丹酚酸B體外誘導MSCs向心肌細胞分化中β-catenin表達的實驗研究*

季 紅，高 青，胡先同，范英昌

（天津中醫藥大學中醫學院，天津 300193）

心肌梗死后心肌細胞損失并缺少內生修復機制是導致心力衰竭的主要原因，通常認為心肌細胞是終末分化細胞，成體心肌細胞本質上不具有修復能力，因此損傷的心肌由纖維疤痕取代，繼而出現病理性心室重構最終導致心室功能喪失，而干細胞移植通過取代梗死心肌細胞成為治療心肌梗死的最具前景的方法之一。

骨髓間充質干細胞（MSCs）由于其體外易于分離、擴增，遺傳穩定性，對多種重要組織有增強修復的潛能等優點，可能成起目前細胞治療首選的干細胞模型。Friedenstei在1966年首次報道了MSCs的存在，并將其稱為骨形成前體細胞[1]。MSCs可在體外克隆擴增超過100萬倍仍保留多向分體的能力[2-4]。MSCs僅占有核細胞的0.001%~0.01%，較造血干細胞少約10倍[5-6]。研究證明MSCs在體內外均可分化為肌細胞、成骨細胞、成軟骨細胞、脂肪細胞、成纖維細抱、內皮細胞、神經細胞等多種細胞，并可在體外克隆擴增超過100萬倍仍然保留多系分化能力[7-11]。

MSCs自我更新的調控機制目前尚不清楚,現已發現多條信號通路控制著MSCs不同的分化方向和途徑,如絲裂素活化蛋白激酶（MAPK）[12-14]通路、轉化生長因子-β（TGF-β）超家族與Smad信號通路[15-16]、Wnt信號通路[17-19]等，近年來對 Wnt信號通路的研究逐漸成為熱點。

本研究在體外分離、擴增MSCs，并用丹酚酸B誘導MSCs向心肌細胞分化，通過檢測Wnt信號通路中關鍵物質糖原合成激酶（GSK）-3β和βcatenin的濃度變化以闡明Wnt信號通路在MSCs向心肌細胞的分化中所起的作用。

1 材料

1.1 動物 清潔級Wistar雄性大鼠，體質量（200±20）g。（購于中國醫學科學院放射醫學研究所實驗動物中心，動物許可證號：scxk2005-0001）。

1.2 主要試劑與儀器 丹酚酸B（Salvianolic acid B標準品，純度99%，Sigma公司）；L-DMEM培養液（Low glucose-Dulbecco’s-modified Eagle’s medium，美國GIBCO公司）；特級胎牛血清（FBS，以色列BioInd公司）；胰蛋白酶（1∶250，美國Hyclone公司）；乙二胺四乙酸（EDTA，天象人生物技術研究所）；青霉素、鏈霉素（美國 Hyclone公司）；D－Hanks緩沖液[氯化鈉（NaCl）、氯化鉀（KCl）、磷酸氫二鈉（Na2HPO4）、磷酸二氫鉀 （KH2PO4）、氫氧化鈉（NaOH）、碳酸氫鈉（NaHCO3），苯酚紅,南京化學試劑廠]；CD44兔多克隆抗體、CD34兔多克隆抗體（HCAM）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、心肌肌鈣蛋白 T（cTnT）、GSK、β-catenin引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，即用型SABC免疫組化染色試劑盒，DAB顯色試劑AR1025，均由武漢博士德生物工程有限公司提供；DNA/RNA/Protein Isolation Kit （OMEGA）。 TaqMan Reverse Transcription Reagents試劑盒（DRR014A，寶生生物公 司）、SYBR Green PCR MasterMix reagent kit（Applied Biosystems公司）。

2 方法

2.1 MSCs的分離培養、純化及鑒定 取雄性Wistar大鼠，頸椎脫臼處死，無菌條件下取雙側股骨、脛骨，適量D-Hank’s液沖洗骨髓，100目篩網過濾，以（0.1～2）×106個/L 的密度接種于完全培養液（L-DMEM含體積分數為10%胎牛血清、100 mg/L青霉素、100 mg/L鏈霉素），置于37℃、5%二氧化碳（CO2）飽和濕度的培養箱中繼續培養，24 h后首次換液，去除懸浮細胞，以后隔天更換一次培養液。造血細胞、纖維細胞和其他非貼壁細胞隨著換液被逐漸洗去，12～16 d后，細胞融合達80%～90%，用0.25%胰酶（含 0.01%EDTA）消化，1∶2～3傳代。反復傳到第3代，細胞得到純化，形成均一、同質的細胞克隆。用鏈霉親和素—生物素—過氧化物酶復合物（SABC）法檢測細胞表面抗原CD44和CD34。

