用ESI-TOF-MS分型技術(shù)檢測(cè)線粒體DNA高變區(qū)堿基組成的多態(tài)性

李 莉，柳 燕，林 源，趙珍敏

（司法部司法鑒定科學(xué)技術(shù)研究所 上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200063）

線粒體DNA（mtDNA）在法醫(yī)生物學(xué)鑒定中具有獨(dú)特價(jià)值，可用于母系關(guān)系檢驗(yàn)，亦能作為輔助檢測(cè)手段用于同胞關(guān)系鑒定等，在親權(quán)鑒定中發(fā)揮重要作用。另外，由于線粒體DNA在細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)多拷貝狀態(tài)，可在核DNA檢驗(yàn)難以成功時(shí)嘗試用于陳舊骨、牙、毛干等檢材的檢驗(yàn)[1-2]，在個(gè)體識(shí)別中也發(fā)揮特殊作用。

mtDNA基因組的控制區(qū)（D環(huán)）存在兩個(gè)多態(tài)性區(qū)域：高變區(qū)Ⅰ（16024～16365nt）和高變區(qū)Ⅱ（73～340nt）。Sanger測(cè)序即雙脫氧末端終止法[3-4]是法醫(yī)DNA實(shí)驗(yàn)室通用的檢測(cè)高變區(qū)核苷酸序列的方法。但是，測(cè)序方法比較繁瑣，且遇到DNA模板序列中有多個(gè)堿基C相連時(shí)（P olyC）往往導(dǎo)致測(cè)序結(jié)果難以判讀；其次，由于當(dāng)前通用的測(cè)序手段所得的信息量不大，人群中的無(wú)關(guān)個(gè)體極有可能具有相同的檢測(cè)結(jié)果，因而在個(gè)體識(shí)別中的價(jià)值比較有限。目前，有學(xué)者報(bào)道了線粒體基因組全測(cè)序的價(jià)值[5]，該法所獲得的信息量大，但是其成本較高，尚不宜推廣使用。

本研究采用電噴霧飛行時(shí)間質(zhì)譜（ESI-TOF-MS）[6]技術(shù)檢測(cè)mtDNA，該法分型準(zhǔn)確、不受模板序列中Poly C的影響，通過堿基組成反映樣本mtDNA D環(huán)高變區(qū)的特征，結(jié)果報(bào)告方式靈活，在法醫(yī)學(xué)上具有良好的應(yīng)用前景[7-8]。本文用該技術(shù)檢測(cè)了線粒體DNA高變區(qū)堿基組成在華東漢族群體的多態(tài)性，并通過實(shí)際案例的應(yīng)用探討了該技術(shù)的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 樣本

在知情同意基礎(chǔ)上，采集華東地區(qū)12名漢族無(wú)關(guān)個(gè)體枸櫞酸鈉抗凝外周血，200μL/人。

1.2 方法

1.2.1 DNA抽提

取枸櫞酸鈉抗凝血200μL，采用微量血液DNA抽提試劑盒（QIAamp Mini Blood試劑盒，德國(guó)Qiagen公司）提取基因組DNA。

1.2.2 mtDNA檢測(cè)

通過Abbott公司提供PLEX-ID平臺(tái)的技術(shù)服務(wù)完成樣本mtDNA的檢測(cè)。該平臺(tái)使用24對(duì)引物[7]，采用8個(gè)三重PCR擴(kuò)增體系[1，7]聯(lián)合電噴霧離子化飛行質(zhì)譜技術(shù)（ESI-TOFMS）檢測(cè)mtDNA高變區(qū)Ⅰ和高變區(qū)Ⅱ各12個(gè)區(qū)段的堿基組成（即A、G、C、T四種堿基的數(shù)量），相鄰的兩個(gè)區(qū)段之間有2～22個(gè)堿基的重疊。整個(gè)技術(shù)流程包括PCR擴(kuò)增、純化和PCR產(chǎn)物在PLEX-ID平臺(tái)的分型[6]。為了驗(yàn)證結(jié)果的準(zhǔn)確性，除了設(shè)置已知分型結(jié)果（該結(jié)果已先期經(jīng)過測(cè)序驗(yàn)證）的樣本作為陽(yáng)性對(duì)照之外，還從群體抽取2個(gè)樣本同時(shí)用測(cè)序平臺(tái)和PLEX-ID平臺(tái)進(jìn)行檢測(cè)；對(duì)于PLEX-ID平臺(tái)的結(jié)果，既報(bào)告堿基組成信息，亦通過后臺(tái)數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)報(bào)告其核苷酸序列特征，將結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，考察一致性。

