一測多評法測定金銀花復方制劑中新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸

朱粉霞，張亞麗，汪 晶，賈曉斌*

(1.江蘇省中醫藥研究院國家中醫藥管理局中藥口服制劑釋藥系統重點研究室，江蘇南京 210028;2.中國藥科大學中藥學院，江蘇南京 210009)

中藥復方制劑所含成分的復雜性使得單一成分或指標性成分難以整體表達復方制劑的質量，由此提出多指標的質量控制模式。在多指標的質量控制模式中，需要用足夠的化學對照品，而現實中對照品的供需矛盾和多指標質控高昂的檢測成本反過來又限制了多指標質量控制模式在實際生產、科研、監督中的應用。“一測多評”法(QAMS)是一種用于多指標質量控制的研究思路，目前已用于解決中藥質量控制中缺乏對照品這一瓶頸問題，黃連的一測多評標準被2010年版《中國藥典》采納［1］，其他化合物的一測多評研究也被報道［2-5］。超高效液相色譜(UPLC)具有超高壓、超高靈敏度、超高分離度等特點，在中藥等復雜體系的分離分析上具有明顯優勢，目前正被越來越廣泛地應用于中藥復雜體系的研究［6-12］。

金銀花復方制劑脈絡寧注射液、雙黃連口服液和銀黃顆粒中新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸的含有量較高，為其藥理活性成分。綠原酸供應量大，價格便宜，且新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸分別為5-咖啡酰、3-咖啡酰和4-咖啡酰奎尼酸類物質，其結構類似，紫外響應接近，然而新綠原酸和隱綠原酸價格昂貴且供應不足，因此考慮用一測多評法進行測定。本實驗以綠原酸為內標物，采用UPLC和HPLC兩種色譜系統，建立脈絡寧注射液、雙黃連口服液和銀黃顆粒三種金銀花復方制劑中綠原酸與新綠原酸和隱綠原酸的相對校正因子，用校正因子計算新綠原酸和隱綠原酸的量，同時對一測多評的計算值與外標法實測值進行比較，評價一測多評法在金銀花復方制劑脈絡寧注射液、雙黃連口服液和銀黃顆粒中多指標質量控制中應用的準確性和可行性。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters Acquity超高效液相色譜系統，Empower工作站(美國Waters公司);Agilent 1100高效液相色譜系統，Agilent chemstation工作站(美國Agilent公司)。Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7μm);Agilent Poroshell 120 EC-C18(3.0 mm×100 mm，2.7μm);Waters SunFire C18(4.6 mm× 250 mm，5μm)，Agilent SB C18(4.6 mm× 250 mm，5μm)。MT5百萬分之一分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)。Milli-Q超純水機(美國Millipore公司)。

1.2 材料 脈絡寧注射液(金陵藥業股份有限公司，批號20111209、20111213)，雙黃連口服液(哈藥集團三精制藥股份有限公司，批號10082627、11031624)，銀黃顆粒(江西濟民可信藥業有限公司，批號111008、110503)。

1.3 試劑 綠原酸(批號110753-200413)購自中國藥品生物制品檢定所，新綠原酸和隱綠原酸購自成都普瑞科技開發有限公司，純度按HPLC面積歸一化法測定均≥98%。甲醇(色譜純，德國Merck公司)，乙酸和磷酸(色譜純，美國Tedia公司)。其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 方法學考察

2.1.1 色譜條件

2.1.1.1 HPLC色譜條件 Waters SunFire C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5μm)和Agilent SB C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5μm);流動相為甲醇(A)-0.1%磷酸水(B)，梯度洗脫(0～10 min，10% ～20%A;10～20 min，20% ～40%A;20～25 min，40% ～50%A);柱溫30℃;體積流量1 mL/min;檢測波長 327 nm;進樣量 10μL。見圖1。

2.1.1.2 UPLC色譜條件1 Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7μm)，流動相為甲醇(A) －0.1%乙酸水(B)，梯度洗脫(0～2 min，8% ～16%A;2～8 min，16%A);柱溫28℃;體積流量0.3 mL/min;檢測波長327 nm;進樣量2μL。見圖2。

圖1 對照品和樣品的HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances and samples