2.2 MSCs分組及誘導 將第3代的MSCs隨機分為4個誘導組，空白對照組（0組）、5－氮胞苷組（5-aza組）、丹酚酸B組（SalB組）、5－氮胞苷聯合丹酚酸B組（5-aza+SalB組）。誘導方法：對照組：MSCs僅在含10%胎牛血清的DMEM培養基中培養；5-aza組：加入10 μmol/L的5-aza，37℃避光孵育 24 h后，換新鮮的完全培養基繼續培養，隔天換液；SalB組：加入16 mg/L的SalB孵育24 h后，換新鮮完全培養基繼續培養，隔天換液；5-aza+SalB組：加入10 μmol/L 的 5-aza、16 mg/L 的SalB 孵育 24 h后，換新鮮的完全培養基繼續培養，隔天換液；各組誘導4周。

2.3 免疫細胞化學鑒定心肌特異性蛋白cTnT 將誘導4周的細胞，按即用型SABC免疫組化染色試劑盒說明進行免疫組化染色，DAB顯色5～30 min，顯微鏡下觀察，每組隨機選取8張染色的細胞爬片，于400倍光鏡下每張爬片選5個不同的視野，數碼相機拍攝后，用Image Pro Plus6.0軟件檢測免疫細胞化學染色后的細胞陽性表達率（胞漿出現棕黃色顆粒的細胞占總細胞數的百分比）。

2.4 實時熒光定量逆轉錄-聚合酶鏈反應（RTPCR）檢測心肌特異性基因cTnT及Wnt/β-catenin信號通路中關鍵物質含量的表達 將各誘導組胰酶消化細胞，按照DNA/RNA/Protein Isolation Kit說明書,首先抽提總 RNA，取 2 μg總 RNA，按照逆轉錄試劑盒操作說明進行逆轉錄，反應體系20 μL，反應條件 25 ℃ 10 min；37 ℃ 120 min；85℃ 5 min；4℃，然后依照SYBR Green PCR MasterMix reagent kits說明書，以獲得的cDNA為模版，用PCR擴增儀（ABI7500）進行實時災光定量核酸擴增檢測系統（QPCR），分別擴增 GAPDH、心肌肌鈣蛋白（cTnT）、GSK-3β、β-catenin，反應體系 25μL，擴增條件：95℃預變性10min，95℃變性15秒，退火/延伸60℃1min，共40個循環。所得CT值經轉換后以2-ΔΔCT相對定量法獲得目的基因相對表達量數值。目的基因及內參基因引物序列見表1。

表1 QPCR目的基因及內參照基因引物序列Tab.1 Primer sequence of QPCR target gene and internal reference gene

2.5 統計學方法 應用SPSS18.5軟件對數據進行統計學處理，計量數據用均數±標準差（±s）表示，兩組計量資料比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間計量比較采用單因素方差分析，P＜0.05表明差異有統計學意義。

3 結果

3.1 各誘導組MSCs形態特征變化 倒置相差顯微鏡下，MSCs誘導前多呈紡錘形或長梭形，細胞形態較一致，呈“旋渦”樣生長。藥物誘導后各組細胞有大量死亡，隨著時間的推移，細胞形態逐漸開始變化，形態呈梭形，長方形、柱形的細胞數量相對增多，同時細胞增殖能力減弱，細胞數量較誘導前減少。個別胞漿中可見明顯顆粒狀物質，部分視野可見肌絲樣結構，而且細胞立體感強，折光性好。4周時細胞間發生融合，排列具有方向性，且更多視野可以觀察到明顯的肌絲樣結構，見圖1-4。

3.2 大鼠MSCs的表型特征 SABC法檢測MSCs表面抗原CD44和CD34。結果顯示CD44呈陽性表達，CD34呈陰性表達。見圖5-6。

3.3 cTnT免疫組化結果 免疫組化結果顯示，除SalB組外其余各誘導組cTnT均有一定程度的表達，各誘導組MSCs的cTnT免疫組化陽性表達率見表2。

圖1 MSCs原代培養4 d×100Fig.1 MSCs primary culture 4 d×100

圖2 MSCs原代培養12 d×100Fig.2 MSCs primary culture 12 d×100

圖3 MSCs誘導10 d 5-aza組×100倍Fig.3 MSCs induction 10 d 5-aza group×100

圖4 MSCs誘導10 d 5-aza+SalB組×100倍Fig.4 MSCs induction 10 d 5-aza+SalB group×100

圖5 MSCs CD44染色陽性×400Fig.5 MSCs CD44 staining positive×400

圖6 MSCs CD34染色呈陰性×400Fig.6 MSCs CD34 staining negative×400

表2 各誘導組MSCs的cTnT免疫組化陽性表達率（±s）Tab.2 cTnT immunohistochemistry positive expression rate of MSCs in each induction group（±s）%

表2 各誘導組MSCs的cTnT免疫組化陽性表達率（±s）Tab.2 cTnT immunohistochemistry positive expression rate of MSCs in each induction group（±s）%

注：兩組比較，P＜0.05。

組別 n 陽性表達率5-aza 8 22.42±9.975-aza+SalB 8 24.81±2.52

3.4 各誘導組cTnT及Wnt信號通路中關鍵物質GSK-3β及β-catenin基因表達的改變 見表3。

表3 各組mRNA相對表達量的比較（±s）Tab.3 Comparison of mRNA relative transcript level in each group（±s）

