雙黃連注射液中半抗原成分酶聯免疫檢測方法的建立

尹 婕，尹利輝，胡昌勤，金少鴻

(中國食品藥品檢定研究院，北京 100050)

雙黃連注射液是由金銀花、黃芩、連翹經提取精制而成的復方制劑，具有清熱解毒、疏風解表的功效。自1990年上市以來，廣泛用于治療病毒和細菌引起的感染［1］。1992年被國家中醫藥管理局指定為全國中醫醫院急診首批必備中成藥［2］。但隨著臨床的廣泛應用，其不良反應報道也日益增多，其中75%系過敏反應［3］。特別是近幾年來頻繁出現的嚴重不良反應/事件，使雙黃連注射液作為高風險中藥注射劑品種備受關注。

現有研究指出雙黃連注射液中致敏成分的存在是其引起過敏反應的主要原因之一［4-5］。但目前對于致敏物質的成分、性質仍不明確。文獻報道雙黃連注射液的過敏反應與其組分黃芩苷有直接關系［6］。有研究表明黃芩苷可作為一種小分子半抗原，刺激小鼠產生特異性抗體［7］。前期的實驗也證實黃芩苷能夠特異性地與黃芩提取物免疫獲得的抗血清結合，即黃芩苷具有反應原性。但對于黃芩苷致敏作用的機制仍缺乏有力的實驗依據。另一方面，黃芩苷具有顯著的抗菌抗病毒作用，是黃芩的主要有效成分，在多種含黃芩藥材的制劑分析中常被作為質控的指標。因此，有必要對黃芩苷的致敏性、作用機制及其致敏的限量進行深入研究，并建立靈敏、高效、穩定的黃芩苷微量檢測方法。

目前常用于黃芩苷檢測的方法皆為理化分析方法，以HPLC法最常用［8-10］。但由于某些致敏原能夠誘發過敏反應往往取決于其特定的化學結構，即“化學決定簇”，并且致敏的濃度亦較低，這就要求對致敏原定性定量檢測的方法要具備很高的特異性和靈敏度。以酶聯免疫吸附法(ELISA)為代表的免疫分析技術具有特異性強、靈敏度高、操作簡便，且特別適用于大批量樣品檢測等優點。要建立ELISA法，首先需要相應的抗體。因此本實驗首先在體外制備了黃芩苷的完全抗原，免疫家兔獲得針對黃芩苷的特異性抗體，旨在建立一種雙黃連注射液中半抗原成分的ELISA定量檢測方法，為進一步研究含有黃芩苷的中藥注射劑中致敏性物質提供依據。

1 材料

1.1 試劑與儀器 黃芩苷(baicalin，BAL，中國食品藥品檢定研究院，批號110715-201016，純度94.0%);黃芩素(baicalein，中國食品藥品檢定研究院，批號111595-200905，純度98.5%);連翹苷(中國食品藥品檢定研究院，批號110821-201112，純度96.8%);綠原酸(中國食品藥品檢定研究院，批號110753-200413，純度100%);黃芩提取物(批號 200907231Y)。牛血清白蛋白(BSA)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、卵清蛋白(OVA)、酪蛋白(Sigma公司);山羊血清、馬血清(北京元亨圣馬生物技術研究所);脫脂奶粉、明膠、四甲基聯苯胺(TMB)(Amresco公司);辣根過氧化酶標記的羊抗兔IgG(IgG/HRP-Ab，北京索萊寶科技有限公司)。

XS105電子天平(Mettler Toledo公司);Spectrum Two紅外光譜儀(PerkinElmer公司);Modulyo冷凍干燥機、Multikan Spectrum酶標儀(Thermo公司);DH4000B電熱恒溫培養箱(天津市泰斯特儀器有限公司)。

1.2 實驗動物 新西蘭白兔，雄性，4～5月齡，體質量為2.0～3.0 kg，由北京市昌揚西山養殖場提供。許可證編號:SCXK(京)2011-0010。動物實驗均按照國際動物實驗的指導原則進行。

2 實驗方法

2.1 黃芩苷完全抗原(BAL-BSA)的合成與體外鑒定 采用NHS活性酯法將BAL與載體蛋白BSA偶聯制備完全抗原，偶聯產物經冷凍干燥后于－20℃保存。分別采用紅外吸收光譜法和MALDITOF-MS 對偶聯物進行鑒定［11］。

