冰葡萄在自然發酵過程中酵母的動態變化*

趙新節，史濤濤，張漢波，秦邵智，3，張家榮

1(山東輕工業學院 山東省微生物工程重點實驗室，山東 濟南，250353)

2(云南大學生命科學學院，云南 昆明，650091) 3(德欽梅里酒業，云南 德欽，674500)

葡萄酒發酵是一個復雜的微生物反應過程，包含了不同酵母群體和數量的演替。有研究表明，酵母菌群的差異和組成會明顯地影響葡萄酒的感官特征［1-3］。同時，文獻中提到，在自然發酵的初級階段，葡萄表面某些細尖的非釀酒酵母為優勢菌種［4-5］，隨著發酵的進行，乙醇濃度的升高，釀酒酵母主導整個發酵過程［6］。

很多學者采用不同地區以及不同品種的釀酒葡萄進行野生酵母的研究。其中包括Sipiczki 等人分析了匈牙利Tokaj 酒廠環境中自然發酵條件下分離到的酵母類型［7］，Sipiczki 等人對匈牙利Aglianico 葡萄自然發酵過程中的野生釀酒酵母進行遺傳分離的研究［8］，Antonella 等人對意大利的Aglianico，Fiano，

Trebbiano，Malvasiaand，Grechetto，Malvasiadelle Lipari，Inzolia 葡萄自然發酵過程中出現的野生酵母資源進行了相關的鑒定［9-12］，MillaAlves 等人對巴西葡萄園中與Isabel，Bordeaux 葡萄相關的野生酵母進行分離和分子鑒定［13］，Barbara Bre?ná 等人評估了捷克斯洛伐克與釀酒有關的酵母菌群的多樣性［14］，Demuyter 等人發現葡萄汁酵母連續3 年為法國阿爾薩斯酒廠的優勢菌種［15］，Van Keulen 等人研究了美國伊利湖畔的Chardonnay，Pinot Gris 和Riesling 品種在自然發酵過程中存在的酵母類型［16］，澳大利亞的學者Yap 等人報道了致死性非釀酒酵母存在的概率［17］，Combina 等人對來自阿根廷3 個不同地區的Malbec 葡萄品種在自然發酵過程中酵母菌株的消長進行了研究［18］。但是，尚未見關于冰葡萄自然發酵過程中酵母動態變化的報道。

本文采用形態學與分子生物技術相結合的方法對冰葡萄自然發酵過程中的酵母進行鑒定，探明了德欽產區與冰酒相關的野生酵母的種群多樣性，并為利用本土優良酵母資源提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

葡萄品種:赤霞珠;果實樣品:冰葡萄;采摘地點:云南省德欽縣瀾滄江河谷海拔2500 m 左右的冰葡萄基地。

1.2 樣品處理

將一定質量的冰葡萄果粒在無菌袋中破碎，加入SO2(30 mg/L)，進行自然發酵。葡萄破碎后立即取樣(A 取樣點)，48 h 后第2 次取樣(B 取樣點)。待發酵啟動，根據發酵液中殘糖量的變化量取樣(具體取樣點如表1 所示)，再進行梯度稀釋。

1.3 菌株的形態劃分

取梯度稀釋后的樣品200 μL 涂布于YEPD 固體培養基平板(加氯霉素100 mg/L)上，28℃富集培養2 ～3 d，挑取單個菌落劃線接種到WL 培養基上。根據該培養基上菌落的顏色形態分型，然后用顯微鏡觀察同種類型不同菌株間形態是否存在差異，并計算每種類型菌的數量。

表1 冰葡萄自然發酵過程中還原糖和酒精度變化情況Table 1 The change of sugar and alcohol during spontaneous fermentation associated with ice grape

1.4 菌株ITS，18S rDNA 與26SrDNA 的D1/D2 區序列測定

根據WL 培養基聚類分析結果，隨機挑選每種類型的菌株2 株，用試劑盒法(生工生物)提取酵母組DNA。使用引物ITS4 和ITS5 對其ITS 基因進行擴增［19］。對個別ITS 區域差異性較小的菌株進行18S rDNA［20］與26S rDNA 的D1/D2 區域擴增［21］。擴增結束后，以1% 的瓊脂糖凝膠進行水平電泳，電壓150V，完畢后紫外燈下拍照擴增結果，擴增產物于-20℃保存備用。

1.5 構建系統發育樹

測試結果通過DNAstar 和Chromas 軟件校對，然后使用NCBI 搜索，找出與之相似度最高的序列，相關序列用MEGA 4 軟件經CLUSTALW 比對，采用Jukes-Cantor 模型構建N-J 樹。