2.1.1.3 UPLC色譜條件2 Agilent Poroshell 120 EC-C18色譜柱(3.0 mm×100 mm，2.7μm)，流動相為甲醇(A) －0.1%乙酸水(B)，梯度洗脫(0～2 min，8% ～16%A;2～10 min，16% ～25%A);柱溫28℃;體積流量0.3 mL/min，檢測波長327 nm，進樣量2μL。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸對照品適量，分別置25 mL棕色量瓶中，適量甲醇溶解后，以50%甲醇定容至刻度，其質量濃度分別為 1018、1216和 808μg/mL。

2.1.3 供試品溶液的制備

2.1.3.1 脈絡寧注射液供試品溶液 精密移取0.5 mL脈絡寧注射液，置25 mL棕色量瓶中，以超純水定容至刻度，過0.22μm微孔濾膜，置棕色進樣小瓶中，待用。

圖2 對照品和樣品的UPLC圖Fig.2 UPLC chromatograms of reference substances and samples

2.1.3.2 雙黃連口服液供試品溶液 精密移取0.5 mL雙黃連口服液，置25 mL棕色量瓶中，加入50%甲醇定容，稱定，超聲處理30 min，放至室溫，以50%甲醇補定失質量，過0.22μm微孔濾膜，置棕色進樣小瓶中，待用。

2.1.3.3 銀黃顆粒供試品溶液 稱取銀黃顆粒約0.1 g，置10 mL棕色量瓶中，加入50%甲醇定容，稱定，超聲處理30 min，放至室溫，以50%甲醇補定失質量，過0.22μm微孔濾膜，置棕色進樣小瓶中，待用。

2.1.4 線性關系、定量限(LOQ)及檢測限(LOD) 分別精密移取上述各對照品溶液2.0 mL，置10 mL棕色量瓶中，以50%甲醇定容，制得混合對照品溶液。取混合對照品溶液，以50%甲醇稀釋，稀釋倍數分別為2倍、10倍、20倍、40倍，得到系列對照品溶液，過0.22μm微孔濾膜后，置棕色進樣小瓶中，依上述色譜條件進樣，HPLC色譜柱為Waters SunFire C18(4.6 mm×250 mm，5μm)，UPLC 色譜 柱為 Waters BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7μm)，測定峰面積值，以峰面積值(Y)對質量濃度(X)進行線性回歸，得到新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸的回歸方程、相關系數和線性范圍;將混合對照品以50%甲醇不斷稀釋后分析，分別得到3個成分的LOD(S/N≈3～4)和LOQ(S/N≈10～12)，HPLC的結果見表1，UPLC的結果見表2。

表1 新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸的HPLC線性回歸方程及LOD、LOQ的測定結果Tab.1 Linear regression equation，LOD，and LOQ of 3 phenolic acids by HPLC

表2 新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸的UPLC線性回歸方程及LOD、LOQ的測定結果Tab.2 Linear regression equation，LOD，and LOQ of 3 phenolic acids by UPLC

2.1.5 精密度試驗 取中濃度混合對照品溶液，在上述色譜條件下連續進樣6次，測定新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸的峰面積值，計算峰面積的RSD，新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸在HPLC儀器上峰面積RSD分別為0.86%、1.52%、1.23%，在UPLC儀器上峰面積RSD分別為1.13%、1.35%、1.22%，表明兩種儀器精密度良好。

2.1.6 穩定性試驗 取脈絡寧供試品溶液(批號20111209)，0.22μm微孔濾膜過濾后，置棕色進樣小瓶中，分別于0、2、4、8、12、24 h進HPLC分析，測定各成分的峰面積值，計算，新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸的RSD分別為0.78%、1.15%、0.94%，表明樣品溶液在24 h內穩定。

2.1.7 重復性試驗 分別取脈絡寧注射液(批號20111209)、雙黃連口服液(批號10082627)和銀黃顆粒(批號111008)6份，按2.1.3項下制備供試品溶液，以UPLC和HPLC測定各成分的峰面積值，計算，結果見表3。

表3 重復性數據Tab.3 Reproducibility of the three components

2.1.8 加樣回收率試驗 分別制備脈絡寧注射液(批號20111209)、雙黃連口服液(批號10082627)和銀黃顆粒(批號111008)各6份，分別精密加入相當于樣品含有量的新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸對照品溶液，按2.1.3項下制備供試品溶液，以UPLC測定各成分峰面積值，計算結果見表4。