為了考察PLEX-ID平臺(tái)的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，選擇了一個(gè)特殊的母子關(guān)系鑒定案例，該案例中的被檢母親與被檢男孩經(jīng)D19S433等46個(gè)STR基因座的檢測(cè)，均未能排除親子關(guān)系，經(jīng)用漢族群體的等位基因分布頻率計(jì)算累積母權(quán)指數(shù)（CMI），發(fā)現(xiàn)似然比率高達(dá)3.3×1013。但是，經(jīng)調(diào)查，被檢母親與男孩是事實(shí)上的姑侄關(guān)系。本文用PLEX-ID平臺(tái)對(duì)該案例的檢材進(jìn)行了mtDNA的補(bǔ)充檢測(cè)。

3 結(jié)果

3.1 質(zhì)控結(jié)果

檢測(cè)過程所設(shè)置的陽(yáng)性結(jié)果正確。高變區(qū)Ⅱ309-315nt是堿基C集中分布、通常測(cè)序最難以分辨的區(qū)域，但PLEX-ID平臺(tái)檢測(cè)的結(jié)果表明，該區(qū)域質(zhì)譜分辨效果理想。從群體抽取的2個(gè)樣本同時(shí)用測(cè)序平臺(tái)和PLEX-ID平臺(tái)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果一致。

3.2 mtDNA高變區(qū)堿基組成的多樣性

經(jīng)對(duì)華東漢族12名無(wú)關(guān)個(gè)體進(jìn)行檢測(cè)，獲得mtDNA高變區(qū)堿基組成的多樣性信息，各類型的分布頻率見表1。

表1 高變區(qū)24個(gè)區(qū)段各種堿基組成類型的分布頻率

續(xù)表1

高變區(qū)Ⅰ（檢測(cè)范圍為15924～16428nt）的 12個(gè)片段中，8個(gè)區(qū)段的堿基組成表現(xiàn)出多態(tài)性，4個(gè)區(qū)段則未檢見多態(tài)性。

mtDNA高變區(qū)Ⅱ（檢測(cè)范圍為31～576nt）的12個(gè)片段中，10個(gè)區(qū)段的堿基組成表現(xiàn)出多態(tài)性，僅2個(gè)區(qū)段）未檢見多態(tài)性。

3.3 單核苷酸多態(tài)性（SNP）和片段長(zhǎng)度多態(tài)性

高變區(qū)Ⅰ的8個(gè)多態(tài)性區(qū)域的堿基組成信息反映出區(qū)段內(nèi)所存在的單核苷酸多態(tài)性SNP和（或）長(zhǎng)度多態(tài)性（見表2）。依據(jù)堿基組成信息推斷，擴(kuò)增的片段（15924～15985nt）存在等位基因?yàn)镚/A的SNP位點(diǎn)，16124～16201nt區(qū)域同時(shí)檢見了4個(gè)SNP位點(diǎn)（T/C、G/A、G/C、C/A）和長(zhǎng)度多態(tài)性。

