UPLC-ELSD法測定芪白平肺膠囊中黃芪甲苷

孟 楣，魏良兵，王 芳，李茜茜，李澤庚*

(1.安徽中醫學院第一附屬醫院，國家中醫藥管理局中藥制劑三級實驗室，安徽合肥 230031;2.安徽中醫學院，安徽合肥 230031;3.亳州市華佗中醫院，安徽亳州 236800)

芪白平肺膠囊是安徽中醫學院第一附屬醫院的 醫院制劑(專利號ZL 201010573274.1)，該制劑由黃芪、生曬參、川芎等七味中藥組成，具有益氣溫陽、化痰散瘀之功效，適用于慢性阻塞性肺疾病急性發作期和緩解期［1-2］。方中君藥是黃芪，苷類成分是其主要活性組分，也是芪白平肺膠囊發揮藥效的物質基礎，其中黃芪甲苷具有改善心肺功能、加強心臟收縮力、調動機體免疫功能等作用［3］，故黃芪甲苷的提取率與該制劑的主要療效有關。

半 仿 生 提 取 法［4-7］(Semi-bionicExtraction method，SBE法)是從現代生物藥劑學的角度、模擬口服藥物經胃腸道轉運吸收的環境、采用活性指導下導向分離的一種方法。本實驗采用此提取模式，與傳統的水提法(WE法)進行比較，同時以黃芪甲苷的量為評價指標，以此選擇該藥更好的提取方式，為以后芪白平肺膠囊的新藥研究奠定一定的基礎。有關黃芪甲苷的定量測定方法主要有高效液相色譜-蒸發光散射法［8-9］、HPLC-UV 法［10］、HPLC示差折光檢測器法［11］，本實驗采用的是超高效液相色譜-蒸發光散射法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters Acquity H-Class UPLC超高效液相色譜儀(美國Waters公司)，包括:四元梯度泵、恒溫自動進樣器、柱溫箱、Acquity ELSD檢測器以及Waters Empower2軟件;Acquity UPLC BEH C18色 譜 柱(2.1mm×50mm，1.7μm);KQ3200DB型數控超聲波清洗器(江蘇昆山超聲儀器有限公司);Sartorius PH酸度計(德國塞多利斯公司);Sartorius BP211D十萬分之一天平(德國塞多利斯公司);HH-S型水浴鍋(鞏義市英峪予華儀器廠);BCD-277西門子電冰箱;SK3200H超聲儀。

1.2 試藥 黃芪甲苷(中國食品藥品檢定研究院，批號1100781-200613);黃芪、川芎、地龍、五味子、葶藶子、薤白(安徽中醫學院第一附屬醫院中藥房提供，由安徽中醫學院第一附屬醫院李立華主任藥師鑒定);甲醇、乙腈(色譜純，美國Tedia公司);水為純化水;其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 應用半仿生提取法與水提法提取芪白平肺膠囊

2.1.1 應用半仿生提取法提取芪白平肺膠囊［12］按芪白平肺膠囊的制劑提取工藝，將該組方3份，水煎煮提取3次，依次加10、10、8倍量的水煎煮1.5、1.0、1.0 h，pH 值依次為 pH 2.00，pH 7.50，pH 9.00，合并煎液，過濾，濾液濃縮至250 mL，得樣品SBE液，標記為半仿生液1、2、3號。

2.1.2 應用水提法提取芪白平肺膠囊 按芪白平肺膠囊的制劑提取工藝，將該組方3份水煎煮提取3次，依次加10、10、8倍量的水煎煮1.5、1.0、1.0 h，合并煎液，濾過，濾液濃縮至250 mL，得樣品水提液，標記為水提液1、2、3號。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液制備 精密稱取黃芪甲苷對照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.540 mg對照品溶液，作為黃芪甲苷對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備

2.2.2.1 半仿生提取法液供試品溶液制備 精密吸取半仿生提取法液1、2、3號各10 mL，置圓底燒瓶中，蒸干，加甲醇50 mL，精密稱定，回流提取1 h，放冷，用甲醇補足減失的質量，濾過，取續濾液25 mL，蒸干，殘渣加水30 mL，微熱溶解，飽和正丁醇40 mL萃取4次，合并正丁醇液，氨試液充分洗滌4次，每次40 mL，棄去氨試液，正丁醇液蒸干，殘渣加水15 mL使溶解，放冷，過D101型大孔吸附型樹脂柱(內徑1.5 cm，長12 cm)，依次以水50 mL、40%乙醇30 mL洗脫，棄去洗脫液，繼用70%乙醇80 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，用甲醇溶解并定容至5 mL量瓶中，即得半仿生供試品溶液，標記為半仿生供試品溶液1、2、3號。

2.2.2.2 水提液供試品溶液制備 精密吸取水提液1、2、3號各10 mL，置圓底燒瓶瓶中，蒸干，加甲醇50 mL，其余操作同2.2.2.1項處理方法，得水提液供試品溶液，標記為水提供試品溶液1、2、3號。

