五子衍宗方對環磷酰胺致小鼠睪丸氧化損傷的保護作用

劉苗苗，張長城，賈亮亮，王洪武，曾 曉，何毓敏，袁 丁，王 婷*

(1.三峽大學醫學院，湖北宜昌 443002;2.三峽大學化學與生命科學學院，湖北宜昌 443002;3.三峽大學人民醫院藥劑科，湖北宜昌 443000)

環磷酰胺是一種臨床常用的抗腫瘤藥物，廣泛應用于各種實體腫瘤和血液系統疾病的治療，具有抑制細胞增殖和誘導腫瘤細胞凋亡的作用［1］。環磷酰胺在抑制腫瘤細胞增殖的同時，也會影響人體正常細胞的增殖與分化，從而導致多種副作用，其中生殖毒性是環磷酰胺的主要毒副作用之一［2-3］。研究顯示，腹腔注射環磷酰胺可使小鼠睪丸生精功能降低，精子凋亡數量增加，造成小鼠的弱精癥［4］;環磷酰胺可導致睪丸組織內氧化-抗氧化系統的平衡破壞，抗氧化能力降低，自由基及其氧化產物過量產生，從而造成睪丸氧化應激損傷，提示氧化損傷可能是環磷酰胺導致生精功能障礙的主要原因之一［5-6］。

五子衍宗方由枸杞子、覆盆子、菟絲子(炒)、車前子(鹽炒)、五味子(蒸)組成，有補腎益精的功效。現代藥理研究顯示，五子衍宗方具有調節體內性激素水平、改善生殖功能、增強免疫功能、抗氧自由基損傷等藥理作用［7-9］。近期有研究顯示，五子衍宗方可顯著改善雷公藤多苷所致的大鼠的生精障礙，其作用機制與其改善支持細胞功能有關［10］;本課題組前期的研究顯示，五子衍宗方可以顯著改善環磷酰胺所致的小鼠生殖功能損害［11］，但其作用機制仍有待進一步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級的Balb/C種小鼠，8～9周齡，體質量22～25 g，湖北省實驗動物中心提供，動物生產許可證號:SCXK(鄂)2008-0005。分籠飼養，環境溫度(20±2)℃，相對濕度55%～65%，12 h光照，嚙齒類動物飼料喂養，自由飲水。

1.1.2 藥品與試劑 五子衍宗方由40 g菟絲子、20 g覆盆子、40 g枸杞子、5 g五味子、10 g車前子組成，生藥經三峽大學汪均植教授鑒定為正品。按照傳統的方法煎取，將藥液濃縮至粉末，提取率為18.8%，臨用前配制成相應質量濃度的溶液。注射用環磷酰胺:購自江蘇恒瑞醫藥股份有限公司。細胞凋亡檢測試劑盒、兔抗小鼠Bax多克隆抗體、兔抗小鼠Bcl-2多克隆抗體、山羊抗兔SABC免疫組化試劑盒、DAB試劑盒:購自武漢博士德生物工程有限公司。超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione Peroxidase，GPX)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)和考馬斯亮藍試劑盒:購自南京建成生物工程研究所。Trizol、DEPC、即用PCR擴增試劑盒:購自生工生物工程(上海)有限公司。SOD1、SOD2、SOD3、GPX1、Bax、Bcl2以及 β-actin的引物由生工生物工程(上海)有限公司合成，引物如下表1。精子營養液(BWW):NaHCO30.210 g/L、NaCl 0.554 g/L、乳酸鈉0.370 g/L、CaCl20.025 g/L、KCl 0.0356 g/L、 KH2PO40.0162 g/L、 MgSO4·7H2O 0.0294 g/L、丙酮酸鈉0.003 g/L、葡萄糖0.100 g/L、青霉素10000 U、質量分數0.5%的酚紅1.0 mL、質量分數0.3%的 BSA。藥品均為市售分析純。

表1 Real time PCR引物序列及產物長度Tab.1 Primer sequences and product length of Real time PCR

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及模型制備 40只雄性SPF級的BalB/c小鼠，隨機分為4組:空白對照組、模型組、五子衍宗方低、高劑量組。空白對照組腹腔注射生理鹽水，其余各組小鼠腹腔注射環磷酰胺50 mg/(kg·d)，連續注射7 d。然后空白對照組和模型組每天灌服生理鹽水，五子衍宗方湯低、高劑量組分別給予五子衍宗方2 g/kg、4 g/kg，各組小鼠連續給藥35 d。