與高變區(qū)Ⅰ類似，高變區(qū)Ⅱ的10個(gè)多態(tài)性區(qū)域的堿基組成信息也反映出區(qū)段內(nèi)所存在的單核苷酸多態(tài)性SNP和（或）長(zhǎng)度多態(tài)性（見表2）。依據(jù)堿基組成信息推斷，31～114nt區(qū)域存在長(zhǎng)度多態(tài)性；103～267nt區(qū)域存在序列多態(tài)性（可檢見T/C、C/A和G/A等SNP位點(diǎn)）；234～340nt同時(shí)存在序列多態(tài)性（可檢見C/A、G/A等SNP位點(diǎn)）和Poly C長(zhǎng)度多態(tài)性。

3.4 案例應(yīng)用

將ESI-TOF-MS分型技術(shù)應(yīng)用于上述特殊母子關(guān)系鑒定案件，發(fā)現(xiàn)被檢母親和男孩在線粒體DNA高變區(qū)Ⅰ的6個(gè)區(qū)段堿基組成不同（16102～16224nt，16130 ～16224nt、16154 ～16268nt、16231 ～16338nt、16256～16366nt、16318～16402nt），在線粒體DNA高變區(qū)Ⅱ亦有6個(gè)區(qū)段堿基組成不同（83～187nt、113～245nt、 204～330nt、 239～363nt、 262～390nt、464～603nt），因此排除被檢母親為男孩的生物學(xué)母親。

表2 高變區(qū)24個(gè)區(qū)段的序列多態(tài)性和長(zhǎng)度多態(tài)性

4 討論

4.1 ESI-TOF-MS檢測(cè)方法的特點(diǎn)

本文報(bào)道了分析mtDNA的新方法，該檢測(cè)技術(shù)是多重PCR和ESI-TOF-MS的結(jié)合，分型平臺(tái)是美國(guó)Abbott公司的PLEX-ID。該平臺(tái)雖然存在缺憾，例如：對(duì)于每個(gè)樣本通過8個(gè)三重PCR體系完成PCR擴(kuò)增，要求DNA溶液的體積不少于50μL，因此可能不適用于脫落細(xì)胞類（“接觸”DNA）的分析，且檢測(cè)成本昂貴，對(duì)設(shè)備要求較高，不利于推廣應(yīng)用。但是，和傳統(tǒng)的測(cè)序技術(shù)相比，這種分型技術(shù)平臺(tái)具有如下優(yōu)勢(shì)：（1）擴(kuò)增子短小。使用24對(duì)引物，所擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度為80～120bp，由于擴(kuò)增片段小，且方法的靈敏度高（每個(gè)PCR擴(kuò)增體系中DNA最低量為25pg），故適用于降解檢材的分型；（2）可讀取信息的范圍寬廣。對(duì)于高變區(qū)Ⅰ，Sanger測(cè)序技術(shù)可讀取信息的范圍一般為16024～16365nt，但ESI-TOF-MS可讀取信息的范圍為 15924～16428nt；對(duì)于高變區(qū)Ⅱ，Sanger測(cè)序技術(shù)可讀取信息的范圍一般為73～340nt，但ESI-TOF-MS可讀取信息的范圍為31～576nt，高變區(qū)Ⅰ2901號(hào)、2925號(hào)、2889號(hào)引物的擴(kuò)增子信息和高變區(qū)Ⅱ2902號(hào)、2910號(hào)、2916號(hào)、2912號(hào)、2913號(hào)引物的擴(kuò)增子信息均是Sanger測(cè)序技術(shù)所不能獲取的。（3）該平臺(tái)檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確。由于反應(yīng)體系中加有13C-dGTP，使分子量差異不大的堿基（G-A，C-T）在質(zhì)譜上均得以正確分辨。（4）不受序列中Poly C的影響。據(jù)報(bào)道[11]，當(dāng)高變區(qū)存在9個(gè)以上的堿基C時(shí)，Sanger測(cè)序反應(yīng)易受到影響，使得測(cè)序信號(hào)混亂和中斷，堿基識(shí)別亦會(huì)發(fā)生錯(cuò)誤，此時(shí)只能通過雙向序列拼接才能獲得其全序列。但是，遇到Poly C情形時(shí)，PLEX-ID平臺(tái)依舊能夠獲取關(guān)于堿基組成的可靠信息，例如高變區(qū)Ⅱ309～315nt是 Poly C所在區(qū)域，PLEX-ID平臺(tái) 2908號(hào)引物（擴(kuò)增范圍為 234～313nt）、2907號(hào)引物（擴(kuò)增范圍為263～340nt）和2923號(hào)引物（擴(kuò)增范圍為289～367nt）均能準(zhǔn)確無(wú)誤地檢出擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)的堿基組成。（5）檢測(cè)過程易于質(zhì)控。在該平臺(tái)上，樣本準(zhǔn)備、PCR產(chǎn)物純化、結(jié)果判讀等操作均實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化，可有效地避免或減少人為差錯(cuò)。