2.2 校正因子的重現性考察 取系列混和對照品溶液，混合對照品溶液為1號，稀釋倍數為2倍、10倍、20倍、40倍的分別為2號、3號、4號和5號，本實驗在UPLC上考察Waters Acquity UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7μm)和Agilent Poroshell 120 EC-C18(3.0 mm×100 mm，2.7μm)兩種色譜柱，在HPLC上考察Waters SunFire C18(4.6 mm×250 mm，5μm)和 Agilent SB C18(4.6 mm×250 mm，5μm)兩種色譜柱。所得的相對校正因子及其相對標準差見表5，由表可知，不同的儀器及不同型號色譜柱所得的相對校正因子差異并不顯著。

表4 回收率數據Tab.4 Recovery tests of the three components

表5 測得相對校正因子Tab.5 RCFs of phenolic acid

2.3 一測多評法與常規外標法比較 分別取脈絡寧注射液，雙黃連口服液和銀黃顆粒，按2.1.3項下制備供試品溶液，以UPLC和HPLC及以上4種不同品牌和型號的色譜柱測定，并用外標法及一測多評法分別計算新綠原酸及隱綠原酸量，將兩種方法的計算結果進行比較，以驗證QAMS法用于復方金銀花制劑中新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸質量評價的準確性，見表6。結果表明，常規的外標法實測含量值與一測多評計算的含量值經t檢驗比較，P＞0.05，表明兩種方法測得量沒有顯著性差異，證明所建立的一測多評法具有較好的可信度。

3 討論

3.1 關于流動相的考察，在UPLC中，流動相水相中加入0.1%的乙酸即可改善峰型，3種成分達基線分離;在HPLC中，流動相水相中加入0.1%的乙酸時，三種成分未達到基線分離，加入0.1%的磷酸，分離效果明顯改善，峰型較好，所以，在UPLC和HPLC中，流動相水相中分別加入0.1%的乙酸和0.1%的磷酸。

表6 外標法和一測多評法測得復方金銀花制劑中新綠原酸、隱綠原酸含量Tab.6 Contents of components by external standard method and QAMS

3.2 金銀花藥材中，綠原酸的含有量較高，《中國藥典》規定綠原酸為其指標性成分，而新綠原酸和隱綠原酸含有量較低［13-14］。而在金銀花的復方制劑脈絡寧注射液、雙黃連口服液和銀黃顆粒中新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸量均較高，以此三種制劑為例，探討一測多評法在金銀花復方制劑質量控制中的可行性和技術適應性，證明了一測多評可用于多種金銀花復方制劑中，同時也避免了由于某一成分含有量較低而引起系統誤差，在建立的相對校正因子評價中，考察了Agilent1100 HPLC，Waters UPLC 2臺液相色譜系統和4根不同品牌、型號的色譜柱，對綠原酸與新綠原酸和隱綠原酸之間相對校正因子的重現性進行考察，結果表明相對校正因子具有良好的重現性，一測多評法測定結果與傳統外標法測定結果無顯著性差異，說明一測多評可以同時測定復方金銀花制劑脈絡寧注射液、雙黃連口服液和銀黃顆粒中新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸的量。

3.3 《中國藥典》2010年版二部附錄XIXF藥品雜質分析指導原則中規定，已知雜質對主成分的相對校正因子在0.9～1.1范圍內，可以用主成分的自身對照法計算含有量，即用主成分作為對照品計算雜質的量。在本實驗中綠原酸對新綠原酸和隱綠原酸的平均校正因子分別為1.057和1.014，符合藥典要求，且黃連中小檗堿與巴馬汀、黃連堿、表小檗堿、藥根堿的相對校正因子在0.9～1.1之間［15］，藥典中規定可以用小檗堿作為對照品計算其他4種生物堿的量［1］。酚酸是自然界中的一類重要化學成分，其中新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸在很多中藥中同時存在，可以用綠原酸作為對照品計算新綠原酸和隱綠原酸的量，以節約成本。

3.4 在脈絡寧注射液和雙黃連口服液中，咖啡酸的含有量也較高，且其結構與新綠原酸和隱綠原酸結構相似。本實驗前期研究中，以咖啡酸為內參物時，其對新綠原酸和隱綠原酸的相對校正因子4個柱子差別較大，推測可能是咖啡酸穩定性較差，導致計算新綠原酸和隱綠原酸量與實測結果誤差大于5%。因此，本實驗僅選擇綠原酸為內參物，放棄以咖啡酸作為內參物。

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