1.2.2 小鼠生殖器官質量的測定 末次給藥24 h后，稱小鼠體質量，斷頸法處死小鼠，取出睪丸和附睪并稱質量。

1.2.3 小鼠精子密度及精子活率的測定 將盛有1 mL精子營養液的試管置于37℃恒溫水浴箱中預熱，取出單側附睪，剪成三段放入試管中，顛倒搖勻，37℃，保溫10～15 min，使精子充分游離，接著混勻后用微量移液器取10μL含精子的營養液，用牛鮑氏血細胞計數板計算每毫升的精子數。然后取1滴精子懸液，利用SQIAS-2000彩色精液質量圖文分析儀進行精子活率的測定。

1.2.4 小鼠睪丸組織中SOD、GPX、MDA的檢測稱取100 mg睪丸組織倒入玻璃勻漿管中，加入900μL生理鹽水，在冰上勻漿5 min，制備成10%的組織勻漿，3000 r/min離心15 min，然后取組織勻漿上清。按照說明書，用比色法測定睪丸組織中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)的活性以及丙二醛(MDA)和組織中蛋白的水平。

1.2.5 小鼠睪丸組織中 SOD1、SOD2、SOD3、GPX1 mRNA表達的檢測 取一側睪丸組織放入玻璃勻漿器中，加入1 mL的Trizol在冰浴中勻漿，按照說明書方法提取RNA，依次加入5×g DNA E-raser Buffer 2μL，gDNA Eraser 1μL，總 RNA 1μL，補充 RNase Free dH2O，使總體積達 10μL，將混合液置42℃孵育2 min，置于冰上，除去基因組DNA。然后在反應管中依次加入5×PrimeScript? Buffer 2(for Real Time)4μL，PrimeScript? RT Enzyme Mix I 1μL，RT Primer Mix 1μL，RNase Free dH2O 4μL，反應體系為 20μL。將反應管置于PCR擴增儀中37℃孵育15 min，85℃孵育5 s，將合成的cDNA置于-20℃保存。

在RNase Free處理過的反應管中加入2×PCR 12.5μL，DNA 模板 0.5μL，ddH2O(滅菌蒸餾水)11μL，最終反應體系為25μL。將樣品放入PCR擴增儀中根據相應的條件擴增。取PCR產物10μL，加1× Loading Buffer 2μL，經2%的瓊脂糖凝膠(含 EB 0.5μg/mL)電泳，電壓為100 V，時間30 min，用紫外透射分析儀觀察并拍照。

1.2.6 小鼠睪丸生精細胞凋亡的檢測 取睪丸組織，4%多聚甲醛固定、酒精梯度脫水，包埋后切片，TUNEL檢測睪丸中各級生精細胞凋亡率。細胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細胞，即凋亡細胞。每張切片隨機選擇10個視野，計算各個視野細胞凋亡指數。

1.2.7 小鼠睪丸組織中Bax、Bcl-2 mRNA表達的檢測 在RNase Free處理過的反應管中加入2×PCR 12.5μL，DNA 模板 0.5μL，ddH2O(滅菌蒸餾水)11μL，最終反應體系為25μL。將樣品放入PCR擴增儀中按95℃預變性5 min、95℃變性30 s、退火30 s、72℃延伸30 s條件擴增30次。

1.2.8 小鼠睪丸組織中生精細胞Bax、Bcl-2蛋白表達的檢測 采用鏈霉素-生物素-過氧化物酶(SABC)法進行免疫組化檢測，其操作步驟按SABC試劑盒的說明進行。在光學顯微鏡下觀察，生精細胞間質出現棕黃色均質顆粒為陽性結果。顯微圖像采集系統對每張免疫組化切片隨機選取5個高倍視野(×400)，利用Image Pro Plus 5.0專業圖像分析軟件計算陽性細胞染色的平均積分光密度(Average integrate optical density，AIOD)值，其Bax、Bcl-2的蛋白水平與平均積分光密度值成正比，即蛋白水平越高其平均積分光密度值越大。

1.2.9 統計學處理 數據經SPSS 13.0軟件處理，實驗各個指標均用均數±標準差表示()，以單因素方差分析(one-way ANOVA)進行多組間差異的比較，以Dunnett-t檢驗比較兩組間均數的差異。

