應(yīng)用前景。但是對于國槐葉黃酮物質(zhì)的分離、純化鑒定以及化學(xué)性質(zhì)等問題有待進一步研究。

4.2 本研究利用超聲輔助雙水相體系對國槐葉黃酮含量進行提取與測定，測得黃酮含量達3.84%即38.40 mg/g，高于文獻［12］所報道的提取量(26.20 mg/g)。從實驗結(jié)果來看，國槐葉黃酮含量較高，從材料本身和藥用成本考慮，選取材料附加值更高，國槐資源豐富，材料易得，廢棄資源得到了有效的利用;其次填補了黃酮提取材料不足等問題，綜上考慮，綜合效益可觀，有開發(fā)利用價值。

1 Meng Q，Qian ZM，Li XX，et al.Free radical scavenging activity of Eagle tea and their flavonoids.Acta Pharm sinica B，2012，2:246-249.

2 HanYH(韓雅慧)，Gu Sq(顧賽麒)，Tao NP(陶寧萍)，et al.Study on the extraction condition and total antioxidant capacity of licoflavone from two kinds of liquorice samples.Sci Tech Food Ind(食品工業(yè)科技)，2012，33:239-243.

3 Gong SZ(龔盛昭)，He YL(何遠倫).Research of rutin extraction from flower bud scholartree.Chin Res Compre Utili(中國資源綜合利用)，2003，(1):22-24.

4 CongYB(叢艷波)，Liu N(劉寧)，Zhang YZ(張永忠).Research on Extraction of Total isoflavones from fructus seahorse by microwave-assisted treatment.Fine Chem(精細化工)，2010，27:1083-1085.

5 WangJ(王憬)，Liu JD(劉景東)，Gou LY(勾凌燕)，et al.Study on relationship between rutin content and deferent growth period of leave Sophora japonica L.Chin Med J Res Prac(現(xiàn)代中藥研究與實踐)，2010，24:65-66.

6 Gao JQ(高建全)，Zhang YC(張亞超)，Liu JD(劉景東).Determination of quercetin content in Sophora japonica L leave by HPLC.J Bethune military Med Coll(白求恩軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報)，2010，8:415-416.

7 Wang Q(王倩)，Chang LX(常麗新)，Jia CH(賈長虹)，et al.Study on the extraction technology of flavonoids from actinidia kolomikta leaves by ultrasonic-assisted extraction.Food Res dev(食品研究與開發(fā))，2012，33:43-47.

8 Tan PH(譚平華)，Lin JQ(林金清)，Xiao CM(肖春妹)，et al.Progress and applications of two water phase extractive technology.Chem Pro Tech(化工生產(chǎn)與技術(shù))，2003，10:19-25.

9 Wu XY，Liang LH，Zou Y，et al.Aqueous two-phase extraction，identification and antioxidant activity of anthocyanins from mulberry(morus atropurpurea Roxb.).Food Chem，2011，129:443-453.

10 Gao HN(高海寧)，Li CX(李彩霞)，Zhang Y(張勇)，et al.Study on antioxidant activity of pigment from“Black Beauty”potato in vitro．Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，2012，24:224-228.

11 Gu Y(顧英)，Han FL(韓鳳麗)，Wang HY(王洪洋).Optimization of extraction of sweet potato leaves flavonoids using response surface method.Sci and Tech of Food Ind(食品工業(yè)科技)，2012，33:286-290.

12 Liu JD(劉景東)，Wang J(王憬)，Liu JH(劉景惠)，et al.Study on the changes of total flavonoid contents in Sophora japonica L.leave with different growing time.Heilongjiang Med J(黑龍江醫(yī)藥)，2007，20:417-418.