山藥多糖抗神經細胞缺氧性凋亡機制研究

向 勤，蒲 明，胡微煦，文 珠，何 丹，胡國柱*

(1.南昌大學研究生院醫學部，江西南昌 330006;2.江西省人民醫院，江西南昌 330006;3.復旦大學上海市腫瘤醫院，上海 200032;4.江西省醫學科學研究院，江西南昌 330006)

研究發現缺血/缺氧性腦損傷的病理過程引發神經細胞凋亡，尤其是慢性腦缺血。傳統醫學中補氣為主的方劑在治療腦中風，特別是對于腦神經功能的恢復等療效顯著。動物及體外實驗也證明人參皂苷、黃芪注射液、黨參皂苷、黃精多糖、甘草酸二銨等均具有抗神經細胞缺血/缺氧性凋亡作用。山藥是食藥同源的補氣中藥，山藥多糖(Chinese Polysaccharide from Yam，CYPS)具有抗氧化與衰老等作用［1］。本研究運用SD胎鼠大腦皮層神經細胞培養技術建立缺氧性神經細胞損傷體外模型，研究山藥多糖抑制神經細胞缺氧性凋亡的機制，以期為缺氧性腦病治療藥物的開發與應用提供理論與實驗依據。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物 山藥多糖(Chinese Yam Polysaccharide)，購于南京澤朗生物科技有限公司，多糖質量分數大于95%，使用培養液稀釋成不同質量濃度。

1.2 動物 清潔級孕15～18 d SD大鼠(購自江西省中醫學院動物中心，許可證號:SCXK(贛)2005-0001)。

1.3 試劑 Neurobasal Medium和B27 Supplement(GIBCOBRL公司產品);神經元特異性烯醇化酶(NSE)和兔抗小鼠多克隆抗體(Boster產品);膠質纖維酸性蛋白(GFAP);兔抗人多克隆抗體，DAB顯色試劑盒(中杉金橋產品);ABC-抗兔IgG試劑盒(Vector產品);羅丹明123染色試劑盒(南京凱基生物科技發展有限公司產品);TransS-criptTMTwo-Step RT-PCR SuperMix試劑盒(北京全式金生物技術有限公司產品);抗Bcl-2抗體及抗Bax抗體，兔抗大鼠多克隆抗體(Santa Cruz公司產品，北京中杉金橋生物技術有限公司分裝);抗Caspase-3抗體(Anbo公司產品)。

1.4 儀器 3164型CO2培養箱(美國Forma Scientific公司);厭氧培養箱(YQX—Ⅱ型，上海躍進醫療器械廠);PCR擴增儀(型號:MyCyclerTMThermal Cycler，美國BIO—RAD公司);凝膠成像分析系統(型號:Universal HoodⅡ，美國 BIO—RAD公司);DMI3000型倒置熒光顯微鏡(德國Leica公司);流式細胞儀(型號:COULTER EPICS XL，美國BECKMANCOULTER公司)。

1.5 實驗分組 正常對照組，神經細胞在37℃，5%CO2飽和濕度培養箱培養6 d;凋亡陽性組，神經細胞在37℃，5%CO2飽和濕度培養4 d后缺氧12 h，復氧24 h培養;山藥多糖0.025 g/L組、山藥多糖0.05 g/L組、山藥多糖0.1 g/L組、山藥多糖0.25 g/L組，神經細胞在37℃，5%CO2飽和濕度培養箱中培養4 d后加入以上不同質量濃度的山藥多糖預處理4 h，再進行缺氧12 h，復氧24 h培養。

1.6 方法

1.6.1 神經細胞原代無血清培養，鑒定及缺氧/復氧培養等方法詳見參考文獻 ［2］方法。

1.6.2 羅丹明123(Rhodamine 123)染色按說明書所述方法操作，流式細胞儀測定按常規方法進行，流式細胞儀測定采用FlowJo 6.5軟件分析熒光強度。