2 結果

2.1 五子衍宗方對小鼠生殖器官質量的影響 模型組小鼠的睪丸和附睪質量及睪丸指數顯著低于空白對照組，五子衍宗方低劑量和高劑量組均能顯著增加小鼠的睪丸及附睪質量，對睪丸指數和附睪指數無顯著性影響。模型組小鼠的精子密度和精子活率均顯著低于空白對照組。五子衍宗方低劑量和高劑量組均可顯著增加小鼠的精子活率及精子密度及。結果見表2。

表2 五子衍宗方對模型小鼠生殖器官指數及精子參數的影響(，n=8)Tab.2 Effects of Wuzi Yanzong Decoction on genital index and sperm parameters in model mice(，n=8)

表2 五子衍宗方對模型小鼠生殖器官指數及精子參數的影響(，n=8)Tab.2 Effects of Wuzi Yanzong Decoction on genital index and sperm parameters in model mice(，n=8)

注:與空白組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01;與模型組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01(下同)

組 別 睪丸質量/g睪丸指數/(mg·g-1)附睪質量/g附睪指數/(mg·g-1)精子密度/(106·mL-1)精子活率/%空白組 0.101±0.003 4.12±0.13 0.033±0.002 1.30±0.1392±12 68±8模型組 0.074±0.011# 3.13±0.44# 0.028±0.001# 1.17±0.20 27±6## 36±10##五子衍宗方低劑量組 0.085±0.009 3.18±0.57 0.029±0.001 1.04±0.08 62±13＊＊ 50±6*五子衍宗方高劑量組 0.093±0.013* 3.38±0.37 0.031±0.003* 1.07±0.06 65±21＊＊ 52±12*

2.2 五子衍宗方對模型小鼠睪丸內SOD、GPX活性及MDA水平的影響 與空白對照組比較，模型組小鼠睪丸內SOD、GPX活性顯著降低，MDA水平顯著升高。五子衍宗方高劑量均可顯著提高生精障礙小鼠睪丸內SOD、GPX活性以及降低MDA水平。結果見表3。

表3 五子衍宗方對小鼠睪丸內SOD、GPX活性及MDA水平的影響(，n=8)Tab.3 Effects of Wuzi Yanzong Decoction on SOD and GPX activities and MDA content in mice testis(，n=8)

表3 五子衍宗方對小鼠睪丸內SOD、GPX活性及MDA水平的影響(，n=8)Tab.3 Effects of Wuzi Yanzong Decoction on SOD and GPX activities and MDA content in mice testis(，n=8)

組 別SOD/(U·mg protein-1)GPX/(nmol·mg protein-1)MDA/(nmol·mg protein-1)77±14 63±18 0.37±0.08模型組 61±7## 38±8## 0.59±0.18##五子衍宗方低劑量組 60±3 49±5 0.49±0.13五子衍宗方高劑量組 76±6＊＊ 86±12＊＊ 0.32±0.06空白組＊＊

2.3 五子衍宗方對模型小鼠睪丸組織內SOD1、SOD2、SOD3、GPX1 mRNA表達的影響 環磷酰胺對小鼠睪丸組織內SOD1的表達無顯著性影響。環磷酰胺可以顯著降低小鼠睪丸組織內 SOD2、SOD3、GPX1 mRNA的表達，五子衍宗方可顯著上調SOD3和GPX1 mRNA的表達，對SOD2 mRNA的表達無顯著影響。結果見表4。

2.4 五子衍宗方對模型小鼠睪丸組織內生精細胞凋亡的影響 TUNEL法如圖1所示，空白對照組小鼠生精小管內各級生精細胞排列緊密，少見凋亡的生精細胞;模型組小鼠生精小管管腔內精子稀少，管壁細胞脫落，多見細胞核被染成棕黃色的凋亡的生精細胞。五子衍宗方各劑量組均能使小鼠生精小管各級生精細胞層次明顯增多，凋亡細胞明顯減少。結果見表5。

表4 五子衍宗方對模型小鼠睪丸組織內SOD1、SOD2、SOD3、GPX1 mRNA水平的影響(，n=3)Tab.4 Effects of Wuzi Yanzong Decoction on SOD1，SOD2，SOD3 and GPX1 mRNA levels in model mice(，n=3)

