龍膽瀉肝顆粒質量標準研究

劉 穎，胡 琴，陶志國

(北京市藥品檢驗所，北京 100035)

龍膽瀉肝顆粒現正式批準生產的有兩種劑型，其中顆粒(A)收載于《衛生部藥品標準》中藥成方制劑第十一冊，標準號為WS3-B-2108-96，規格為每袋裝6 g，原標準收載了梔子苷的薄層色譜鑒別;顆粒(B)收載于《衛生部藥品標準》新藥轉正標準第33冊，標準號為WS3-197(Z-187)-2001(Z)，規格為每袋裝4 g，原標準收載了甘草、梔子、澤瀉、地黃的顯微鑒別以及黃芩苷、龍膽苦苷的薄層色譜鑒別和高效液相色譜法測定黃芩中黃芩苷的含量。經折算，兩種規格日服用生藥量一致，顆粒(A)與顆粒(B)主要的區別在于:顆粒(A)制法主要采用提取揮發油及水煮，顆粒(B)制法為藥材全原粉包衣。考慮到兩種龍膽瀉肝顆粒的制法差異甚大，且處方量、性狀、規格、用法與用量等項均不同，標準較難統一，故此次研究工作分別開展，以下品名均以“龍膽瀉肝顆粒(A)”與“龍膽瀉肝顆粒(B)”區別(或簡稱“顆粒(A)”、“顆粒(B)”)。為控制藥品的內在質量及系列標準的統一，對處方中龍膽、柴胡、黃芩、梔子、澤瀉、當歸、地黃、甘草進行了薄層色譜鑒別，并采用高效液相色譜法測定了制劑中龍膽苦苷、梔子苷、黃芩苷的量。所建立的方法具有操作簡便、分離效果好、重現性好，專屬性強，準確等優點，可以有效地控制本品的質量。

1 儀器與試藥

島津LC-20A高效液相色譜儀，配備二極管陣列檢測器(PDA)型;硅膠G預制板及高效硅膠GF254預制板(煙臺市化學工業研究所，青島海洋化工廠分廠)。

對照品黃芩苷(批號110715-200212)、龍膽苦苷(批號 110703-200322)、梔子苷(批號110749-200714)、甘草苷(批號111610-200604)、阿魏酸(批號0773-9910)與對照藥材柴胡(批號120992-200705)、澤瀉(批號121081-200302)，地黃(批號121180-200402)均購于中國食品藥品檢定研究院。

龍膽瀉肝顆粒(A)樣品 3批:100201，100202，100203。龍膽瀉肝顆粒(B)樣品3批:101006，101007，101008。

甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

對第三層級的研究對象進行建模后，參考埃森曼的探討習慣和伊塔羅·格伯利尼的建筑“構成符號”分類[1]41，將對象的建筑符號分為平面符號、連接符號、圍護符號、相互交流符號和屋頂符號等5個部分進行圖解分析。且因為 “能指”與“所指”的任意性，為了更貼近集中含義3），在對應語義三角關系前已經對研究對象的設計語境（其內容包括設計師言論、地方文化、地理氣候等）進行了資料收集。

2.1.2 混播禾草種類對混播植物POD活性的影響 A2處理禾草POD活性最高，其次是A3處理。其中，A2處理禾草POD活性分別比A1，A3和A4處理高250.04%，20.22%和350.42%倍，差異均達極顯著水平(P<0.01)；A3處理禾草POD活性分別比A1和A4處理高191.18%和274.68%(P<0.01)。A1和A4處理之間差異不顯著(表1)。A1處理下苜蓿POD活性比A4處理高19.47%(P<0.01)；A3處理POD活性比A4處理高16.40%(P<0.05)；其余處理之間無顯著差異。

2 薄層色譜鑒別［1］

3.1 色譜條件 Phenomenex Luna C18色譜柱(5μm，4.6 mm×250 mm);流動相A為甲醇，以0.1%磷酸溶液為流動相B，進行梯度洗脫(0～25 min，22%A;25～30 min，22% ～43%A;30～55 min，43%A)。柱溫為30℃，龍膽苦苷檢測波長為270 nm，梔子苷檢測波長為238 nm，黃芩苷檢測波長為280 nm。理論板數按龍膽苦苷、梔子苷和黃芩苷峰計算均應不低于3000。