表3 血樣ESI-TOF-MS檢測(cè)結(jié)果的兩種判讀方式（示例）

4.2 ESI-TOF-MS檢測(cè)結(jié)果的判讀方式

表3示一血樣的檢測(cè)結(jié)果。mtDNA經(jīng)ESI-TOFMS檢測(cè)后，直接讀取24個(gè)區(qū)段的堿基組成信息（包含序列異質(zhì)性和長(zhǎng)度異質(zhì)性），但為了便于不同法醫(yī)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行結(jié)果比對(duì)，可以利用該平臺(tái)業(yè)已建立的數(shù)據(jù)庫(kù)，報(bào)告高變區(qū)的核苷酸序列特征，即通過與Anderson標(biāo)準(zhǔn)序列（又稱修正的劍橋參考序列rCRS，在基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中的編號(hào)為NC_012920）比對(duì)，標(biāo)出與標(biāo)準(zhǔn)序列不同的堿基為特征點(diǎn)。對(duì)于核苷酸多態(tài)性點(diǎn)，結(jié)果輸出格式為：堿基定位+空格+測(cè)定序列的堿基，如：40 A；對(duì)于缺失情形，結(jié)果輸出格式為：堿基定位 +空格 + “-”，如：40-；對(duì)于插入1個(gè)堿基的情形，結(jié)果輸出格式為：標(biāo)記點(diǎn)（插入堿基左側(cè)第一個(gè)堿基的定位）+小數(shù)點(diǎn) +1+空格+插入的堿基，如40.1 A，有2個(gè)以上插入的情形則依次報(bào)告為40.2 A、40.3 A等格式。該結(jié)果輸出方式符合國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)的要求。

4.3 mtDNA堿基組成的多態(tài)性

經(jīng)對(duì)華東漢族12名無(wú)關(guān)個(gè)體進(jìn)行檢測(cè)，在mtDNA的D環(huán)區(qū)，高變區(qū)Ⅰ的12個(gè)片段中檢見8個(gè)區(qū)段的堿基組成表現(xiàn)出多態(tài)性，高變區(qū)Ⅱ的12個(gè)片段中檢見10個(gè)區(qū)段表現(xiàn)出多態(tài)性，反映出這些區(qū)段內(nèi)存在SNP位點(diǎn)和長(zhǎng)度多態(tài)性，其中SNP位點(diǎn)有堿基顛換（C-A，C-G）、替換（G-A， T-C）等情形，這與學(xué)者們Sanger測(cè)序的結(jié)果相符。例如，在高變區(qū)Ⅰ，Sanger測(cè)序平臺(tái)已經(jīng)發(fā)現(xiàn) 16256、16261、16266、16278、16290、16291、16294、16295、16296 和 16301 等位點(diǎn)存在T/C點(diǎn)突變，PLEX平臺(tái)2892號(hào)引物的擴(kuò)增范圍為16254～16301，其堿基組成的檢測(cè)結(jié)果正好反映出該區(qū)域存在SNP位點(diǎn)T/C（見表2）；在高變區(qū)Ⅱ，Sanger測(cè)序平臺(tái)已經(jīng)發(fā)現(xiàn) 146、150、151、152、182、194、195、198、199、204 等位點(diǎn)具有 T/C 多態(tài)性，188、200、207、210等位點(diǎn)具有G/A多態(tài)性，PLEX平臺(tái)2904號(hào)引物的擴(kuò)增范圍為103～162nt，2905號(hào)引物的擴(kuò)增范圍為138～217nt，這兩個(gè)區(qū)段在堿基組成的多樣性方面正好反映出 103～217區(qū)域存在 T/C、G/A等 SNP位點(diǎn)（見表2）。但是，由于樣本量不大，可能漏檢了一些多態(tài)情形，比如：在2908號(hào)引物的擴(kuò)增區(qū)域，人群中可能還分布有A29 G6 C30 T16；在2913號(hào)引物的擴(kuò)增區(qū)域，人群中可能分布有A27 G6 C47 T5和A27 G6 C48 T5等，但本次樣本中未能檢出。