2.3 色譜條件［13-15］Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×500 mm，1.7μm);流動相乙腈-水(33∶67);體積流量0.3 mL/min;柱溫30℃;噴霧器溫度30℃;漂移管溫度為80℃。

2.4 系統適應性試驗 分別吸取對照品溶液3μL，半仿生提取法供試品溶液、水提供試品溶液各5μL，按2.3項下色譜條件，用UPLC-ELSD測定，結果半仿生提取法供試品溶液和水提液供試品溶液中黃芪甲苷的保留時間與對照品溶液的保留時間一致，與其他物質峰分離度大于1.5，理論塔板數均在4000上，黃芪甲苷色譜峰的蒸發光光譜與對照品的蒸發光光譜一致。結果見圖1。

圖1 黃芪甲苷對照品(A)、半仿生液供試品(B)、水提液供試品(C)的 UPLCELSD色譜圖Fig.1 UPLC-ELSD chromatograms of astragaloside reference substances(A)，sample of SBE(B)，sample of WE(C)

2.5 方法學驗證

2.5.1 線性關系的考察 取黃芪甲苷對照品溶液(0.540 mg/mL)，進樣量依次為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5μL 記為 B1、B2、B3、B4、B5、B6的系列進樣量的對照品溶液。按2.3項下色譜條件進行測定，以進樣量(X)為橫坐標，峰面積積分值(Y)為縱坐標，繪制標準曲線，線性回歸方程為 Y=7953168.571X-8446347.676，r=0.9999(n=6)，結果表明:黃芪甲苷進樣量在1.08～2.43μg的范圍內有良好的線性關系。

2.5.2 精密度試驗 精密吸取黃芪甲苷對照品溶液(0.540 mg/mL)3μL。按2.3項下色譜條件，重復進樣6次，測定峰面積，黃芪甲苷對照品峰面積積分值的RSD值為0.13%(n=6)。結果表明儀器的精密度良好。

2.5.3 穩定性試驗 精密吸取半仿生供試品溶液1號，按2.3項下色譜條件，分別于0、2、4、8、12、24 h進樣5μL，測定并記錄黃芪甲苷的峰面積積分值，計算RSD為1.61%(n=6)。結果表明黃芪甲苷在24 h內穩定。

2.5.4 重復性試驗 精密吸取半仿生樣品溶液1號，每份10 mL共6份，編號為1～6，按2.2.2.1項下方法制成供試品溶液，分別按2.3項下色譜條件，分別進樣5μL測定，計算黃芪甲苷峰面積積分值 RSD為1.12%(n=6)，結果表明重復性良好。

2.5.5 加樣回收率試驗 精密吸取半仿生樣品溶液1號，每份10 mL共6份，精密加入黃芪甲苷溶液(1.4250 mg/mL)2 mL，按2.2.2.1項下方法制成供試品溶液，按2.3項下色譜條件，計算回收率。結果:平均回收率為99.05%，RSD為0.58%(n=6)，表明回收率良好。結果見表1。

表1 黃芪甲苷加樣回收率試驗結果Tab.1 Results of recovery tests for astragaloside

表2 半仿生提取法液中黃芪甲苷測定結果Tab.2 Determination results of astragaloside in the samples of SBE

表3 水提液中黃芪甲苷測定結果Tab.3 Determination results of astragaloside in the samples of WE

2.6 實驗結果 同批藥材，同種測定方法，半仿生提取法液中黃芪甲苷的平均質量濃度為0.2848 mg/mL，水提液中黃芪甲苷的平均質量濃度為0.2360 mg/mL，可以得出用半仿生提取法提取芪白平肺膠囊其黃芪甲苷的提取效率高于水提法提取。

3 討論

3.1 參照2010年版《中國藥典》一部黃芪藥材中黃芪甲苷含量測定的色譜條件［16］，對流動相乙腈-水的比例進行了篩選，考察了出峰時間和色譜分離情況，結果以乙腈-水(33∶67)為流動相時，黃芪甲苷色譜峰出峰時間合適，分離效果最佳。

3.2 將單純的水提法替代為半仿生提取法，更加接近人體的消化環境，且符合中醫的實際應用;查閱半仿生提取法的研究資料、結合制劑的生產實際、并根據前期實驗結果，確定了該制劑的半仿生提取法提取條件。

3.3 黃芪甲苷為芪白平肺膠囊中主要成分之一，據報道黃芪甲苷提取物中部分以衍生物黃芪總皂苷的形式存在，堿性條件可以使衍生物水解黃芪甲苷，本實驗對正丁醇萃取液經氨試液洗滌的洗滌時間進行考察(0.5、1、1.5 h)，結果表明氨試液洗滌時間的延長，黃芪甲苷的含量增加，且圖譜中雜質少，干擾小，為質量控制提供依據。

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