圖1 龍膽瀉肝顆粒(A)及顆粒(B)中龍膽苦苷、梔子苷、甘草苷的TLC圖譜Fig.1 TLC chromatograms of gentiopicrin，geniposide and liquiritin

本研究結果表明，研究組治療總有效率顯著高于對照組（P＜0.05），治療后兩組患者的IL-6、PCT水平及APACHEⅡ評分較治療前均顯著降低，且研究組低于對照組，兩組比較差異具有統計學意義（P＜0.05），兩組患者均未發生不良反應。

2.2 澤瀉的薄層色譜鑒別 取顆粒(A)15 g，顆粒(B)4 g，研細，加石油醚(60～90℃)50 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液揮干，殘渣加石油醚(60～90℃)1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取不含澤瀉的顆粒(A)陰性制劑15 g，同法制成顆粒(A)澤瀉陰性溶液。取龍膽瀉肝顆粒(B)陰性制劑4 g，同法制成顆粒(B)澤瀉陰性溶液。另取澤瀉對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。吸取上述供試品、對照藥材及陰性溶液各10μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環己烷-乙酸乙酯-甲酸(15∶2∶0.5)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。缺澤瀉陰性樣品無相應斑點。見圖2。

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圖2 龍膽瀉肝顆粒(A)及顆粒(B)中澤瀉的TLC圖譜Fig.2 TLC chromatograms of Alismatis Rhizoma

巨型鮞粒樣品的核心普遍為方解石構成的內碎屑或陸源碎屑(有些鮞粒核心已溶蝕，形成孔洞)。呈近橢圓狀，粒徑約1mm。多已重結晶，部分被白云石交代。鮞粒的核心可能是原地沉積的內碎屑，也可能是搬運而來。從核心的成因可以推斷，在成鮞之前是一個流水或波浪的動水環境。

圖3 龍膽瀉肝顆粒(A)及顆粒(B)中地黃的TLC圖譜Fig.3 TLC chromatograms of Rehmanniae Radix

3 HPLC法測定龍膽中龍膽苦苷、梔子中梔子苷、黃芩中黃芩苷［2-10］

2.1 龍膽、梔子、甘草的薄層色譜鑒別 取顆粒(A)8 g，顆粒(B)4 g，研細，加甲醇50 mL，超聲處理10 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。分別取不含龍膽、梔子、甘草的陰性制劑顆粒(A)8 g，顆粒(B)4 g，分別同法制成龍膽、梔子及甘草的陰性溶液。另取龍膽苦苷對照品、梔子苷對照品、甘草苷對照品，分別加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。吸取上述供試品溶液、對照品溶液及陰性溶液各2μL，分別點于同一高效硅膠GF254薄層板上，以乙酸乙酯-丙酮-水(6∶6∶1)為展開劑，展開兩次，取出，晾干，置紫外光燈(254 nm)下檢視。供試品色譜中，在與龍膽苦苷對照品、梔子苷對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點;缺龍膽、梔子的陰性樣品無相應斑點。再噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與甘草苷對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。缺甘草陰性樣品無相應斑點。見圖1。

3.2 對照品溶液的制備 取龍膽苦苷、梔子苷和黃芩苷對照品適量，精密稱定，分別加甲醇制成每1 mL含龍膽苦苷10μg、梔子苷20μg、黃芩苷65μg的溶液，即得 ［顆粒(A)測定用］。分別加甲醇制成每1 mL含龍膽苦苷20μg、梔子苷25μg、黃芩苷80μg的溶液，即得 ［顆粒(B)測定用］。

3.3 供試品溶液的制備 取顆粒(A)混勻，取約2 g，顆粒(B)混勻，取約1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，稱定質量，加熱回流40 min，放冷，再稱定質量，用50%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.3 地黃的薄層鑒別 取龍膽瀉肝顆粒(A)15 g，顆粒(B)4 g，研細，加乙酸乙酯50 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙酸乙酯1 mL使溶解，作為供試品溶液。取不含地黃的顆粒(A)陰性制劑15 g，顆粒(B)陰性制劑4 g，同法制成地黃陰性溶液。另取地黃對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。吸取以上供試品、對照藥材及陰性溶液各10μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以二甲苯-乙酸乙酯(3∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。缺地黃陰性樣品無相應斑點。見圖3。