2 結果與分析

冰葡萄人為破碎后，在室溫下進行自然發酵(室溫大約為16℃)，在發酵過程中選取了10 個樣點，共分離到511 株酵母菌株。

2.1 冰葡萄自然發酵過程中酵母菌株的形態學鑒定

WL 瓊脂培養基可以用來監測飲料發酵過程中的微生物類群。Cavazza 等［22］研究表明，在葡萄酒自然發酵過程中出現的大多數典型的酵母菌種都可以用WL 培養基進行區分。根據在WL 培養基上酵母的菌落形態，本實驗篩選的511 株酵母菌株可分為7類(表2)。通過顯微鏡觀察可知，同種類型不同菌株間形態并不存在差異。通過查詢相關文獻可知，1，6，7 類酵母分別為Cryptococcus flavescens，Hanseniasporauvarum，Saccharomyces cerevisiae。2，3，4，5 類酵母的菌落形態未見報道。

表2 酵母菌落形態劃分結果Table 2 Division results of colony morphologies of yeasts

2.2 冰葡萄自然發酵過程中酵母菌株的分子學鑒定

根據WL 分型結果，從每一類型中選取2 株菌株進行DNA 提取，并對其ITS 區域進行PCR 擴增，具體擴增結果見圖1，然后進行分子鑒定。

從圖1 中可以看出A2 -1，A2 -2，A3 -1，A3 -2，A4 -1，A4 -2，A7 -1，A7 -2 的PCR 產物長度大約為550bp，A5 - 1，A5 - 2 的PCR 產物長度接近500bp，D1 -1，D1 -2，D 2 -1，D2 -2 的PCR 產物長度大約為750bp。

圖1 酵母菌ITS 區基因的PCR 擴增結果Fig．1 Nucleotide fragments length of the 5．8S-ITS profile in the study

通過對酵母菌株PCR 產物測序，DNAstar 和Chromas 軟件校對，NCBI 搜索，建立系統發育樹，如圖2 所示。根據系統發育樹及其同源性高低可知A2-1，A2 -2，A4 -1，A4 -2，A7 -1，A7 -2;A5 -1，A5-2;D1 -1，D1 -2;D2 -1，D2 -2 分別為Cryptococcus flavescens，Hyphopichiapseudoburtonii，Hanseniasporauvarum，Saccharomyces cerevisiae。但A3 -1 與A3 -2 在ITS 區域與Cryptococcus amylolentus和Tsuchiyaeawingfieldii的堿基序列完全相同，所以對這2 株菌進行多基因序列分析，即對A3 - 1 與A3 - 2 的18S(SSU)，26S(D1/D2)區域同時進行分析，最終得出A3 -1 與A3 -2 為Cryptococcus amylolentus。

圖2 5．8SrDNA-ITS 基因構建的系統發育樹Fig．2 Phylogenetic tree of 5．8S-ITS gene

2.3 冰葡萄自然發酵過程中酵母菌株的動態變化

對冰葡萄自然發酵過程中的不同階段進行取樣，各個菌種的消長關系如圖3 所示。

圖3 冰葡萄自然發酵過程中酵母菌株的動態變化Fig．3 Thedynamic change of the yeasts during spontaneous fermentation associated with ice grape

在A 取樣點，即冰葡萄剛破碎階段，Cryptococcus flavescens占總酵母數的50%，Cryptococcus amylolentus和Hyphopichiapseudoburtonii各占16．7% 和33．3%。48 h 后，Cryptococcus flavescens，Cryptococcus amylolentus迅速減少甚至消失，Hyphopichiapseudoburtonii成為優勢菌種，同時發現Hanseniasporauvarum。當還原糖降為336 g/L，乙醇體積分數為1．9%時，發酵液中只存在Hanseniasporauvarum與Saccharomyces cerevisiae這2 種酵母。隨著發酵的進行，乙醇含量升高，Hanseniasporauvarum所占的比例呈動態減少趨勢。當還原糖含量為172 g/L，乙醇體積分數上升為11．6%時，發酵液中只分離到Saccharomyces cerevisiae，直至發酵結束。

3 討論

對于葡萄酒酵母的研究，大量文獻探討的都是正常條件下與成熟漿果有關的酵母菌群［23］，未見關于冰葡萄相關酵母的研究。因此，本實驗首次對冰葡萄自然發酵過程中酵母的動態變化進行分析。

