吸毒者頭發中海洛因、6-單乙酰嗎啡、嗎啡、可待因和乙酰可待因的分析及評價

向 平，孫英英，沈保華，沈 敏

（司法部司法鑒定科學技術研究所 上海市法醫學重點實驗室，上海200063）

1 引言

濫用藥物毛發分析已逐漸應用于法醫和臨床毒物分析領域[1-2]。與傳統的血液、尿液等生物檢材相比，毛發分析的突出優點在于其檢測時限長，根據頭發的長度可反映幾周至幾個月的用藥情況，而尿液分析的檢測時限僅為幾天。

海洛因吸毒是我國的一個嚴重社會問題[3-4]。海洛因進入體內后經肝臟迅速去乙酰化形成6-單乙酰嗎啡，然后進一步代謝成嗎啡[5]。但是，尿液中檢出的嗎啡成分也可能是由服用某些臨床藥物或者鴉片類產品引起，因此，尿液中嗎啡陽性結果的解釋與判定是毒物分析領域的一個難題[1]。

尿液中嗎啡陽性的結果解釋可通過毛發分析加以解決[1，6]，因為毛發中阿片類藥物原型及其代謝物的濃度及其比率可用于區分海洛因吸毒者和其它嗎啡類生物堿的接觸者，也可以區分主動吸食和被動污染。6-單乙酰嗎啡是海洛因的主要活性代謝物，是海洛因吸毒的體內標志物。乙酰可待因是海洛因合成過程的雜質成分，有報道建議將其作為海洛因吸毒的特殊標志物[7]。但迄今，還缺少我國吸毒人群頭發中阿片類藥物成分的分布信息。

國際毛發分析協會 （The Society of Hair Testing，SOHT）[8]建議，區分海洛因吸毒與可待因或嗎啡類使用者時，毛發中6-單乙酰嗎啡濃度的閾值（cutoff）為0.2 ng/mg，同時，吸毒者毛發中6-單乙酰嗎啡與嗎啡的濃度比率應大于1.3。但是，毛發分析中一個很重要的問題是如何使包埋于毛發基質中的目標物釋放出來。采用通常的毛發前處理過程如酸或堿水解孵化，化學性質不穩定的6-單乙酰嗎啡很容易分解成嗎啡，乙酰可待因可能分解為可待因，而且需要過夜，費時，由此可能造成不同的毛發樣品前處理過程產生不同的阿片類藥物分布規律。冷凍研磨是一種新型的樣品前處理方法，將樣品在液氮溫度下粉碎，主要應用于生命科學等領域。采用冷凍研磨處理毛發樣品可有效地減少性質不穩定的6-單乙酰嗎啡和乙酰可待因的分解。

本研究將采用冷凍研磨處理頭發樣品，考察50例海洛因吸毒者頭發中海洛因、6-單乙酰嗎啡、嗎啡、可待因和乙酰可待因的濃度，與其它非中國吸毒人群的毛發分析結果比較，并進一步考察SOHT建議的6-單乙酰嗎啡與嗎啡的濃度比率區分方法的可行性。

2 材料與方法

2.1 試劑

海洛因、6-單乙酰嗎啡、嗎啡、可待因、乙酰可待因、同位素內標6-單乙酰嗎啡-d6和嗎啡-d3對照品（濃度1.0 mg/mL）均購自美國Cerilliant公司。甲醇、乙腈、氯仿和異丙醇購自美國Fisher Scientific公司，甲酸和乙酸銨購自瑞士Fluka公司，其它試劑均為分析純。實驗用水為超純水，經Milli-Q系統制備。