結(jié)果表明，所檢驗(yàn)個(gè)體的mtDNA D環(huán)區(qū)均沒有相同的堿基組成，且18個(gè)區(qū)段在個(gè)體之間表現(xiàn)出差異，經(jīng)統(tǒng)計(jì)各個(gè)區(qū)段堿基組成類型在群體中的分布頻率，發(fā)現(xiàn)有些情形較為多見，如178～267nt區(qū)域A32 G15 C14 T29的類型在人群中的分布頻率高達(dá)38.47%，而有些情形極為稀少，如16157～16201nt區(qū)域A16 G1 C20 T7類型的分布頻率低至5.55%，提示mtDNA堿基組成的分析方法在個(gè)體識(shí)別中可能具有重要價(jià)值和作用。

4.4 ESI-TOF-MS分型技術(shù)在實(shí)際案例中的應(yīng)用

Rebecca Howard等學(xué)者在2013年報(bào)道了ESITOF-MS分型技術(shù)成功地用于第一次世界大戰(zhàn)中250名士兵遺骨DNA檢測(cè)的結(jié)果[1]，顯示出該技術(shù)在陳舊、降解檢材mtDNA分型方面的獨(dú)到作用。本文作者則將該分型技術(shù)應(yīng)用于一起極其特殊的母子關(guān)系鑒定案件，發(fā)現(xiàn)mtDNA堿基組成的分析結(jié)果可作為常染色體STR分型的一個(gè)很好的補(bǔ)充[10]。該案例中的被檢母親與被檢男孩實(shí)為姑侄關(guān)系，經(jīng)D19S433等46個(gè)STR基因座的檢測(cè)，均未能排除非母，但經(jīng)PLEXID平臺(tái)補(bǔ)充檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)被檢母親和男孩在線粒體DNA高變區(qū)Ⅰ與高變區(qū)Ⅱ各有6個(gè)區(qū)段堿基組成不同，因此排除被檢母親為男孩的生物學(xué)母親。該檢測(cè)結(jié)果后來(lái)得到了傳統(tǒng)測(cè)序方法的驗(yàn)證，其鑒定結(jié)論與常染色體SNP和X染色體STR分型結(jié)論[9-10]一致，從而避免了出具錯(cuò)誤的鑒定意見。

總之，本研究探討了ESI-TOF-MS技術(shù)平臺(tái)檢測(cè)mtDNA堿基組成信息的可行性，分析了高變區(qū)24個(gè)區(qū)段在華東漢族群體的多態(tài)性，通過實(shí)際案例的應(yīng)用證實(shí)了該平臺(tái)在法醫(yī)生物學(xué)上的應(yīng)用價(jià)值。

致謝

感謝Abbott公司為本研究工作提供PLEX平臺(tái)和法醫(yī)學(xué)mtDNA檢測(cè)試劑盒，感謝Steve Hofstadler和Tom Hall博士在樣本檢測(cè)和數(shù)據(jù)分析中提供的幫助。

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