實驗中發現了2 種未在相關報道中出現的酵母——Cryptococcus amylolentus，Hyphopichiapseudoburtonii。其中，Cryptococcus amylolentus最初是由Walt等人從南非的甲蟲上分離到［24］，之后未見其他分離源。關于這2 種菌的生理特性有待進一步探索。研究表明，在葡萄表皮以及發酵初期存在大量的非釀酒酵母，非釀酒酵母可以產生水解酶，例如D-葡萄糖苷酶，這有利于香氣成分的產生和增強葡萄酒的綜合特性［25-26］。因此，非釀酒酵母的差異可能是冰葡萄酒有著更為復雜的香氣結構和獨特口感的原因之一。此外，在整個發酵過程中，Hanseniasporauvarum是非釀酒酵母中在發酵液里存活時間最長的菌種。這可能與Hanseniasporauvarum對酒精有較強的耐性有關。一些學者通過研究發現Hanseniasporauvarum可以通過本身的幾種酶來分泌酯和甘油，進而對葡萄酒的香氣產生積極的影響［27］。

盡管釀酒酵母在葡萄酒發酵過程中起著重要的作用，但在冰葡萄發酵初期并沒有分離到該菌種，然而從發酵中期到結束，釀酒酵母均為優勢菌種，這與之前的研究是相符合的［28］。

在成熟葡萄漿果果皮上，附著著天然的酵母菌，其種類、構成比例及菌密度受產地、土壤、氣候、年份、葡萄品種、成熟期、葡萄園的管理狀況等影響。到目前為止，從葡萄表面已經分離到52 種酵母，它們屬于22 個屬:Aureobasidium，Auriculibuller，Brettanomyces，

Bulleromyces，Candida，Cryptococcus，Debaryomyces，Hanseniaspora，Issatchenka，Kluyveromyces，Lipomyces，Metschnikowia，Pichia，Rhodosporidium，Rhodotorula，Saccharomyces，Sporidiobolus，Sporobolomyces，Torulaspora，Yarrowia，Zygoascus，和Zygosaccharomyces［29］。在本實驗中，我們從冰葡萄發酵過程中只分離到4 種非釀酒酵母:Cryptococcus flavescens，Cryptococcus amylolentus，Hyphopichiapseudoburtonii，Hanseniasporauvarum，這可能是與該產區自然條件以及產區歷史有關［30］。

了解葡萄漿果發酵過程中各酵母的動態變化對葡萄酒的釀造具有重要的意義。本文首次對赤霞珠冰葡萄相關酵母資源以及發酵過程中不同菌種的消長關系進行了研究，這對德欽產區冰酒發酵工藝的控制以及優良酵母的篩選和優化具有一定的意義，也為該地區酵母資源的開發利用奠定了基礎。

［1］ Soles R M，Ough C S，Kunkee R E．Ester concentration differences in wine fermented by various species and strains of yeasts［J］． Am J Enol Vitic，1982，33(2):94 -98．

［2］ Lema C，Garcia-Jares C，Orriols I，et al．Contributionof Saccharomyces and non-Saccharomyces populations to theproduction of some components of Albarino wine aroma［J］． Am J Enol Vitic，1996，47(2):206 -216．

［3］ Patrizia Romano．Metabolic characteristics of wine strains during spontaneous and inoculated fermentation［J］． Food Technology and Biotechnology，1997，35(4):255 -260．

［4］ Masoud W，Cesar L B，Jespersen L，et al． Yeast involved in fermentation ofCoffeaarabica in East Africa determined by genotyping and by direct denaturating gradient gel electrophoresis［J］． Yeast，2004，21(7):549 -556．

［5］ Hierro N，González A，Mas A，et al． Diversity and evolution of non-Saccharomyces yeast populations during wine fermentation:effect of grape ripeness and cold maceration［J］． FEMS Yeast Res．，2006，6(1):102 -111．

［6］ Fleet G H ．Yeast interactions and wine flavor［J］． Int J Food Microbiol，2003，86(1/2):11 -22．

［7］ Sipiczki M，Romano P，Lipani G，et al．Analysis of yeasts derived from natural fermentation in a Tokaj winery［J］．Antonie van Leeuwenhoek，2001，79(1):97 -105．

［8］ Sipiczki M，Romano P，Capece A，et al． Genetic segregation of naturalSaccharomyces cerevisiaestrainsderived from spontaneous fermentation of Aglianico wine［J］． J Appl．Microbiol，2004，96(5):1 169 -1 175．

［9］ Calabretti A，Volpe M G，Sorrentino A，et al．Aglianico and Fiano wines obtained with an autochthonousnon-Saccharomyces yeast［J］． Ann Microbiol，2011，61(1):131 -136．