2.2 黃芩苷完全抗原(BAL-BSA)的免疫原性鑒定及酶聯免疫檢測方法的建立

2.2.1 抗血清的制備 采用混合免疫法以完全抗原BAL-BSA為免疫原，免疫新西蘭兔3只，免疫程序參照文獻進行［11］。同時設置BAL單獨免疫組，經相同的劑量和程序免疫。用間接ELISA法檢測所分離的抗血清的效價。

2.2.2 抗血清效價的測定及間接ELISA法的建立以BAL為包被抗原，采用間接ELISA法測定抗血清的效價。以待測血清的OD450值大于或等于陰性對照OD450值的2.1倍，且兩者之差大于0.2(即P/N≥2.1且P-N＞0.2)時所對應的血清最大稀釋倍數作為抗體效價。

2.2.2.1 間接ELISA法檢測條件的優化 分別對包被緩沖液、封閉液以及酶標抗體的稀釋度進行優化篩選。按照陽性與陰性血清OD450值之比(P/N值)最大，且陰性血清及空白對照的OD450值較低的原則確定條件。

將包被原BAL、待測血清和陰性血清分別倍比稀釋，在96孔板上進行方陣滴定。選取陽性血清OD450值在1.0左右，陰性血清OD450值0.2左右，且空白對照OD450值小于0.1的反應孔所對應的抗原濃度和血清稀釋度作為最適抗原包被濃度和血清稀釋度。

2.2.2.2 間接ELISA法的特異性和靈敏度 采用兩種方法考察間接ELISA法的特異性:a)將BAL進行倍比稀釋，按照優化后的檢測條件，檢測免疫血清中抗體的水平;b)分別以金銀花提取物、連翹提取物、刺五加提取物、丹參提取物作為包被原，按照優化后的條件檢測。根據AOAC標準［12］，以陰性均值)加3倍標準差(sd，n=20)的和)作為本方法的檢測限，當待測樣品的測定結果＞+3sd時，判為陽性;＜+2sd時，判為陰性。

將未經免疫的陰性血清和免疫后的陽性血清平行進行倍比稀釋，按優化后的條件檢測。以陽性血清與陰性血清OD450值之比(P/N)≥2.1的最大血清稀釋度作為檢測靈敏度。

2.2.3 間接競爭ELISA法檢測抗血清的特異性及其交叉反應性 采用間接競爭ELISA法，分別以黃芩素、連翹苷、綠原酸和黃芩提取物為競爭性抗原，考察兔抗血清的特異性和交叉反應性。間接競爭ELISA法的操作要點為［13］:將效價最高的抗血清稀釋為最佳工作濃度的兩倍，以50μL/孔加至BAL包被的酶標板中。再分別加入等體積倍比稀釋的競爭用抗原溶液，混合均勻。同時以50μL抗血清稀釋液和等體積的樣品稀釋液作為標準，以100μL樣品稀釋液作為空白對照。37℃孵育1 h。其他步驟同非競爭ELISA法。

2.3 雙黃連注射液中半抗原成分的檢測 采用優化后的間接ELISA法對26批雙黃連注射液中的致敏性半抗原成分進行檢測。注射液包被前用10倍濃度的包被液調節pH9.6，同時包被陽性(包被BAL)和陰性對照(包被液)。根據AOAC標準判定，只有當陽性對照呈陽性，陰性對照呈陰性時實驗才成立。

3 實驗結果

3.1 黃芩苷完全抗原(BAL-BSA)的體外鑒定經紅外吸收光譜分析證實BAL與BSA偶聯成功;通過MALDI-TOF-MS估算出偶聯產物中 BAL與BSA的偶聯比約為3∶1，可用于免疫動物制備相應的抗血清［11］。

3.2 間接ELISA方法的建立

3.2.1 間接ELISA法各項實驗條件的優化 考察的幾種常用封閉液中，1%明膠溶液陰性值最低，封閉效果最佳(見圖1);用碳酸鹽緩沖液(CBS，0.05 mol/L，pH 9.6)稀釋包被原BAL，包被效果優于磷酸鹽緩沖液(PBS，0.01 mol/L，pH 7.2)(見圖2);當酶標二抗稀釋度為1∶10000時，P/N最大，且陰性血清及空白對照的OD值相對較低，因此二抗的最佳工作濃度確定為1∶10000(見圖3)。