2.2 頭發樣品

50份海洛因吸毒者陽性頭發來源于本實驗室2010～2012年間受理的涉毒鑒定案例。貼根采取海洛因吸毒者頭頂部3cm頭發段（黑色），標注后室溫保存。

空白頭發來自于本實驗室工作人員，沒有阿片類藥物接觸史。

2.3 樣品前處理過程

按照已建立的方法[9]，首先進行去污處理，頭發樣品置具塞試管中，依次用0.1%洗潔精2mL、去離子水和二氯甲烷各清洗兩次，最后一次清洗液留存、分析。取出頭發晾干，用剪刀剪成約1～2mm段。將剪碎的頭發段和撞子裝入冷凍研磨樣品瓶，密封后將樣品瓶浸入液氮中，撞子在磁場作用下反復沖撞將樣品粉碎。稱取冷凍研磨后的頭發粉末20mg，置于10mL具塞玻璃試管中，加入10μL混合內標6-單乙酰嗎啡-d6和嗎啡-d3溶液（0.4μg/mL）和 pH9.2硼酸緩沖溶液2mL，超聲 30min。然后加入氯仿-異丙醇（9：1）混合液 2mL 渦旋混合，離心（1437×g）3min，轉移下層有機相，于空氣流下吹干。殘余物中加入乙腈-20mM乙酸銨（80∶20， v/v）流動相溶液 100μL 復溶，轉移至進樣管中，取5μL進樣。

2.4 LC-MS/MS分析

液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）系統包括API 4000 QTRAP串聯四極桿線性離子阱質譜儀 （美國Applied Biosystems公司）和 AcquityTM Ultra Performance LC超高壓液相色譜儀（美國Waters公司），由Analyst 1.5軟件進行數據采集和分析。

色譜柱為Resteck Allure PFP丙基柱（100mm×2.1mm，5μm），流動相：A 為 20mmol/L 乙酸銨和 0.1%甲酸緩沖溶液，B為乙腈，流動相梯度洗脫程序見表1；恒流：250μL/min。

質譜檢測為電噴霧離子源正離子模式（ESI+），采用多反應監測模式（MRM）檢測。離子噴霧電壓（IS）：5500V；離子源溫度（TEM）：450℃；碰撞氣氮氣（CAD）：7psi；氣簾氣（CUR）：10psi；霧化氣（GS1）：20psi；輔助氣（GS2）：40psi。

表1 UPLC梯度洗脫程序

所建方法經驗證，頭發中海洛因、6-單乙酰嗎啡、嗎啡、可待因和乙酰可待因的最低檢出限 （LOD）在0.005～0.02 ng/mg 范圍，最低定量限（LOQ）在 0.01～0.05 ng/mg范圍。方法的提取回收率在 47.2%～110%，日內和日間精密度的變異系數小于14%。

3 結果與討論

海洛因、6-單乙酰嗎啡等一些化合物在樣品前處理過程中不穩定[10]，易分解。已有的研究表明，甲醇提取效果好，是海洛因吸毒頭發鑒定的推薦方法，但是，該方法至少需要超聲2h以上，費時，難以滿足我國公安機關拘留24h內必須做出決定的要求，所以，迫切需要研發冷凍研磨這種快速前處理技術。我們之前的研究中[9]，考察了不同樣品前處理過程中海洛因和6-單乙酰嗎啡的穩定性（見表2）。盡管在緩沖液超聲時有部分6-單乙酰嗎啡降解為嗎啡，但由于超聲時間短，應用方法1降解程度較低（29.6%），同時，采用本方法海洛因降解不超過6%[9]。

表2 不同樣品前處理方法比較

50例吸毒者的頭發樣品經所建的LC-MS/MS方法分析[9]，結果見表3，其中均檢出6-單乙酰嗎啡、嗎啡、可待因和乙酰可待因成分，僅有2個樣品中未檢出海洛因成分。頭發中海洛因、6-單乙酰嗎啡、嗎啡、可待因和乙酰可待因的濃度均值分別為1.83（范圍0.02～12.20）、5.36 （范圍 0.20～52.90）、2.42（范圍 0.11～10.30）、 6.07（范圍 0.25～55.60）和 0.58（范圍 0.05～3.99）ng/mg。

表3 吸毒者頭發中海洛因、6-單乙酰嗎啡、嗎啡、可待因和乙酰可待因的濃度 （ng/mg）

所有樣品中僅2個中海洛因的濃度最高，這主要是由于個人衛生習慣，在日常的洗發過程中，海洛因可降解為6-單乙酰嗎啡，6-單乙酰嗎啡繼續降解為嗎啡。有2個樣品中未檢出海洛因，這與Kintz等[10]采用甲醇浸泡的檢出率90%相近，但另一些報道中海洛因的檢出率較低，如 14%[11]、27%[12]、35%[13]和50%[14]。