表4 五子衍宗方對模型小鼠睪丸組織內SOD1、SOD2、SOD3、GPX1 mRNA水平的影響(，n=3)Tab.4 Effects of Wuzi Yanzong Decoction on SOD1，SOD2，SOD3 and GPX1 mRNA levels in model mice(，n=3)

組 別 SOD1/(U·mg protein-1)SOD2/(U·mg protein-1)SOD3/(U·mg protein-1)GPX1/(nmol·mg protein-1)0.98±0.21 1.83±0.57 2.28±0.32 2.18±0.28模型組 1.00±0.10 1.02±0.24# 1.00±0.23# 1.04±0.33##五子衍宗方低劑量組 1.16±0.26 1.00±0.20 1.80±0.66 1.79±0.08*五子衍宗方高劑量組 0.72±0.09 1.13±0.38 3.44±0.84＊＊ 1.79±0.38空白組*

圖1 五子衍宗方對模型小鼠睪丸組織內生精細胞凋亡的影響Fig.1 Effect of Wuzi Yanzong Decoction on spermatogenic cells apoptosis in model mice testis

表5 五子衍宗方對模型小鼠睪丸組織生精細胞凋亡的影響(，n=5)Tab.5 Effects of Wuzi Yanzong Decoction on spermatogenic cells apoptosis in model mice testicular(，n=5)

表5 五子衍宗方對模型小鼠睪丸組織生精細胞凋亡的影響(，n=5)Tab.5 Effects of Wuzi Yanzong Decoction on spermatogenic cells apoptosis in model mice testicular(，n=5)

組 別 生精細胞凋亡指數(AI)0.11±0.02模型組 0.37±0.04##五子衍宗方低劑量組 0.20±0.04*五子衍宗方高劑量組 0.17±0.02空白組＊＊

2.5 五子衍宗方對模型小鼠睪丸組織內Bcl-2及Bax mRNA表達的影響 環磷酰胺所致小鼠睪丸組織中Bcl-2 mRNA表達顯著下調，而Bax mRNA的表達顯著上調。五子衍宗方可以上調Bcl-2mRNA的表達，降低Bax mRNA的表達。結果見圖2。

圖2 五子衍宗方對模型小鼠睪丸組織中Bcl-2及Bax mRNA水平的影響Fig.2 Effects of Wuzi Yanzong Decoction on Bcl-2 and Bax mRNA levels in model mice testis

2.6 五子衍宗方對模型小鼠睪丸組織中生精細胞Bax、Bcl-2蛋白表達的影響 Bcl-2免疫組化的結果發現，空白對照組Bcl-2表達明顯，生精細胞胞漿內呈彌漫性棕黃色染色。模型組生精細胞胞漿內Bcl-2表達微弱，僅見少量淺黃色染色。五子衍宗方各劑量組生精細胞Bcl-2的表達明顯增多，與模型組比較有顯著性差異。

Bax免疫組化結果顯示，模型組生精細胞胞漿呈彌漫性的棕黃色染色，與空白對照組比較，具有顯著性差異。五子衍宗方組中生精細胞胞漿內Bax的表達較模型組減少，部分胞漿內可見彌漫性的淺黃色染色。

統計結果見表6，模型組Bcl-2/Bax比值較空白對照組顯著下降(P＜0.05)，五子衍宗方可顯著上升Bcl-2/Bax的比值，并具有統計學意義(P＜0.01)。結果見圖3、圖4。

表6 五子衍宗方對模型小鼠睪丸組織生精細胞Bcl-2和Bax蛋白水平的影響(，n=5)Tab.6 Effects of Wuzi Yanzong Decoction on Bcl-2 and Bax protein levels in model mice testis(，n=5)

表6 五子衍宗方對模型小鼠睪丸組織生精細胞Bcl-2和Bax蛋白水平的影響(，n=5)Tab.6 Effects of Wuzi Yanzong Decoction on Bcl-2 and Bax protein levels in model mice testis(，n=5)

組 別 Bcl-2 AIOD值 Bax AIOD值 (Bcl-2/Bax)2083.38±662.41 172.34±59.39 13.87±4.62模型組 783.00±87.29## 2378.16±738.50## 0.35±0.09#五子衍宗方低劑量組 1272.34±145.21 1106.92±213.41 1.16±0.22*五子衍宗方高劑量組 1964.48±471.32＊＊ 643.27±78.34＊＊ 3.05±1.70正常組＊＊