1.6.3 RT-PCR操作步驟按照說明書所述方法進行，Bax正向引物序列:5'-GATCAGCTCGGGC ACTTTAG-3'，反向引物序列:5'-TGCAGAGGATGATTGCTGAC-3';擴增長度173 bp;Bcl-2正向引物序列:5'-ATGCCGGTTCAGGTACTCAG-3'，反向引物序列:5'-CGACTTTGCAGAGATGTCCA-3';擴增長度223 bp;Caspase-3正向引物序列:5'-GCATGCCATATCATCGTCAG-3';反向引物序列:5'-GGACCTGTGGACCTGAAAAA-3';擴增長度159 bp;β-actin正向引物序列:5'-TCAGGTCATCACTATCGGCAAT-3';反向引物序列:5'-AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA-3';擴增長度432 bp;Bax與Bcl-2擴增條件:94℃ 5 min，94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，72℃ 10 min，32個循環，Caspase-3與β-actin退火溫度為55℃，其余相同，用Quantity One測量條帶的OD值，并以OD值目的基因/OD值內參值的比值作為目的基因的表達量。

1.6.4 免疫細胞化學染色按參考文獻 ［2］方法操作，Caspase-3(1 ∶1000)、Bax(1 ∶400)、Bcl-2(1∶400)，染為棕黃色或棕褐色的細胞計為陽性細胞，隨機計數200個細胞，計算陽性率。

1.7 統計分析 所有結果均采用SPSS 17.0統計軟件進行統計分析，數據以表示，采用單因素方差分析，組間比較采用LSD檢驗，P＜0.05具有統計學意義。

2 結果

2.1 神經細胞鑒定 胎鼠大腦皮層神經細胞原代培養6 d后，經神經元特異性烯醇化酶(NSE)、膠質纖維酸性蛋白(GFAP)免疫細胞化學染色證明，NSE陽性細胞達到(93.70±0.56)%(n=5)，GFAP陽性細胞達到(8.87±0.55)%(n=5)。細胞漿染色成棕黃色為陽性，未染色或淡黃色為陰性(見圖1)。

“生命之根”能不能留住？——這是不是當今時代，比屈原的《天問》更其迫切更帶根本的“諸心之問”或“指天之問”？

圖1 神經細胞NSE、GFAP免疫細胞化學染色(放大倍數10×20)Fig.1 In vitro cultured cerebral cortical neurons stained by immunocytochemistry(10×20)

2.2 山藥多糖對缺氧神經細胞線粒體的影響 神經細胞在培養4 d后加入不同質量濃度的山藥多糖預處理4 h，再缺氧12 h復氧24 h培養，經流式羅丹明123檢測發現山藥多糖在0.025～0.25 g/L組平均熒光強度較正常對照組明顯降低(P＜0.05)，但與凋亡陽性組相比均顯著升高(P＜0.05)，且質量濃度在0.1 g/L時抑制作用最強(見表1，圖2)。證明山藥多糖能夠在一定程度上減少缺氧對神經細胞線粒體損傷及所引起的細胞凋亡。

表1 山藥多糖對各組缺氧的神經細胞線粒體的影響(，n=3)Tab.1 Effect of polysaccharide from Yam against mitochondrial injury of hypoxic neurons(，n=3)

表1 山藥多糖對各組缺氧的神經細胞線粒體的影響(，n=3)Tab.1 Effect of polysaccharide from Yam against mitochondrial injury of hypoxic neurons(，n=3)

注:與正常對照組比較，▽P＜0.05;與凋亡陽性組比較，▼P＜0.05;與山藥多糖0.025 g/L組比較，*P＜0.05;與山藥多糖0.05 g/L組比較，#P＜0.05;與山藥多糖0.1 g/L組比較，◇P＜0.05

組 別 質量濃度/(g·L－1) 平均熒光強度(MFI)232.33 ±17.62凋亡陽性組 0 34.30±13.00▽山藥多糖 0.025 54.87±8.95▽▼山藥多糖 0.05 159.33±4.51▽▼＊山藥多糖 0.1 180.33±13.43▽▼＊#山藥多糖 0.25 45.90±3.53▽▼#◇正常對照組0

2.3 山藥多糖對缺氧的神經細胞Caspase-3、Bax、Bcl-2 mRNA表達的影響 神經細胞在培養4 d后加入不同質量濃度的山藥多糖預處理4 h，再缺氧12 h復氧24 h培養，經RT-PCR檢測發現與凋亡陽性組比較，山藥多糖在0.1～0.25 g/L之間顯著下調缺氧的神經細胞Caspase-3 mRNA的表達(P＜0.05)，在0.05～0.25 g/L之間顯著下調缺氧的神經細胞 Bax mRNA的表達(P＜0.05)，在0.05～0.1 g/L之間顯著上調缺氧的神經細胞Bcl-2 mRNA的表達(P＜0.05)(見表2，圖3)。證明山藥多糖預處理缺氧誘導的神經細胞通過下調Caspase-3和Bax基因的表達，上調Bcl-2基因的表達抗神經細胞凋亡，保護缺氧的神經細胞。