［10］ Domizio P，Lencioni L，Ciani M，et al． Spontaneous and inoculated yeast populations dynamics and their effect on organoleptic characters of Vinsanto wine under different process conditions［J］． Int J Food Microbiol，2007，115(3):281 -289．

［11］ Agnolucci M，Scarano S，Santoro S，et al．Genetic and phenotypic diversity of autochthonous Saccharomyces spp．strains associated to naturalfermentation of‘Malvasiadelle Lipari’［J］． Lett Appl Microbiol，2007，45(6):657 -662．

［12］ CapeceA，Pietrafesa R，Romano P．Experimental approach for target selection of wild wine yeastsfrom spontaneous fermentation of“Inzolia”grapes［J］． World Journal ofMicrobiol Biotechnology，2011，27(12):2 775 -2 783．

［13］ MillaAlves Baffi，Carolina dos Santos Bezerra，MaríaArévalo-Villena，et al．Isolation and molecular identification of wine yeasts from aBrazilian vineyard［J］．Ann Microbiol，2011，61(1):75 -78．

［14］ Barbara Bre?ná，Katarína?eni?ová，Katarína Chovanová，et al．Evaluation of fungal and yeast diversity in Slovakianwine-related microbial communities［J］． Antonie van Leeuwenhoek，2010，98(4):519 -529．

［15］ Demuyter C，Lollier M，Legras J L，et al． Predominance ofSaccharomycesuvarumduring spontane-ous alcoholic fermentation，for three consecutive years，in an Alsatian winery［J］． J Appl Microbiol，2004，97(6):1 140 -1 148．

［16］ Keulen H van，Lindmark D G，Zeman K E，et al． Yeasts present during spontaneous fermentation of Lake Erie Chardonnay，Pinot Gris and Riesling［J］． Antonie van Leeuwenhoek ，2003，83(2):149 -154．

［17］ Yap N A，De Barros Lopes M，Langridge P，et al． The incidence of killer activity of non-Saccharomyces yeasts towards indigenous yeast species of grape must:potential application in wine fermentation［J］． J Appl Microbiol，2000，89(3):381 -389．

［18］ Combina M，Elia A，Mercado L，et al．Dynamics of indigenous yeast populations during spontaneous fermentation of wines from Mendoza，Argentina［J］． Int J Food Microbiol，2005，99(3):237 -243．

［19］ White T J，Bruns T，Lee S，et al． PCR protocols，a guide to methods and applicitions［M］． New York:Academic Press，1990:315 -322．

［20］ Spatafora J W，Blackwell M． The phylogenetic origins ofophiostomatoidfungi［J］． Mycological Research，1994，98(1):1 -9．

［21］ 謝榮． 甘肅野生酵母菌遺傳多樣性研究［D］． 蘭州:甘肅農業大學，2007:20 -21．

［22］ Cavazza A，Grando M S，Zini-Vignevini C． RilevazionedeIlaflora microbicadi mostievini［J］．Vignevini，1992，9:17 -20．

［23］ Shuangshi Li，Chao Cheng，Zheng Li，et al．Yeast species associated with wine grapes in China［J］． Int J Food Microbiol，2010，138(1/2):85 -90．

［24］ J P Van Der Walt，D B Scott，Wilhelmina C Van Der Klift．Six new candida species from south African insect soueces［J］． Mycopatholigia et Mycologia Applicata，1972，47(3):221 -236．

［25］ Ubeda J，Briones A． Characterization of differences in theformation of volatiles during fermentation within synthetic andgrape must by wild Saccharomycesstrain［J］．Lebensm．-Wiss．u．-Technol．，2000，33(6):408 -414．

［26］ ArévaloVillena M，UbedaIranzo J F，Briones Pérez A I．β-Glucosidase activity in wine yeasts:application in enology［J］． Enzyme and Microbial Technology，2007，40(3):420 -425．

［27］ Jolly N P，Augustyn O P H，PretoriusI S．The role and use of non-Saccharomyces yeasts in wine production［J］．S Afr J Enol Vitic，2006，27(1):15 -39．

［28］ Huihui Sun，Huiqin Ma，Meiling Hao，et al．Identification of yeast population dynamics of spontaneous fermentation in Beijing wine region，China［J］． Annals of Microbiology，2009，59(1):69 -76．

［29］ Renouf V，Claisse O，Lonvaud-Funel A． Inventory and monitoring of wine microbial consortia［J］． ApplMicrobiolBiotechnol，2007，75(1):149 -164．

［30］ Constanti M，Poblet M，Arola L，et al． Analysis of yeast populations during alcoholic fermentation in a newly established winery［J］． Am J Enol Vitic，1997，48(3):339 -344．