毛發分析時排除外污染干擾是確保結果準確性的關鍵，通常可進行三個步驟。首先，毛發樣品處理前需要清洗，再者，分析時同時檢測相應的代謝物，最后在結果分析時根據cutoff值[15]。在本研究中，按照Tsanaclis[15]的建議，頭發中海洛因、6-單乙酰嗎啡和嗎啡的濃度遠超過最后一次清洗液中濃度10倍以上。海洛因的體內主要代謝物6-單乙酰嗎啡和嗎啡出現在所有頭發樣品中，并且，6-單乙酰嗎啡濃度高于SOHT 建議的 cutoff值（0.2 ng/mg）。

與其它研究[16-18]相比較，頭發中海洛因、6-單乙酰嗎啡、嗎啡、可待因和乙酰可待因的濃度無明顯差異。在20例海洛因吸毒者頭發中中海洛因、6-單乙酰嗎啡、嗎啡和可待因的濃度均值分別為0.17、0.90、0.26和 0.18 ng/mg[16]；另一報道中，82個頭發樣品中6-單乙酰嗎啡和嗎啡的濃度中值分別為3.2（范圍 0.1～154.1）和 2.1 （范圍 0.1～36.3） ng/mg[17]；Tsanaclis[18]調查英國本土上藥物濫用狀況，吸毒者頭發中海洛因、6-單乙酰嗎啡、嗎啡、可待因和乙酰可待因的最高濃度分別為 146.4、220.8、 291.3、68.4 和 40.3 ng/mg。

海洛因吸毒程度可通過頭發中6-單乙酰嗎啡的濃度加以劃分[1]，Pépin[19]建議分為低、中和高三檔，按照此建議，本研究中50例吸毒程度的分布情況見圖1，吸毒習慣以每周或每天1次為主。當然，這種劃分是相對的，因為很多因素可影響藥物進入毛發的量，例如毒品純度、吸毒次數、吸毒者的毛發顏色、藥物進入毛發的速率等，個體在藥物代謝和頭發護理、衛生習慣等都存在差異。

圖 1 本研究結果按照Pépin[19]建議的吸毒程度分布情況

表4 本研究6-單乙酰嗎啡與嗎啡的濃度比率與其它研究的比較

海洛因吸毒毛發分析時一個很重要的問題是樣品前處理時6-單乙酰嗎啡在酸、堿條件下可能分解為嗎啡，因此，不同的樣品前處理方法可能造成不同的定量結果，使分析的結果解釋變得復雜化。本研究中，頭發樣品采用冷凍研磨粉碎、緩沖液（pH 9.2）中超聲30min的方法有效地減小了6-單乙酰嗎啡的分解。50例頭發樣品中6-單乙酰嗎啡與嗎啡的濃度比率在0.15～36.27，大約28%的樣品中濃度比率低于1.3，超出了SOHT的建議值。并且，與已有的研究報道[17，20-23]相比，見表4，本研究中比率的最大值相對非常高。造成此差異的原因可能基于樣品前處理方法、個體在毒品成分、劑量、代謝、頭發顏色、吸毒習慣等方面的差異。有報道[20-23]認為該比率不能作為唯一決定性的判斷指標，對比率落在SOHT建議值之外的樣品要慎重判斷，也有認為該比率應根據分析方法進行修訂。基于本研究結果，作者認為頭發樣品中6-單乙酰嗎啡與嗎啡的濃度比率存在如此大的差異，難以作為判斷海洛因吸毒的指標。

乙酰可待因為海洛因合成過程中的雜質成分，其濃度隨合成路線不同存在很大差異。本研究中，所有樣品中均可檢出乙酰可待因，平均濃度為0.58ng/mg（范圍： 0.05～3.99ng/mg）。 但是，我們同意 Kintz 的建議[7]，與6-單乙酰嗎啡相比，由于其濃度低、差異大，乙酰可待因難以替代6-單乙酰嗎啡作為海洛因吸毒的判斷指標。

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