2.4 山藥多糖對缺氧的神經細胞Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表達的影響 神經細胞在培養4 d后加入不同質量濃度的山藥多糖預處理4 h，再缺氧12 h復氧24 h培養，經免疫細胞化學染色發現與凋亡陽性組比較，山藥多糖在0.025～0.25 g/L之間顯著地下調Caspase-3蛋白表達，且在0.1 g/L時作用最強(P＜0.05)，在0.05～0.25 g/L之間顯著下調Bax蛋白表達(P＜0.05)，在0.05～0.25 g/L之間顯著上調Bcl-2蛋白的表達，且質量濃度為0.1 g/L時作用最強(P＜0.05)(見表3，圖4～6)。證明山藥多糖預處理可通過下調Caspase-3、Bax凋亡蛋白表達，上調Bcl-2抗凋亡蛋白表達保護缺氧的神經細胞減少凋亡。

圖2 山藥多糖對缺氧的神經細胞線粒體的影響Fig.2 Effect of polysaccharide from Yam against mitochondrial injury of hypoxic neurons

2.5 山藥多糖對缺氧的神經細胞Bcl-2/Bax比值的影響 神經細胞在培養4 d后加入不同質量濃度的山藥多糖預處理4 h，再缺氧12 h復氧24 h培養，經免疫細胞化學染色發現與凋亡陽性組比較，山藥多糖在0.005～0.1 g/L之間顯著地降低缺氧的神經細胞Bcl-2/Bax mRNA比值(P＜0.05)，在0.025 g/L至0.25 g/L之間顯著地降低缺氧的神經細胞Bcl-2/Bax蛋白比值(P＜0.05)(見表2～3)，其中以0.1 g/L最為顯著。證明山藥多糖預處理可通過提高抗凋亡基因和蛋白與凋亡基因和蛋白Bcl-2/Bax比值保護缺氧的神經細胞減少凋亡。

3 討論

細胞缺血/缺氧影響線粒體膜通透性轉運孔(MPTP)的功能，引起線粒體通透性改變(MPT)，從而使線粒體膜電位(MMP)降低，導致過度產生的氧自由基、凋亡誘導因子及細胞色素C的釋放，致使細胞凋亡［3-4］。黃芪的有效成分能夠通過抑制PC12細胞活性氧的生成，提高MMP抑制氧化損傷性細胞凋亡［5］。黃芪多糖治療腹主動脈縮窄的大鼠后發現心肌MMP較模型組明顯升高［6］。本研究證明山藥多糖在0.025～0.25 g/L抑制了缺氧的神經細胞線粒體的損傷，羅丹明-123檢測發現平均熒光強度較凋亡陽性組顯著提高，可能山藥多糖修復MPTP的功能，提高線粒體的膜電位。

表2 山藥多糖對缺氧的神經細胞Caspase-3、Bax、Bcl-2 mRNA表達(OD值)的影響(，n=3)Tab.2 Effect of polysaccharide from Yam on mRNA expressions of Caspase-3，Bax，Bcl-2 in hypoxic neurons((OD value)，n=3)

表2 山藥多糖對缺氧的神經細胞Caspase-3、Bax、Bcl-2 mRNA表達(OD值)的影響(，n=3)Tab.2 Effect of polysaccharide from Yam on mRNA expressions of Caspase-3，Bax，Bcl-2 in hypoxic neurons((OD value)，n=3)

注:與正常對照組比較，▽P＜0.05;與凋亡陽性組比較，▼P＜0.05;與山藥多糖0.025 g/L組比較，*P＜0.05;與山藥多糖0.05 g/L組比較，#P＜0.05;與山藥多糖0.1 g/L組比較，◇P＜0.05