3.4 陰性樣品溶液的制備 分別按處方比例及制劑制備工藝制備不含龍膽、梔子、黃芩的陰性樣品，再按3.3項下方法制備，即得。

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圖4 龍膽苦苷測定HPLC圖譜Fig.4 HPLC chromatograms of gentiopicrin

圖5 梔子苷測定HPLC圖譜Fig.5 HPLC chromatograms of geniposide

圖6 黃芩苷測定HPLC圖譜Fig.6 HPLC chromatograms of baicalin

3.6 線性關系考察 分別精密吸取龍膽苦苷對照品溶液(0.03306 mg/mL)1、2、3、4、6、8、10、12、15μL;梔子苷對照品溶液(0.0761 mg/mL)1、2、3、4、6、7、8、10、12、15μL;黃芩苷對照品溶液(0.1072 mg/mL)2、4、6、8、10、12、14μL，注入高效液相色譜儀，以進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標，其回歸方程:龍膽苦苷為y=1321542.6x+788.1(r=1.0000)，表明其在0.03306μg～0.4959μg范圍內線性關系良好;梔子苷為y=1563674.5x－1620.3(r=1.0000)，表明其在 0.0761μg ～1.1415μg 范圍內線性關系良好;黃芩苷為y=3595816.7x+14494.7(r=1.0000)，表明其在0.2144～1.608μg范圍內線性關系良好。

3.7 穩定性試驗 取同一份供試品溶液 ［顆粒(A)批號100201，顆粒(B)批號:101006］，按樣品測定方法，顆粒(A)在制備后0、2、4、6、10、14 h進樣測定，顆粒(B)在配置后0、2、4、8、12、14、16 h進樣測定。顆粒(A)結果峰面積RSD龍膽苦苷為0.22%，梔子苷為0.23%，黃芩苷為0.19%，表明供試品溶液在14 h內基本穩定。顆粒(B)結果峰面積RSD龍膽苦苷為0.37%，梔子苷為0.32%，黃芩苷為0.36%，表明供試品溶液在16 h內基本穩定。

3.11 樣品測定 按上述測定方法，分別測定3批龍膽瀉肝顆粒(A)及顆粒(B)樣品，結果見表1。

3.5 專屬性試驗 取對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液各10μL，分別注入液相色譜儀，依法測定，結果龍膽、梔子、黃芩陰性樣品分別在龍膽苦苷、梔子苷、黃芩苷相應保留時間處未見色譜峰，表明陰性樣品對檢測無干擾。見圖4、5、6。

3.9 龍膽瀉肝顆粒(A)加樣回收率試驗 采用加樣回收法，設計3個質量濃度，每個質量濃度各制備3份供試品溶液。精密稱取已知含有量的同一批樣品(批號100201，龍膽苦苷為0.2811 mg/g，梔子苷為0.7776 mg/g，黃芩苷為2.0580 mg/g)，①(低濃度)取約0.5g精密加入對照品混合溶液(含龍膽苦苷0.002239 mg/mL，梔子苷0.005830 mg/mL，黃芩苷 0.017125 mg/mL)50 mL;②(中濃度)取約1 g精密加入對照品混合溶液(含龍膽苦苷 0.004478 mg/mL，梔子苷 0.01166 mg/mL，黃芩苷0.03425 mg/mL)50 mL;③(高濃度)取約2 g精密加入對照品混合溶液(含龍膽苦苷0.008956 mg/mL，梔子苷0.02332 mg/mL，黃芩苷0.06850 mg/mL)50 mL。按供試品溶液同法制備，測定。結果龍膽苦苷平均回收率98.95%，RSD=1.6%;梔子苷平均回收率98.24%，RSD=1.8%;黃芩苷平均回收率102.15%，RSD=2.7%。