表3 各組mRNA相對表達量的比較（±s）Tab.3 Comparison of mRNA relative transcript level in each group（±s）

注：5-aza組與各組兩兩比較，P<0.05。

組別 cTNT GSK-3β β-catenin 5-aza組 4.52±0.62* 2.09±0.34* 0.84±0.22*SalB 組 3.71±0.44* 3.61±0.41* 0.93±0.31*5-aza+SalB 組 4.15±0.56* 2.52±0.39* 0.78±0.19*

4 討論

MSCs是一種具有多種分化能力成體干細胞，由于其取材方便、易于體外培養擴增，而且免疫原性也較低[20]，對組織損傷小。而成為基因治療、組織修復等方面的研究熱點，對MSCs的分離、純化、培養還沒有統一的方法，目前主要有4種方法即貼壁法、密度梯度離心法、流式細胞儀分離法和免疫磁珠法[21]，其中密度梯度離心法和貼壁法最為常用。研究證明，percoll分離得到的細胞較為均一，但多能分化性和增殖力不如貼壁培養的細胞，而MSC貼壁培養得到的細胞多能分化能力和增殖力好，缺點是純度不夠，但有研究表明擴增二代后的細胞純度可達到98%，因此本實驗中選取貼壁法對MSCs進行分離。根據是利用細胞貼壁時間及貼壁牢固性的不同逐步通過換液去除造血細胞，通過傳代去除單核細胞和淋巴細胞，取純度較高且增殖分化能力較強的第3代MSCs用作實驗。

關于MSCs的分離和鑒定仍然沒有十分特異性的標記，通常結合MSCS能夠自我更新、多向分化等干細胞特性以及排除造血干細胞標記的方法進行分選和鑒定，CD44是細胞黏附分子，是MSCs的重要標志物，CD34分子是普遍認同的造血干細胞的代表性標志，MSCs高表達CD44，而不表達或弱表達CD34，本實驗使用免疫細胞化學鑒定，觀察到細胞染色CD44陽性，CD34呈陰性，符合文獻報道。

cTnT作為心肌細胞內的一種特異性結構蛋白,參與組成細肌絲,并與心肌收縮和舒張的調節有關，cTnT僅在心肌細胞中表達，是鑒定心肌源性細胞的特異性標志物[22]。本實驗采用免疫細胞化學方法檢測各組cTnT陽性表達率，發現SalB組未見心肌分化，其余組均有不同程度的心肌分化，而SalB+5-aza組陽性表達率明顯高于單獨使用5-aza組，差異有統計學意義。RT-PCR在檢測發現誘導4周后的各組MSCs表面cTnT表達明顯增加，而SalB+5-aza表達略高于5-aza，但差異無統計學意義。進一步證明SalB協同5-aza可促進向心肌分化。可以認定成功將MSCs誘導為心肌樣細胞。

Wnt/β-catenin信號通路是無脊椎動物和脊椎動物發育過程中起關鍵作用的信號轉導通路之一，在整個進化過程中有高度的保守性。在Wnt信號缺失時，GSK-3β與結腸腺癌樣息肉基因產物(APC)和軸蛋白(Axin)結合形成蛋白三體復合物，磷酸化βcatenin N基末端，使其被泛素化進而通過蛋白酶體機制[23]被破壞。當Wnt蛋白連接到Frizzled家族受體激活相關下游組件Dishevelled，可使GSK-3β失活，使β-catenin不斷累積，繼而進入胞核與TCF/LEF相互作用，引起靶基因的轉錄。調控與細胞周期有關的一系列基因的表達，因此在胞內的表達水平被認為與細胞的增殖和遷移密切相關[24-25]。

研究證明Wnt信號系統在調節細胞的黏附、形態、增殖、遷移及結構修復均起著重要的作用[26-28]。一般認為Wnt信號可以通過非經典通路促進BMSCs向心肌細胞分化[29-30]，近年來的研究表明，經典Wnt信號通路在心肌形成初期被激活，并在心肌分化過程中發揮著至關重要的作用。Zelarayan L等發現Wnt/β-catenin通路在間充質細胞向心肌分化早期被激活，然而心肌細胞后期的分化卻需要下調βcatenin[31]。TeruyaNakamura等也發現Wnt/β-catenin信號通路在P19CL6細胞向心肌分化早期中被激活[32]。因此有人提出，Wnt經典信號傳導對心臟的形成和分化也不是單一的抑制作用，而是表現為雙向作用，早期為促進作用,晚期為抑制作用。筆者將誘導4周后的MSCs，用RT-PCR方法檢測了Wnt信號通路中兩個關鍵信號分子GSK-3β和β-catenin的表達，結果顯示MSCs誘導后，GSK-3β表達上調，β-catenin的表達有所下調，說明在其向心肌細胞分化后期中經典的信號通路受到抑制。本研究的結果進一步論證了這種說法。

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