圖3 五子衍宗方對模型小鼠睪丸組織中生精細胞Bcl-2蛋白表達的影響Fig.3 Effects of Wuzi Yanzong Decoction on Bcl-2 and Bax protein levels in model mice testis

圖4 五子衍宗方對模型小鼠睪丸組織中生精細胞Bax蛋白水平的影響Fig.4 Effects of Wuzi Yanzong Decoction on Bax protein levels in spermatogenic cells in model mice testis

3 討論

環磷酰胺是一種廣譜的抗腫瘤藥物，其機制主要是通過其代謝產物磷酰胺氮芥和丙烯醛對DNA、RNA和蛋白質的烷化作用從而干擾細胞內的多種生物學功能，從而導致大量的毒副作用，生殖毒性是目前越來越引起人們關注的環磷酰胺的主要副作用之一［12］。有研究表明，氧化損傷是環磷酰胺導致生殖功能障礙的主要原因之一。精子細胞膜中含有大量的不飽和脂肪酸，并對脂質過氧化以及活性氧自由基誘導的損傷高度敏感。睪丸組織在環磷酰胺的作用下時，產生大量的活性氧和自由基，破壞該組織的氧化還原平衡，從而影響生殖功能［13］。

SOD和GPX是體內抗氧化酶系統中兩個重要的酶。SOD主要存在于胞漿和線粒體中，在細胞外液中也有少量存在。SOD歧化超氧陰離子為H2O2，H2O2在過氧化氫酶作用下轉化為H2O和氧分子，從而減弱超氧陰離子的氧化損傷。GPX廣泛存在于機體內各個組織，它的生理功能主要是催化谷胱甘肽(GSH)參與過氧化反應，清除在細胞呼吸代謝過程中產生的過氧化物和羥自由基，從而減輕細胞膜多不飽和脂肪酸的過氧化作用［14-15］。MDA是自由基攻擊生物膜中多不飽和脂肪酸而引發的脂質過氧化作用的最終分解產物之一，其水平可間接反映機體內細胞脂質過氧化的程度。

本實驗結果顯示，當給予小鼠環磷酰胺后，其睪丸和附睪質量、精子密度及精子活率顯著低于空白對照組，且睪丸組織中SOD、GPX活性顯著降低，MDA水平顯著升高，SOD2、SOD3、GPX1 mRNA的表達顯著下調。五子衍宗方能增加模型小鼠的睪丸和附睪質量，提高精子密度和活率，且可顯著降低睪丸組織中MDA水平，提高SOD和GPX活性，上調SOD3、GPX1 mRNA的表達，以上實驗結果表明五子衍宗方可以減輕環磷酰胺對睪丸組織造成的氧化損傷，從而保護生精細胞的功能。

Bcl-2家族是以Bcl-2為代表的一組凋亡調節蛋白，在凋亡的調節中起著關鍵作用。這類蛋白有調節凋亡的兩種對立功能，當抗凋亡蛋白如Bcl-2、Bcl-xl與促凋亡蛋白如Bax、Bid的比值升高時發揮抗凋亡的作用，反之，發揮促凋亡作用。所以，這類蛋白的比值高低是決定細胞存活與凋亡的重要因素［16］。本實驗研究顯示五子衍宗方可以顯著上調睪丸組織Bcl-2基因及蛋白的表達，下調Bax基因及蛋白的表達，增加Bcl-2/Bax比值;表明五子衍宗方可以通過調節Bcl-2、Bax表達來拮抗環磷酰胺對睪丸組織生精細胞誘導的凋亡。

綜上所述，五子衍宗方可以顯著拮抗環磷酰胺所誘導的睪丸氧化損傷與生精細胞凋亡，其機制可能與上調睪丸組織中SOD3、GPX1 mRNA的表達，提高睪丸組織中SOD和GPX的活性以及降低MDA水平，調節氧化-抗氧化系統的平衡有關;其作用機制還可能與上調睪丸組織中Bcl-2基因表達，下調睪丸組織中Bax基因表達，增加Bcl-2/Bax比值，從而拮抗環磷酰胺所誘導的生精細胞凋亡有關。

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