3.10 龍膽瀉肝顆粒(B)加樣回收率試驗 采用加樣回收法，設計3個質量濃度，每個質量濃度各制備3份供試品溶液。精密稱取已知含有量的同一批樣品(批號101006，龍膽苦苷為1.1117 mg/g，梔子苷為2.2352 mg/g，黃芩苷為4.1833 mg/g)，①(低濃度)取約0.25 g精密加入對照品混合溶液(含龍膽苦苷0.005105 mg/mL，梔子苷0.004150 mg/mL，黃芩苷0.01936 mg/mL)50 mL;②(中濃度)取約0.5 g精密加入對照品混合溶液(含龍膽苦苷0.01021 mg/mL，梔子苷0.00830 mg/mL，黃芩苷0.03872 mg/mL)50 mL;③(高濃度)取約1 g精密加入對照品混合溶液(含龍膽苦苷0.02042 mg/mL，梔子苷0.01660 mg/mL，黃芩苷0.07744 mg/mL)50 mL。按供試品溶液同法制備，測定。結果龍膽苦苷平均回收率97.58%，RSD=0.36%;梔子苷平均回收率102.73%，RSD=1.5%;黃芩苷平均回收率99.74%，RSD=1.5%。

3.8 重復性試驗 分別取顆粒(A)約2 g及顆粒(B)約1 g，研細，精密稱定，依法測定。顆粒(A)龍膽苦苷RSD為0.68%，梔子苷為0.65%，黃芩苷為1.4%，方法重復性良好。顆粒(B)龍膽苦苷RSD為0.82%，梔子苷為0.49%，黃芩苷為0.63%，方法重復性良好。

表1 龍膽苦苷、梔子苷、黃芩苷測定結果Tab.1 Determination results of gentiopicrin，geniposide and baicalin

4 討論

4.1 龍膽瀉肝顆粒(A)及龍膽瀉肝顆粒(B)，處方中均由十種藥味構成，本研究共進行了其中五種藥味的薄層色譜鑒別研究，木通及車前子未能購買到中國生物制品檢定所提供的對照藥材，故未進行研究。

4.2 龍膽苦苷、梔子苷、甘草苷的薄層鑒別中，由于3種成分較難分離，經過大量研究實驗，最終確定用高效薄層板，以同一展開劑，展開2次的方法進行分離，得到了較理想的結果。

4.3 除前文介紹的3種薄層色譜外，還對柴胡、黃芩及阿魏酸的薄層色譜進行了研究，其中在進行顆粒(B)柴胡對薄層色譜研究中發現，其柱色譜分離時間較長，振搖提取乳化嚴重，分析原因可能由于顆粒(B)有包衣，該輔料對柱色譜及振搖提取均有影響，為除去該輔料，經大量實驗研究，最終確定在提取前對其顆粒不進行研細處理，而是進行加熱水60 mL，攪拌1 min，紗布濾過處理，使其包衣輔料除去后，再進行提取，得到了較理想的結果。

4.4 此次研究的6個薄層色譜，耐用性考察結果表明，采用不同品牌薄層板，在不同溫度和濕度條件下，均能獲得較好的薄層色譜分離。

4.5 本研究采用了同一樣品，分別在其最大吸收波長下，同時測定3種成分的量，前處理簡單，實驗操作簡便，可較大的節省實驗中的人力及物力消耗。

4.6 分別采用不同品牌色譜柱 ［(1)Phenomenex luna C18(5μm，250 mm×4.6 mm)、(2)Tech-Mate C18(5μm，250 mm×4.6 mm)、(3)Kromasil 100-5C18(5μm，250 mm×4.6 mm)］ 進行測定，結果龍膽苦苷、梔子苷、黃芩苷峰分別在各種色譜柱均分離良好，空白無干擾，不同色譜柱間測定，龍膽瀉肝顆粒(A)中龍膽苦苷的RSD為1.2%，梔子苷的RSD為1.5%，黃芩苷的RSD為0.85%;龍膽瀉肝顆粒(B)中龍膽苦苷的RSD為1.7%，梔子苷的RSD為1.2%，黃芩苷的RSD為1.2%，表明本HPLC方法有較好的耐用性。

［1］鄭小平，申麗莎.龍膽瀉肝片的薄層鑒別方法［J］.中國藥業，2008，17(16):39-40

［2］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］.北京:中國醫藥科技出版社，2010:7.

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