方陣滴定中固定酶標二抗的工作濃度為1∶10000，篩選包被抗原與抗血清的最佳工作濃度及稀釋倍數，結果見表1。當包被原質量濃度為100μg/mL，抗血清稀釋倍數為1∶500時，陽性孔的OD值為0.978，陰性孔OD值較低，P/N最大，且空白對照孔的OD值小于0.1。因此確定BAL的最適包被質量濃度為100μg/mL，抗血清的最適稀釋倍數為1∶500。

圖1 封閉液的選擇Fig.1 Optimization of the blocking solution

圖2 包被緩沖液的選擇Fig.2 Optimization of the coating solution

圖3 酶標二抗工作濃度的選擇Fig.3 Determination of the optimal dilution of goat anti rabbit IgG/HRP-Ab

表1 方陣滴定實驗中的OD450值(n=3)Tab.1 OD value at 450 nm in square titration(n=3)

3.2.2 間接ELISA法的特異性和靈敏度 方陣滴定結果表明隨著BAL包被質量濃度的減小，血清中抗體的水平也隨之降低。同時陽性血清中的抗體水平明顯高于陰性血清(見圖4)。說明經完全抗原BAL-BSA免疫后的家兔產生了針對BAL的特異性抗體，這也證實了完全抗原BAL-BSA偶聯成功。分別以黃芩提取物、金銀花提取物、連翹提取物、刺五加提取物和丹參提取物包被，除黃芩提取物外，其他提取物ELISA結果均為陰性，表明所建立的間接ELISA法檢測抗BAL抗體具有良好的特異性。

圖4 間接ELISA法檢測抗體的靈敏度Fig.4 Sensitivity of detecting antibody in rabbit serum with ELISA

對比倍比稀釋的陽性和陰性血清的檢測結果，顯示當血清稀釋度達到1∶8000時，P/N值仍大于2.1，說明該方法的靈敏度為1∶8000(見圖4)。

3.2.3 間接ELISA法的操作程序 以CBS(pH 9.6，0.05 mol/L)為包被液，將BAL稀釋至100μg/mL，100μL/孔，4℃包被過夜;用PBST洗滌后，加入1%明膠溶液37℃封閉2 h;洗滌，用PBST將待測抗血清按1∶500稀釋，100μL/孔，同時設置陰性對照和空白對照。37℃溫育1 h;洗滌，將酶標二抗(IgG/HRP-Ab)按1∶10000稀釋，100μL/孔，37℃孵育1 h;洗滌，加入TMB底物緩沖液，100μL/孔，37℃顯色15 min;每孔加入50μL 2 mol/L H2SO4溶液終止反應;用酶標儀記錄450 nm波長處的OD值。

3.2.4 抗血清效價的測定及黃芩苷完全抗原(BAL-BSA)的免疫原性鑒定 采用上述ELISA反應條件，對完全抗原BAL-BSA免疫后的兔抗血清進行效價測定。以免疫前血清為陰性對照，每個樣品平行設定三個復孔。測定結果見表2。結果顯示采用所構建的完全抗原BAL-BSA免疫的3只家兔均產生了針對BAL的多抗，這也證實了BAL-BSA不但具有反應原性，同時具備免疫原性，說明完全抗原BAL-BSA合成成功。由于動物個體差異，3份抗血清效價各不相同，其中以1號家兔抗血清的效價最高，達到1∶8000。同時采用BAL單獨免疫家兔，在相同的免疫條件下，所獲得的抗體效價僅為1∶500，免疫原性很低。

表2 不同兔抗血清間接ELISA測定結果(OD450)(n=3)Tab.2 OD value at 450 nm by indirect ELISA with different rabbit antisera(n=3)