組別 質量濃度/(g·L－1) Caspase-3 Bax Bcl-2 (Bax/Bcl-2)正常對照組0.62±0.02 0.28±0.04 0.88±0.13 3.16±0.54凋亡陽性組 0 1.24±0.03▽ 0.70±0.02▽ 0.49±0.09▽ 0.69±0.11▽山藥多糖 0.025 1.17±0.10▽ 0.65±0.07▽ 0.45±0.06▽ 0.70±0.16▽山藥多糖 0.05 0.87±0.10 0.52±0.06▽▼＊ 0.67±0.01▽▼ 1.30±0.14▽▼＊山藥多糖 0.1 0.78±0.05▼ 0.38±0.06▼＊# 0.71±0.05▽▼＊ 1.89±0.40▽▼＊#山藥多糖 0.25 0.97±0.03▽▼ 0.52±0.11▽▼＊◇ 0.63±0.11▽＊ 1.27±0.390▽◇

表3 山藥多糖對缺氧的神經細胞Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達的影響(，n=3)Tab.3 Effect of polysaccharide from Yam on protein expressions of Caspase-3，Bax，Bcl-2 in hypoxic neurons(，n=3)

表3 山藥多糖對缺氧的神經細胞Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達的影響(，n=3)Tab.3 Effect of polysaccharide from Yam on protein expressions of Caspase-3，Bax，Bcl-2 in hypoxic neurons(，n=3)

注:與正常對照組比較，▽P＜0.05;與凋亡陽性組比較，▼P＜0.05;與山藥多糖0.025 g/L組比較，*P＜0.05;與山藥多糖0.05 g/L組比較，#P＜0.05;與山藥多糖0.1 g/L組比較，◇P＜0.05

組 別 質量濃度/(g·L－1) Caspase-3/% Bax/% Bcl-2/% (Bcl-2/Bax)正常對照組 0 37.03±0.38 53.32±0.77 59.36%±2.23 1.11±0.03凋亡陽性組 0 58.89±0.45▽ 65.08±1.02▽ 37.83% ±1.08▽ 0.58±0.01▽山藥多糖 0.025 55.65±0.24▽▼ 61.70±2.12 43.54% ±0.93▽ 0.71±0.02▽▼山藥多糖 0.05 53.54±0.79▽▼ 57.34±2.53▼ 46.82% ±0.63▽▼ 0.82±0.03▽▼＊山藥多糖 0.1 45.76±0.53▽▼ 53.74±1.72▼ 52.82% ±1.33▽▼ 0.98±0.06▽▼＊#山藥多糖 0.25 52.42±1.06▽▼ 58.38±1.11▽▼ 45.88% ±1.38▽▼ 0.79±0.04▽▼＊◇

圖3 山藥多糖對缺氧的神經細胞Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表達的影響Fig.3 Effect of polysaccharide from Yam on mRNA expressions of Caspase-3，Bax，Bcl-2 in hypoxic neurons

圖4 山藥多糖對缺氧的神經細胞Bax蛋白表達的影響Fig.4 Effect of polysaccharide from Yam on protein expression of Bax in hypoxic neurons

圖5 山藥多糖對缺氧的神經細胞Bcl-2蛋白表達的影響Fig.5 Effect of polysaccharide from Yam on protein expression of Bcl-2 in hypoxic neurons

圖6 山藥多糖對缺氧的神經細胞Caspase-3蛋白表達的影響Fig.6 Effect of polysaccharide from Yam on protein expression of Caspase-3 in hypoxic neurons

本課題組對不同補氣強度的中藥進行體外抗缺氧性神經細胞凋亡研究發現，人參皂苷Rb1和西洋參總皂苷在 0.05～0.1 g/L［10-11］、黃精多糖在0.5 ～1.5 g/L［12］，白扁豆多糖在0.5 ～3.5 g/L［13］、山藥多糖則在0.025～1.0 g/L提高缺氧的神經細胞Bcl-2/Bax表達比值，并成劑量依賴性。這些結果證明，不同強度的補氣中藥均能有效地抑制缺氧性神經細胞凋亡，且抗神經細胞缺氧性凋亡的強弱與中藥補氣強弱相一致;同時也初步證明同一藥性的中藥其功效相同。

綜上所述，山藥多糖通過降低凋亡基因及蛋白的產生，上調抗凋亡基因及蛋白的產生，提高Bcl-2/Bax的比值達到抗神經細胞缺氧性凋亡作用。

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