3.2.5 抗血清的特異性檢測 間接競爭ELISA法的結果表明連翹苷和綠原酸與抗血清無交叉反應，它們對BAL與抗血清的結合均無競爭抑制作用。圖5為黃芩素(圖5-A)和黃芩提取物(圖5-B)與抗血清的交叉反應結果。由圖5可知，OD450值隨著競爭質量濃度的增加而減小，提示兔抗血清具有BAL特異性。以競爭質量濃度的對數為橫坐標，以B/B0(競爭抗原孔吸收值/標準孔吸收值)為縱坐標，繪制競爭標準曲線。根據回歸方程計算出黃芩素和黃芩提取物的抑制中質量濃度IC50分別為634.2μg/mL、5.85 mg/mL。

圖5 競爭ELISA法檢測抗血清的特異性Fig.5 Antiserum specificity detected by competitive ELISA

3.3 雙黃連注射液中半抗原成分的檢測 對26批雙黃連注射液采用間接非競爭ELISA法進行檢測。根據方陣滴定的結果擬合間接ELISA法標準曲線，由此計算陽性樣品中可能的致敏性成分量。固定抗血清的稀釋倍數為1∶500，以OD450值對抗原包被質量濃度(μg/mL)進行線性回歸，得標準曲線為y=219.48x－117.21(r2=0.9910)，抗原濃度與OD值呈現良好的線性關系，線性范圍為2.5～100μg/mL;方法的檢出限(+3sd)為0.43μg/mL，定量限+10sd)為 2.52μg/mL。

間接ELISA法結果顯示，26批雙黃連注射液樣品中來源于兩個廠家的3批樣品(S8、S19、S25)檢出微量抗原性成分，其含有量在3.5～4.4μg/mL之間，其余批次樣品測定結果均為陰性。同時對比26批樣品中黃芩苷的HPLC法測定結果，發現26批樣品中S25黃芩苷的量最高(7.2 mg/mL)，并且同批次樣品在臨床上出現過嚴重的ADR。

4 討論

雙黃連注射液作為第一批接受再評價的中藥注射劑品種之一，過敏性休克和過敏樣反應是其導致患者死亡的主要原因。作為一種多味藥材的復方制劑，其所含的植物蛋白、多糖等大分子物質具有完全抗原性;其中的一些小分子化合物(如綠原酸、黃芩苷)可作為半抗原與體內蛋白質結合形成完全抗原，使機體致敏［7，14］。這種藥品本身成分的復雜性以及引起過敏反應的多因素性，導致雙黃連注射液引起的過敏反應具有很大的不可預知性和不確定性?，F有的研究尚不能明確雙黃連注射液的多種成分中，何種成分是主要的致敏原。

本研究進一步明確了雙黃連注射液的半抗原成分——黃芩苷(BAL)的致敏性。采用NHS活性酯法在體外構建了BAL與BSA的完全抗原BALBSA，經動物免疫實驗證實:BAL一般不易使機體致敏，其在與蛋白質等大分子載體結合成為完全抗原后兼具有良好的反應原性和免疫原性，可誘導機體產生高效價、高特異性的抗體。在優化了各項實驗條件的基礎上，建立了用于檢測BAL的間接ELISA法。采用該方法檢測發現雙黃連注射液中BAL的量、ELISA法檢測結果與臨床ADR之間存在一定的相關性。這與文獻報道雙黃連注射劑的過敏反應與組分BAL有直接關系一致［6］。同時對比分析間接ELISA法和HPLC法的測定結果，發現兩種方法的結果存在差異。26批注射液樣品中均含有BAL(＞6.0 mg/mL)，而間接ELISA法僅檢出3批樣品呈陽性，說明間接ELISA法檢出的抗原性成分并非BAL分子本身，提示雙黃連注射液致敏的主要抗原決定簇與BAL的結構有關，所建立的間接ELISA法可用于檢測注射液中潛在的與BAL結構相關的微量抗原性成分。實驗中制備的抗BAL抗體，為BAL免疫試劑盒的開發提供了技術基礎，也為后續深入研究BAL的免疫檢測及快速檢測技術奠定了基礎;另一方面，所建立的ELISA法具有一定的通用性，可為進一步研究雙黃連注射液或其他組成中含有黃芩或黃芩苷的中藥注射劑(如清開靈注射液、茵梔黃注射液、痰熱清注射液、舒肝寧注射液、銀黃注射液等)中的致敏性物質提供依據。

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